大鼠皮肤角质层对青藤碱脂质体贴剂透皮吸收的影响

大鼠皮肤角质层对青藤碱脂质体贴剂透皮吸收的影响 大鼠皮肤角质层对青藤碱脂质体贴剂透皮 吸收的影响 ? 1322?中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月 制剂与质量 大鼠皮肤角质层对青藤碱脂质体贴剂透皮吸收的影响 张英丰,汪小根,周莉玲 (广州中医药大学,广东广州510405) 摘要:目的考察大鼠皮肤角质层对青藤碱脂质体贴剂透皮吸收的影响.方法采用Franz扩散池法分别考察 正常腹部,背部皮肤及经采用胶带剥离法制备的去角质层腹部,背部皮肤的透皮吸收特性,以预设的采样间隔采 样,HPLC法检测,以单位面积累积透皮量对时间拟合,透皮速率常数(t,)作为判断的.结果除去角质层的腹 部及背部皮肤比相应部位的正常皮肤t,有明显增加,且皮肤中药物释放速率常数也大于相应部位的正常皮肤.结 论皮肤角质层对青藤碱脂质体贴剂透皮特性有显着影响,在制备动物皮肤时应注意皮肤的完整性. 关键词:青藤碱脂质体贴剂;胶带剥离;角质层;透皮吸收 中图分类号:R283.62;R286.02文献标识码:A文章编号:0253—2670(2006)09—1322—03 Impactofratskinstratumcorneumontransdermalabsorption characteristicOfSinomenineLiposomePatch ZHANGYing—feng,WANGXiao—gen,ZHOULi—ling (GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510405,China) Abstract:ObjectiveTostudytheeffectofskinstratumcorneumontransdermalabsorption characteristicofSinomenineLiposomePatch.MethodsThenormalandstrippedstratumcor neumskinof backandabdomenwasusedtostudythetransdermalabsorptioncharacteristicbyFranzmethod.The transdermalabsorptionsamplewastakenatthepresetsamplingtimepoint.Thesamplecontentwas determinedbyHPLC.Thecumulativetransdermalamountofperunitareawasfittedwithsamplingtime point,thetransdermalrateconstant(Jvalue)wasselectedascomparativestandard.ResultsThe transdermalrateconstant()ofskinwithstratumcorneumstrippedincreasedobviouslythanthatofthe normalskin,SOwasthereleasedrateconstant.ConclusionTheskinstratumcorneumhasannotable impactontransdermalabsorptioncharacteristicofSinomenineLiposomePatch.Whentheskinof experimentalanimalbeingprepared,theintegralityshouldbepaidmoreattention. Keywords:SinomenineLiposomePatch;tapestripping;stratumcorneum(SC);transdermal absorption 皮肤角质层是药物透皮扩散的主要屏障已经成 为共识,角质层的厚度0.8,1.2mm,角质层细胞 填充主要是类脂形成的液晶结构,这种致密"砖泥结 构",既作为机体的一种防御屏障,也是药物扩散的 主要屏障.本实验采用Franz扩散池法从定量研究 青藤碱透皮吸收的角度考察角质层对药物透皮吸 收,皮肤药物储库的影响,为透皮试验时动物皮肤的 制备,体外试验相关影响因素的控制提供借鉴. 1仪器与试药 日本岛津LC一1OATHPLC,SPD--10A可变 波长紫外检测器,N2000双通道色谱工作站;TK一 12A型透皮扩散试验仪(上海锴凯科技贸易有限公 司,接收室容积7mI,有效透皮面积2.92cm;十万 分之一电子天平(Sartorius公司);LD5—2A型 高速离心机(JL京医用离心机制造厂). 青藤碱对照品购于中国药品生物制品检定所 (批号0774—200105);色谱纯甲醇,水为超纯水,其 他试剂为分析纯. 