液相色谱溶剂系统与优化-天施康内部培训

液相色谱溶剂系统的选择和优化 液相色谱法中的高些液相色谱和薄层色谱，溶剂系统常是分离的成败的关键！因此溶剂系统选择及优化非常重要。 本次学习的重点：如何根据样品的性质与要求，按照分子间作用力的关系，正确的选择溶剂并组成溶剂系统进行优化，选出最佳溶剂系统，获得事半功倍的效果。 参考《液相色谱溶剂系统的选择与优化》（孙毓庆），已上传到群共享。 第一小节：液相色谱基本概念 第二小节：液相色谱溶剂系统 第三小节：溶剂的基本性质及其对色谱的影响 第四小节：薄层色谱法及溶剂系统 第五小节：高效液相色谱法及溶剂系统 第六小节：梯度洗脱，工作中遇到的实例和讨论 黄文统            QQ403318043         2013-03-29         第一小节 液相色谱基本概念 一、液相色谱的概念和分类（2012年秋学习内容） 利用组分在固定相和流动相间的分配系数差异，而分离、分析的称为色谱法（或称层析法），是一种物理或物理化学的分离方法。以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法（liquid chromatography ,LC）。 分离原理：差速迁移 色谱分类：吸附色谱、分配色谱、化学键合相色谱、空间排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱，等等（请简述原理或应用举例）。 二、基本概念和基本理论 1、相平衡参数 分配系数：物质在两相中达到分配平衡后，样品组分在固定相中的浓度与在流动相中的浓度之比。 容量因子：达到分配平衡后，组分在固定相中的质量与在流动相中的质量之比。 2、保留参数 保留时间，保留体积，比移值 3、柱效参数 区域参数——正态分布曲线中的偏差（σ），半峰宽和峰宽——组分流出色谱柱过程物质的分散程度。 理论塔板数与理论塔板高度（塔板理论） 4、分离参数 分离度：R=1.5可以实现完全分离（99.7%）。 分离数（SN，又叫峰容量）：相邻峰的分离度R=1.177（98.1%分离）时，可容纳的峰（斑点）数量。SN越大，分离效果越佳。 5、分离方程 a      b      c 其中，n为色谱柱的理论塔板数；α为相对保留值或分配系数比（K2/K1）；k2为相邻两组分中保留时间长的组分的容量因子。 a项取决于柱效，柱效高（n大），a项大。b与c项相关联，而且都与色谱柱及流动相的性质有关，但b主要取决于流动相的种类（极性），在流动相的种类）（包括元数）选定后，调整流动相的配比，可改变洗脱能力，进而改变c项。 选择实验条件，首要任务是使α≠1，即b≠0。只有在α≠1的前提下，增加柱效n，适当增加k2，才能增加分离度R。 6、速率理论及范第姆特方程（略） 7、超高压液相色谱（UPLC）：采用1.7μm粒径的填料，内径1.0cm及2.1cm，柱长5~10cm，柱效为一般高效液相色谱柱的3倍以上。参见2010版中国药典一部丹参滴丸项下的指纹图谱。 第二小节 液相色谱溶剂系统 正确选择溶剂组成溶剂系统及合适的配比，需要熟悉各色谱法的分离机制和溶剂的分类。 一、液-固吸附色谱 流动相为液体，固定相是固体吸附剂的色谱法，称为液-固吸附色谱。 常用吸附剂硅胶、氧化铝。如工作中最常用到的硅胶（薄层）色谱、氧化铝柱等。 注意：少数以硅胶薄层色谱方法并非吸附色谱！请举例 1、分离机制：被分离的组分（溶质分子）与流动相争夺吸附剂表面的活性中心，靠溶质分子吸的吸附系数的差别而分离。 其中，S是色谱柱中吸附剂的表面积；Vm是流动相在色谱柱中占有的体积；K是吸附平衡常数。