两株海洋放线菌活性成分研究（可编辑）

两株海洋放线菌活性成分研究（可编辑） 两株海洋放线菌活性成分研究 暨南大学硕士学位论文 摘要 摘 要 本论文对两株初筛分别具有互动抗真菌活性和 HCT-116 细胞毒活性的海洋 放线菌 No. Ms252、No. 172221的发酵液进行活性成分的跟踪分离和结构鉴定。 利用硅胶柱开放柱色谱、ODS 开放柱色谱、制备型 HPLC 等多种色谱方法,从 活性流分中分离得到 15个化合物,通过现代波谱学手段 MS、1D及 2D-NMR 鉴定了它们的结构,分别为:3,3-二3' -吲哚基-1,2 丙二醇(化合物 1)、星孢菌 素苷(化合物 2)、 5-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚基-2-呋喃甲醇(化合物 3)、1-[5-甲 氧基甲基-2-呋喃基]-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚基-3-羧酸(化合物 4)、麦角甾 -3β,5α,6β-三醇(化合物 5)、麦角甾-3β,5α,6β-三醇- β-D-葡萄糖苷(化合物 6)、 β- 胡萝卜苷(化合物 7)、环脯-亮二肽(化合物 8)、环脯-缬二肽(化合物 9)、 脯氨酸(化合物 10)、软脂酸(化合物 11)、N-苯甲基氨基甲酸(化合物 12)、 1,3-丙二醇苯乙酸酯(化合物 13)、大豆素(化合物 14)、腺嘌呤核苷(化合物 15)。其中,化合物 1~4 为吲哚类生物碱,化合物 5~7 为甾体类化合物,化合 物 8~9 为放线菌常见的代谢产物环二肽类化合物。化合物 1、3~4 和 6 为首 次从放 线菌中分离得到,化合物 12~13为新天然产物。通过合作单位对所分离的单 体化 合物进行活性,发现化合物 1~4现出一定抗真菌活性,但无互动活性; 化 合物 5~11对 HCT-116 细胞毒活性较弱。 关键词海洋放线菌 互动抗真菌活性 HCT-116 细胞毒活性 吲哚生物碱 环 二肽 I 暨南大学硕士学位论文ABSTRACT Abstract This thesis has studied on the bioactive-guided isolation and structural determination of active constituents in fermentation broth from two strains of marine actinomycetes No. Ms252 and No. 172221 that respectively showed antifungal effect and synergistic antifungal effect and cytotoxic activity for HCT-116 in early screeningFifteen compounds were isolated from the active fractions by silica gel column, ODS open column chromatography, preparative HPLC and other chromatographic techniques. Their structures were identified as 3,3-bis3'-indolyl-1,2-propanediol 1, staurosporine aglycon 2, 5-9H-pyrido[3,4-b]indol-1-yl-2-furanmethanol 3, 1-[5-methoxymethyl-2-furanyl]-9H-pyrido[3,4-b]inddole-3-carboxylic acid 4, methylcholestane-3 β,5α,6β-triol 5, ergostane- β-D-glucopyranoside 6, ?daucosterol 7, cyclo Pro-Leu 8, cyclo-Pro-Val 9, proline 10, palmitic acid 11, N-phenylmethyl-carbamic acid12, 1,3- propanediyl benzeneacetic acid ester 13, daidzein 14 and adenosine 15 by modern spectroscopic methods MS, 1D and 2D-NMR. Among them, compounds 1~4 are indole alkaloids, compounds 5~7 are steroids, compounds 8~9 are cyclic dipeptides usually seen in the microorganism metabolites, whereas 1, 3~4 and 