2方法与结果 2.1青藤碱的HPIC法测定 2.1.1色谱条件:色谱柱:大连依利特Hypersil BDS柱(250mmx4.6mm,5m);流动相为甲醇一 水(50:50,加入的0.2乙二胺作为改性剂);体积 流量为1mL/min;检测波长为265nm;柱温为室温. 收稿日期:2005—1I-06 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30371783);广州市科技局资助项目(2002Z3一E5011) 作者简介:张英丰(1977一),男,广州中医药大学2003级博士研究生,研究方向为生 物药剂学与药动学. E—mail;fredzhangfeng@163.com 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月 2.1.2标准曲线的制备:精密称取P.0干燥至恒重 的青藤碱对照品7.50mg,置于25mL量瓶中,甲醇 定容,振摇即得0.30mg/mL对照品贮备液.分别吸 取0.5,2,4,6,8,10,12,14L注入高效液相色谱仪. 以峰面积对进样量进行线性回归,得回归方程y一467 978X+17633,r一0.9997,进样量在0.15,4.2g 与峰面积呈良好的线性关系.再取1mL置于25mL 量瓶中,甲醇定容,分别吸取0.5,1,2,4,6,8,10,12 L注入高效液相色谱仪,以峰面积对进样量进行线性 回归,得回归方程Y一480622X+492.37(r一 0.9991),进样量在0.006,0.1444g与峰面积呈 良好的线性关系. 2.1.3精密度试验:高,低质量浓度对照品液在1d 内连续进样5次,每次进样10L,并分别在连续5 d每天进样1次,每次进样1OL,考察日内RSD和 日间RSD,结果分别为0.53,1.089/5,2.08, 2.98. 2.1.4稳定性试验:取供试品溶液分别于0,2,4, 8,24h进样测定,结果青藤碱峰面积的RSD为 2.52,表明供试品溶液在24h内比较稳定. 2.1.5阴性干扰试验:按透皮试验方法将空白脂质 体贴剂贴于皮肤表面,接收室加入7mLpH6.8的 PBS液(实测pH6.73),在24h时用微量进样器取 出100L接收液进样分析,结果表明在青藤碱出峰 位置无干扰峰,分析条件可行. 取空白大鼠皮肤按2.6项下的皮肤处理方法处 理,进样10L,结果表明皮肤内源性成分对青藤碱 无明显干扰,皮肤处理条件可行. 2.2离体皮肤及去角质层皮肤的制备:取雌性体重 180,200gSD大鼠,用BaS在腹部及背部脱毛,并 饲养1周以待BaS对皮肤造成的损伤完全恢复.脱 颈处死后分别取下腹部及背部皮肤,仔细剥离皮下 脂肪组织,并用生理盐水反复冲洗,直至无浑浊为 止,将制备好的一半皮肤用压敏胶带均匀用力地,平 行操作地剥离角质层各25次,得去角质层背部及腹 部皮肤J. 2.3接收液的处理:接收液为7mL经过10rain超 声脱气并放冷至室温的pH6.8的PBS液(实测pH 6.73). 2.4皮肤的预处理:皮肤自然解冻后固定于Franz 扩散池,角质层向上,在达到预定温度后平衡1h. 2.5透皮吸收试验:考察温度设定32?.采用 TK一12A型透皮扩散试验仪,将上述4种皮肤同时 固定在Franz扩散池内C23,皮肤上表面与剥离保护 层的青藤碱脂质体贴剂紧密接触,真皮层与接收液 接触.在接收室中注入接收液7mL并小心将气泡 完全驱逐出.磁力搅拌转速为(200士lO)r/min,分 别在0.5,1,2,4,6,8,10,12,14,22,24h用注射器 吸取1mL接收液,并随即补充相同体积,相同温 度,相同组成的接收液.样品经0.44m水系微孔 滤膜滤过后按上述色谱条件进样10L,测定青藤 碱的质量浓度.实验重复3次. 2.6皮肤储库效应的考察:在经皮渗透结束后立即 剥离脂质体贴剂,取出全部接收液换以新鲜的7mL 接收液,用恒温32?的生理盐水液冲洗皮肤表面 后,将皮肤继续固定在Franz扩散池内,并在2,4, 6,8,10,24h取样2mL置于10mL具塞玻璃离心 管内,加入5mL碱性氯仿,涡旋混匀器混匀1rain 后3000r/rain离心5min,用干燥的刻度吸管精密 吸取4mL萃取液,50?N.吹干,100L甲醇涡旋 1min溶解残渣后转移到0.5mL的EP管中, 10000r/rain离心5min后进样10L分析.在皮 肤释放结束后立即将皮肤剪碎置玻璃匀浆器内,碱 性氯仿(1mL×3)匀浆,3000r/rain离心5rain后 将氯仿50?N.吹干,100L甲醇涡旋1min溶解 残渣后转移到0.5mL的EP管中,10000r/rain离 心5rain后进样10L分析.实验重复3次. 2.7结果处理:采用SPSS11.0数据处理软件处理 数据.按以下公式计算单位面积累积渗透量. 一 l C×7+三C×1C×7+三C×2 Q=———一Q(一————_『三l_—一+Q匀装 式中,Q:单位面积累积渗透量(btg/cm.);C:第个取样点 测得的药物质量浓度(t~g/mL);e:第i(—n--1)个取样点 测得的药物质量浓度(/~g/mL);A:有效透皮面积(2.92cm.) 