因为容量因子k=KS/Vm,所以 在吸附色谱法中，选择实验条件务使组分间的容量因子k产生差别，以达到分离的目的。 请问：硅胶吸附色谱表面的活性中心是什么？ 2、固定相（硅胶）与溶质的亲和力 硅胶与溶质分子的亲和力顺序（容量因子顺序）：饱和烃＜芳烃＜有机卤化物＜硫醚＜醚＜硝基化合物＜酯≈醛≈酮≈醇≈胺＜砜＜亚砜＜酰胺＜羧酸。与硅胶亲和力大的溶质，容量因子k大，保留时间长，晚出柱（薄层色谱中Rf值小）。 3、流动相的洗脱能力 液-固色谱法流动相的洗脱能力与溶剂强度参数和介电常数等有关，选择性主要取决于溶剂的分子间的类型（溶剂分类的组别）。 常用Snyder溶剂强度参数 （单位吸附剂表面的吸附能）来定量地描述流动相的洗脱能力。定义式如下： 式中，E为吸附能；A为吸附剂的表面积。溶剂强度参数 值是溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能。 值越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，即溶剂的洗脱能力越强，则溶质的k值越小。 溶剂 溶剂强度   溶剂 溶剂强度 己烷 0.00 乙酸乙酯 0.38 异辛烷 0.01 二噁烷 0.49 四氯化碳 0.11 乙腈 0.50 四氯丙烷 0.22 异丙醇 0.63 氯仿 0.26 甲醇 0.73 二氯甲烷 0.32 水 20.73 四氢呋喃 0.35 乙酸 20.73 乙醚 0.38               上表列出了以硅胶为吸附剂时的一些纯溶剂的 值。当某溶质在某硅胶柱（或硅胶薄层板）上进行分离时，如果选用的初始溶剂太强使得样品组分的k值过小，那么就要从表中选择 值较小的溶剂来代替；反之，如果初选溶剂的 值太小而使样品组分的k值过大，则应选用 较大的溶剂。这样，通过尝试就可以找到强度合适的溶剂为流动相。 二元流动相：①两种纯溶剂适当配比浓度可以产生适当的洗脱强度（以容量因子1＜k＜10，k=3~5为最佳）；②寻找等洗脱强度不同溶剂组成的二元溶剂系统，以提高选择性，因组成不同，分配系数比α不同，选择性不同。 4、流动相的选择性 选择性（分配系数比α）不仅决定于 ，而且还受诸如试样分子与溶剂分子间的氢键作用等二次效应的影响。预测α值随着溶剂成分变化时的经验规律 ①强溶剂很大或者很小时都会得到最大的α值； ②含醇的溶剂系统常常会得到与其他溶剂系统不同的α值，因为样品和溶剂间的氢键作用会使α有很大的变化！ ③含有强碱性或非碱性强溶剂组分的溶剂系统可得到最大的α值。 二、液-液分配正相色谱和正相键合相色谱 主要用于分离极性、中等极性和弱极性分子。 1、液-液分配正相色谱色谱：采用含少量水（含水量17%）的失活硅胶做固定相。流动相选择规律与吸附色谱完全（？）一致。 2、正相键合相色谱：如氰基键合相、氨基键合相。 选择分离条件时，务使样品的各组分在固定相与流动相中的溶解度产生差别，即使K或k产生差别，才能分离。 正相色谱法溶剂系统的洗脱能力用溶剂的极性参数（P'）值表示。 溶剂 P' 组别   溶剂 P' 组别 正己烷 0.01 —   氯仿 4.1 Ⅷ 异丙醚 2.4 Ⅰ 乙酸乙酯 4.4 Ⅵ 乙醚 2.8 Ⅰ 甲醇 5.1 Ⅱ 二氯甲烷 3.1 Ⅴ 丙酮 5.1 Ⅵ 正丙醇 4.0 Ⅱ 乙腈 5.8 Ⅵ 四氢呋喃 4.0 Ⅲ 乙酸 6.0 Ⅳ       水 10.2 Ⅷ               P'值大，极性大，洗脱能力大。 多元溶剂系统：洗脱能力也用极性参数P'表示（极性参数具有加和性）；选择性则由构成流动相的各纯溶剂的性质（类别）左右。 Snyder溶剂分类：根据溶质与溶剂分子间作用力不同将常用溶剂分为8组。