6 was isolated from actinomycete for the first timeCompounds 12~13 are new natural products. Then these compounds were evaluated on the activity through co-operations. We found that compounds 1~4 showed some extent antifungal activity but no synergistic effect, compounds 5~15 showed weak cytotoxic activity for HCT-116 Key words: marine actinomycete; synergistic antifungal effect; cytotoxic activity, indole alkaloids; cyclo dipeptides II 暨南大学硕士学位论文 缩略语说明 缩略语说明 NMR Nuclear Magnetic Resonance 核磁共振 1 1 1 1 H- H COSYH- H Correlation Spectroscopy 1 1 H- H同核位移相关谱 DEPT Distortionlesss Enhancement by Polarization Transfer 不失真 地极化转移增强谱 HSQC Heteronuclear Single-quantum Correlation 异核单量子相干谱 HMBC Heteronuclear Multiple-bond Correlation 异核多键相关谱 ESI-MS Electrospray Ionization-Mass Spectrum 电喷雾电离质谱法 HR-ESI-MS High Resolution - Electrospray Ionization-Mass Spectrum 高分辨电喷雾电离质谱 UVUltraviolet Spectra 紫外 HPLC High performance liquid chromatography 高效液相色谱 TLC Thin Layer Chromatography 薄层色谱 DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜 III 暨南大学硕士学位论文 目录 目录 摘要.? Abstract ……………………………………………………………… …………………………..? 缩略语说 明 ………………………………………………………………………………………? 目 录………………………………………………………………………………………………..? 第一章 前言..5 第二章 两株海洋放线菌发酵液活性成分研究11 2.1 菌株No. Ms252 发酵液活性成分研究11 2.2 菌株No. 172221 发酵液活性成分研 究 …………………………………………………….17 2.3 从活性部位分离得到化合物的名称、编号和结 构……………………………………… …17 2.4 化合物的结构鉴定20 第三章 实验部分38 3.1 实验仪器与材料..38 3.1.1 实验用仪器39 3.1.2 实验用材料40 3.1.3 放线菌材料40 3.2 结构鉴定数据41 第四章 小结与讨论45 参考文献..48 致 谢..51 附 图 ……………………………………………………………………………………………52IV 暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 第一章 前言 放线菌是一类重要的药源微生物,由于拥有独特的合成多种结构复杂的次生代谢产物 [1] 的巨大潜力而引起了人们的广泛关注 。从放线菌中发现的生物活性物质大约有12000种, [2] 占整个天然生物活性物质的50%左右,其中从链霉菌一个属就发现近万种 。目前分离得 到的绝大多数放线菌都来源于土壤,陆生放线菌产生的抗生素占天然来源抗生素的三分之 二以上。然而,随着病原微生物对抗生素抗药性的日益提高,寻找具有新型作用机制的抗 生素已迫在眉睫。近20年来,从陆生放线菌中分离得到的先导化合物的数量锐减,于是人 们把目光投向了更为广阔的生境?海洋。海洋占地球面积的70%,海洋放线菌的生活环境 [3] 十分特殊,有高盐度、高压、低营养、低温及与不同生物之间的关系复杂等特点 。在这 些所谓生命的极限环境中,海洋放线菌已发展出独特的代谢方式,这不仅确保其在极端环 境中生存,也提供了产生新颖抗生素的潜力。因此,海洋环境将成为放线菌和放线菌代谢产 物的重要新来源。 1.1 海洋放线菌活性次生代谢产物研究概况 放线菌的生物活性产物主要是它的次级代谢产物。