以Q的平均值对时间t分别按零级,Higuchi方 程嘲进行拟合,所得方程的斜率即为透皮速率常数 (),同时以EF—去角质层皮肤正常皮肤评价角质层对 药物经皮渗透的影响.结果见表1. 以单位面积累积释放量Qr的平均值对时间t 分别按零级,Higuchi方程进行拟合,所得方程的斜 率即为皮肤储库释放速率常数(R),R一R去角质层皮肤/ R正常皮肤评价剥离角质层对药物经皮释放的影响.累 积释放量与皮肤残留药量之和即为皮肤储库总药 量.结果见表2. 皮肤储库的总药量计算为:Q(r)一Q释放+Q匀浆, 结果见表3. ? 1324?中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第9期2006年9月 表1脂质体贴剂透皮吸收特性拟合方程(,l=3) Table1FittingequationsontransdermalabsorptioncharacteristicofSinomenineLiposome Patch(,l一3) 当以零级拟合时,L,的单位是~g/(cm.?h)}当以Higuchi拟合时,L,的单位是 ~g/(cm.?hl/2),表2同 WhenfittinginzeroorderunitofJis~g/(cmz?h):WhenfittinginHiguchiunitofJistlg/(cm.?hl /Z),Table2issame 表2脂质体贴剂皮肤释放特性拟合方程(,l一3) Table2FittingequationsonskinreleasingcharacteristicsofSinomenineLiposomePatch(,l= 3) 表3脂质体贴剂皮肤储库效应 Table3SkinstoringeffectofSinomenine LiposomePatch 可以看出,皮肤储库总的药量顺序为: Q去角质层背皮>Q去角质层腹皮>Q背皮>Q腹皮. 从不同拟合方程所得到的EF值来看,除去角 质层的皮肤的透皮速率常数要明显高于正常皮肤, 且同一皮肤不同方程拟合得到的比值接近,腹部皮 肤与背部皮肤之间的EF值差异不大,表明角质层 对腹部及背部皮肤有相同或相近的影响. 从皮肤释放特性来看,根据R值,表明去角质 层的皮肤释放速率常数要快于正常皮肤.皮肤储库 储存的总药物量:Q去角质层背皮>Q去角质层腹皮>Q背皮> Q腹皮. 3讨论 在药物渗透时根据扩散室与接收室的浓度差扩 散,—DK?C[4](D为扩散系数,K为分配系数, ?C为扩散室与接收室的浓度差,h为角质层厚 度),由上式看出与浓度差成正比.当药物扩散结 束后,残留在皮肤中的药物储库做为扩散的原动力, 替代了原?C起的作用.药物在储库的推动下被动 扩散进接收室内.因除去了角质层,故药物相比于完 整皮肤渗透明显增多,而皮肤储库释放速率亦明显 快过完整皮肤. 从药物透皮吸收行为看,根据—DKAC/h可 知与皮肤厚度h成反比,因大鼠背部皮肤比腹部 皮肤厚,相比于腹部皮肤小,去角质层的背部皮肤 也小于去角质层腹部皮肤. 从皮肤释放药物行为看,去角质层皮肤因除去 角质层这个主要渗透屏障,吸收速率快于完整皮肤, 沉积于皮肤内部的量(即形成药物储库)相应也大于 完整皮肤,故在以药物储库做为扩散原动力的情况 下去角质层皮肤的释放速率快于完整皮肤.因背皮 厚于腹皮,相应皮肤中沉积的药物量也高于腹皮,故 从结果可以看到背部皮肤的释放快于腹部皮肤,去 角质层背部皮肤释放快于去角质层腹部皮肤. References: [1]JakasaI,CalkoenF,KezicS.Determinationofpolyethylene glycolsofdifferentmolecularweightinthestratumcorneum [J].JChromatogrB,2004,811(2):177—182. [2]FernandaSDR,RenataFVL.Invitroskinpermeationand retentionof5一aminolevulinicacidesterderivativesfor photodynamictherapy[J].JControlledRelease,2003,89 (2):261—269. [3]DaraF,Johnc.Releasecharacteristicsofanionicdrug compoundsfromliquidcrystallinegelsI:Passiverelease acrossnon—rate—limitingmembranes[J].IntJPharm,2005, 3O1(1,2):226—236. [4]TirnaksizF,Yucez.Developmentoftransdermalsystem containingnicotinebyusingsustainedreleasedosagedesign rI].Farmaco,2005,60(9):763—77O.