Ⅰ与Ⅱ组溶剂为质子受体溶剂；Ⅴ组溶剂为偶极作用力溶剂；Ⅷ为质子给予体溶剂，其他组的溶剂的性质介于其间，作用力类型不典型。不同组别的溶剂虽然洗脱能力可能相同，但选择性不同。例如甲醇和丙酮的P'都是5.1，极性相同，但组别不同，选择性不同。用甲醇分别不开的物质对，改用丙酮后，有可能分开，反之亦然。 三、反相（键合相）色谱法的分离机制与流动相 1、分离机制：疏溶剂理论。 2、流动相 反相色谱法的流动相的极性大于固定相，通常是用甲醇、乙腈或四氢呋喃等极性溶剂与底剂水组成二元或多元流动相。 溶剂强度因数（S）：流动相的洗脱能力用溶剂强度因数（S）衡量。 溶剂 S值 组别   溶剂 S值 组别 水 0 Ⅷ 二噁烷 3.5 Ⅵ 甲醇 3.0 Ⅱ 乙醇 3.6 Ⅱ 乙腈 3.2 Ⅵ 异丙醇 4.2 Ⅱ 丙酮 5.1 Ⅵ 四氢呋喃 4.5 Ⅲ               多元流动相的强度因数Sab值计算公式： 式中，Sa与Sb分别为纯溶剂a与b的溶剂强度因数；φa和φb分别为纯溶剂a与b的体积分数。该公式可以计算多元溶剂系统的强度因数，而且可以计算等洗脱强度的替代溶剂组成。 3、反相流动相的选择 （1）二元流动相：一般以洗脱力最弱的水（Ⅷ组）做为基础溶剂（底剂），再加入一定量的可与水互溶的有机极性调节剂构成，常用的首选极性调节剂为甲醇（Ⅱ组）与乙腈（Ⅵ组）。按洗脱能力的要求（重点组分的k=2~5）。组成最常用的甲醇-水或乙腈-水洗脱剂。 （2）多元流动相组成：若二元流动相不能满足需要，可配置多元流动相。多元流动相的构成参考原则： ①在二元流动相中加入少量的四氢呋喃（Ⅲ组），常能改善某些难分离的物质对的分离度； ②若某些色谱峰拖尾，可加减尾剂。一般常用的减尾剂为有机碱类，如三乙胺等。其减尾的作用，主要是有机碱与硅胶的酸性硅羟基作用，降低了硅羟基的吸附作用。 ③用水、甲醇、乙腈、四氢呋喃，按四面体法组成三元或四元溶剂系统，并进行优化，选出最佳溶剂系统。 ④分离弱有机酸或弱有机碱，可用离子抑制色谱法。 示例：确定等洗脱剂的替代溶剂系统 用OSD柱分离苯、萘、联苯、蒽及芘等芳烃类混合物，可用甲醇-水（80:20）为流动相，分离效果较好。欲改为等洗脱能力的乙腈-水为流动相，请问该溶剂系统的配比应是多少？ 甲醇-水（80:20）的S=3.0×0.80+0.0×0.20=2.4 等洗脱能力的乙腈-水的S，也应该是2.4，因此，2.4=3.4×φ乙腈。则φ乙腈=0.718，得等洗脱能力的替代溶剂系统为乙腈-水（71.8:28.2）。 离子抑制色谱法：在反相色谱法中，通过调节流动相的pH，抑制样品组分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的，这种技术称为离子抑制色谱法（ion suppression chromatography, ISC）。 需要注意的是，色谱柱有pH适用范围。pH＞8可能使载体硅胶溶解；pH＜2可能使键合相的键合基团脱落。 第三小节：溶剂的基本性质及其对色谱的影响 1、紫外截止波长 高效液相色谱仪应用最多的器是紫外检测器，用于检测有紫外吸收的样品（具有π-π或p-π共轭结构的化合物）。使用紫外检测器的时应考虑截止波长。 紫外截止波长的定义：“到达检测器时的透射光强被削弱到10%的入射光强（以空气为参照，吸光度A=1）时，对应的波长就称为紫外截止波长”。 溶 剂 截止波长范围/nm 乙腈 ＜190 水 ＜190 正己烷、环己烷 190~205 脂肪醇（甲醇、异丙醇） 205~220 脂肪醚（二乙醚等） 210~220 氯代烷烃（二氯甲烷、氯仿） 220~270 乙酸酯（乙酸乙酯） 225~245 苯、烷基取代苯（甲苯、二甲苯） 270~290 脂肪酮（丙酮） 320~340 四氢呋喃