次级代谢产物是与初级代谢产物相 对应,是指并非微生物生长繁殖所必需,而是在某种特定的条件下以初级代谢产物为前体 [4] 物质,经过特殊的生物合成途径合成的,往往具有某些重要生理功能的一类化合物 。根 据Vicuron Antibiotic Literature Data-Base的统计,自1950年以来的研究和专利显示, 描 [12] 述的微生物源生物活性代谢产物有310600多种,其中200200种具有体外活性 。最近的 [12] Bear Stearns报告称 ,已经在市场上和临床实验应用的800个微生物源天然化合物中,其 靶标有57%是抗肿瘤,9%抗炎症,9%抗感染,5%治疗心血管,4%治疗糖尿病,2%治疗 呼吸道。放线菌源的抗生素占整个抗生素的67% 主要是链霉菌52%和稀有放线菌15% 。 而在非抗生素的代谢产物中源于放线菌的也有40%。 1.1.1 抗肿瘤活性物质 海洋放线菌最先成为海洋微生物抗肿瘤活性物质研究的焦点,是最 有经济价值和生物技术价值的原核生物之一。从海洋放线菌CNH-099分离到的含倍半萜 的新萘醌类抗生素Neomarinon,对NCI的60个人类肿瘤细胞群半数有效量平均值为10 [7] [8] μmol/L 。 Ivanova等 分离得到一株小双孢菌属放线菌Microbisporaaerate sp. IMBAS211A, 该菌能产生一类新型含硫天然产物microbiaeratin。Fenical等从墨西哥Guaymas海湾124米深 海污泥中分离到一株芽孢杆菌,在海水培养基中产生细胞毒素类化合物halobacillin,另外 还有生物碱类化合物salinosporamide A 对HCT-116 细胞具有明显的细胞毒作用。Romero [5] 等 从海洋放射菌L2132ACM2092的菌丝体中分离到多肽thiocoraline,该物质对P388淋巴 5 暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 瘤细胞、A549肺癌细胞和MEL-28恶性黑色素瘤细胞有强的细胞毒活性。Thiocoraline [6] 是源于海洋放线菌Micromonospora marina.的抗肿瘤制剂。Fenical等 首次发现并成功培养 了一属全新的海洋放线菌Marinispora鉴定出一系列结构新颖的化合物alinosporamides, 这 些化合物具有很强的抗菌及抗肿瘤活性。于2005年从海洋放线菌Streptomyces sp.中分离到 [10] 化合物chinikomycin A和chinikomycin B , 其中A在体外对乳腺癌、黑色素瘤和肾癌具有 [9] 选择性抑制作用。Kaneo等 报道了从海洋高温放线菌Thermoactinomyces sp. YM3-25l中分 [10] 离得到具有抗肿瘤活性的天然产物mechercharmycin A。同年,Maldonadol A等 从新分离 到的海洋放线菌Salinispora tropica.中分离出一种新的抗肿瘤活性天然产物salinosporamide ANP I20052。 Me H O OH N O Me O NHAc Me O R Me N S N H Me S R S Me S OH Me microbiaeratin Neomarinon Me i-Bu Et CH CH -Me 2 11 O O H H O O O N N CH -CH -C-NH 2 2 2 N O H H H N N N N O O HO-H C H 2 H i-Pr O Bu-i O i-Bu halobacillin HO Me O Me O H O Me H O N S N N N O N S H O S N N N N S O H Me O H O Me O OH SMe thiocoraline6 暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 O Cl HN E E E HO OH O O n-Bu OH EE Me Me Me O chinikomycin A O HN E E E OH O O n-Bu N OH EE H Me Me Me O chinikomycin B OH H O E E E E N Et HO Me Pr-n O E E E Z H O H N NH Me OH CH 2 i-Pr HN O N aureoverticillactam O N Ph H O N O H N OH N O O N O O S H C 3 Cl mechercharmycin A salinosporamide A1.1.2 抗生素和酶抑制剂。近年来人们不断从各种海洋环境中寻找到能产生具有新型作用 [15] 机制的抗生素的放线菌。如: Feidle 等人从不同地点采集的太平洋和大西洋海底沉积物样 品中分离得到了600多株放线菌,并且根据其是否能产生具有生物活性的次级代谢产物进 行了筛选,其中 Streptomyces 占22 %, Micromonospora占 29%, Pseudonocardia和 Rhodococcus分别占15%和33%。他们还发现了一个稀有的属Verrucosispora , 该属的放线菌 + 菌株AB2182032 能产生具有强烈抗G 的磺胺类药物前体abyssomicin,因此海洋放线菌是 寻找新型抗生素的理想来源。除了抗生素以外,海洋放线菌还能产生酶抑制剂。2005年, [16] 东京大学的Imada 等人就从不同地点采集的海洋沉积物中分离得到了多株能产生酶抑制 剂的放线菌,包括β-葡萄糖苷酶抑制剂、N-乙酰- β-D-氨基葡萄糖苷酶抑制剂,焦谷氨酰肽 酶抑制剂和淀粉酶抑制剂。其中一些在肿瘤治疗上可能具有临床应用价值。 1977年首次报 7 暨南大学硕士学位论文 第一章 前言[17] 道从Streptomyces staurosporeus.中分离到第一个吲哚咔唑类生物碱staurosporineSTA , [18] STA有较强的抗真菌活性和降压作用 ,而真正引起人们更多关注的是在1986年报道STA 具有非特异性抑制蛋白激酶的活性, 能抑制酪氨酸蛋白激酶PTKs、蛋白激酶APKA和蛋 [19] 白激酶CPKC等 。 STA通过与蛋白激酶相互作用和结合,阻止了生理状况下ATP与蛋白激 [20] 酶的结合,因此具有抑制该酶活性的能力,从而影响细胞周期的正常过程 。此后,STA结 构类似物陆续从天然来源中分离得到或由生物合成途径得到,如 k252a、 k252b、 k252cstaurosporine aglycone和arcyriavin A等都是从海洋放线菌中分离得到的星孢菌素衍 [21] 生物,相关活性报道主要还是集中在PKC抑制剂和抗癌活性上 。 H C 3 H C CH 3 H C CH 3 3 3 CH 3 O O O HO O O O O O O O N O O O O CH 3 CH 3 CH 3 OH OH OH abyssomicin D abyssomicin C abyssomicin B H H N O N O N N N N O Me O Me OH O-R MeO O NHMe k252a RMe k252b RH staurosporineSTA H N O H H N O N O O N N H N N N N OH H H Me H H OH HO arcyriaflavin A k252d staurosporine aglycone k252c 1.2海洋放线菌研究中的重要环节?去重复(排重) 由于放线菌的种类繁多,国内外的研究一致, 尽管已经描述、保存了大量放线菌, 但仍然有至少90%的放线菌未被发现。一般同一种属的动植物往往产生大体相同或类似的 8 暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 化合物。放线菌虽然代谢的可塑性较大,但是也具有类似规律。反之,不同种和亚种之间 [22] 可能会产生不同的化合物 ,因此将未知菌种或新菌种作为研究对象是获得新颖活性化合 物的途径之一。 1.2.1 菌种的遗传学去重复 为了避免采用前人研究过的遗传学上相同或类似的菌种,可以根据生物学和生态学知 识从特殊环境中分离特殊菌株;采用新的微生物分离培养方法,以分离出某些特殊条件下 才能生长的菌株;通过基因工程技术,人工干预微生物的代谢基因组,造成具有特殊代谢 [23]遗传性状的菌种 。 由于微生物的种类繁多,分类方法很复杂,因此很难立即知道所采用的微生物是否是 新的种类。对此可采用分子生物学的方法,如PCR,RFLP、RAPD等方法,以快速地获得 [24] 微生物的新种进行化学研究。Ritacco 等开发出一套自动化的基因指纹图谱分析技术,即 RiboPrinter微生物特征分辨系统(RiboPrinter microbial characterization system),用于微生 物菌株的快速去重复。 1.2.2 菌种的化学去重复 化学去重复亦即利用化学方法在菌株的化学分离前期排除一些已知化合物或找出某 些疑似的新化合物,以提高新化合物发现的效率。主要方法有 TLC 法、TLC 生物自显影 技术、化学反应法、高效液相色谱法及高效液相-波谱联用技术。TLC法是天然产物研究中 最常用的快速分析和检测方法。其原理是利用各种化合物在铺有硅胶薄层的支撑板上移动 速度不同而实现各种成分的分离,再通过紫外检测或经显色剂显色后得以检测。 1.2.2.1 TLC生物自显影技术 该方法可以为粗提物中具有生物活性的未知化合物提供更多 的信息,是一种将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的药物筛选方法。其基本原理是利 用薄层板将粗提物在薄层板上展开后,将薄层板与接种了病原微生物的培养基相接触。板 上非活性部位会被生长出的病原微生物所覆盖而呈现背景色,活性部位因抑制了病原微生 [25] 物的生长而呈现抑制斑点,这样就可从混合物中筛选出活性成分 。 1.2.2.2 化学反应法是利用某些种类的天然产物具有一些特殊的化学性质,会与某些化 学试剂发生反应而产生一定的现象来判断某类化合物的有无。在中草药鉴定及成分预试验 中经常用到。例如,生物碱类化合物能够与生物碱沉淀试剂作用产生沉淀。 但是,由于天 然产物成分复杂,往往受到各种交叉反应的干扰,很难作出较为确切地判断。而且只能大 致判断某类化合物的有无,对于其可能为新化合物与否很难做出判断。 1.2.2.3高效液相色谱与高效液相-质谱联用法 高效液相色谱具有分离效率高、灵敏度好、 9 暨南大学硕士学位论文 第一章 前言 可定量、检测手段多等优点,也可直接用于天然产物的化学筛选。如利用光电二极管阵列 检测器(diode array detection, DAD)进行检测,能够快速、灵敏地在线获得色谱流出物的 紫外光谱图,从而提供流出组分的某些结构特征信息。目前正在发展并受到高度重视的是液相色谱与各种波谱学手段的联用技术hyphenated techniques。主要有高效液相-质谱(HPLC-MS)和高效液相-核磁共振HPLC-NMR等联用 技术。HPLC-MS是上世纪 90年代发展起来的分析技术,它集液相色谱的高分离能力与质谱 的高灵敏度和高专属性于一体。质谱具有良好的灵敏度、强大的结构解析能力、高度的专 属性和通用性,分析速度快,对色谱分离度的不高,是进行化学筛选的首选工具。 HPLC-NMR是上世纪 90 年代后期发展起来的分析技术。核磁共振是迄今为 止功能最 强大的结构研究手段,可以解决多数有机物的化学结构问题;而且NMR对所有含检测核的 化合物均有响应,具有极大的通用性。高效液相色谱与核磁共振联用,既发挥高效液相的 高分离能力,又充分发挥了核磁共振的高结构解析能力,虽然该方法还没有得到完善,但 [26] 无疑是目前最具发展潜力的天然产物化学筛选的工具 。10 暨南大学硕士学位论文第二章两株海洋放线菌发酵液活性成分研究 第二章 两株海洋放线菌发酵液活性成分研究 本论文所研究的两株海洋放线菌 No. Ms252和 No. 172221的菌种分别由中国科学院北 京微生物研究所张立新研究员课题组和中国热带农业科学院热带生物技术研究所洪葵教 授课题组提供。海洋放线菌 No. Ms252 和 No. 172221的 1L发酵液分离流分经过合作单位 活性测试发现分别具有一定的互动抗真菌活性和 HCT-116 细胞毒活性,因此继续对两株菌 放大发酵液进行活性跟踪分离。经色谱分离和波谱鉴定方法,从中分离并鉴定了 15个单 体化合物。 2.1 菌株No. Ms252发酵液活性成分研究 菌株 No. Ms252 未鉴定种属 由中国科学院北京微生物研究所张立新课题组提供。首 先活化低温冷冻保存的菌种,将其接种于斜面培养基,生长 2~5天;然后将斜面上的菌种 接种于种子液培养基中,28 ?C摇床(220 r/min)发酵 4天;最后将发酵后的种子液接种 于 16 L 0.8 L ?20液体发酵培养基中,接种量 5%,28 ?C摇床(160 r/min)发酵 156 h。各 培养基配方见表 2-1。 表 2-1 菌株 No. Ms252 发酵培养基配方 培养基类型 配方组成 斜面培养基 水 100 mL、 KNO 0.1 g、 K HPO 0.05 g、 NaCl 0.05 g、 MgSO ?7H O 0.05 3 2 4 4 2 g、FeSO ?7H O 0.001 g、可溶性淀粉 2 g、琼脂1.8 g pH 7.0-7.2 4 2 种子液培养 水 1000 mL、可溶性淀粉 20 g、酵母粉 30 g、KNO 1 g、K HPO 9 g、 3 2 4 基 FeSO 0.2 g、CaCO 1.5 g 、MgSO 6 gpH 7.0-7.2 4 3 4 发酵培养基 水 1000 mL、可溶性淀粉 20 g、酵母粉 30 g、KNO 1 g、K HPO 9 g、 3 2 4 FeSO 0.2 g、CaCO 1.5 g 、MgSO 6 g pH 7.0-7.2 4 3 416 L发酵液经离心后分成上清液和菌丝体两部分,上清液用等体积氯仿萃取得到固体 约 9 g,菌丝体用乙酸乙酯超声提取得到固体约 500 mg。利用合作单位的高通量互动抗真 菌模型进行活性筛选。互动活性筛选的原理是几种药物之间相互配合使用时能产生协同作 用使药效大大增强,或在降低药物剂量的情况下不降低药效。为了确定待测样品的互动活 性,采用checkerboard检测法计算FICI值,FICI是每一个药物测试的FIC值的总和,FIC则是 由每一个药物的最低抑菌浓度MIC值来确定,即是以一个药物在联合使用时的MIC值除以 其单独使用时的MIC值。公式为:FICI MIC /MIC +MIC drug A in combination drug A alone drug B in /MIC ,当FICI值小于 0.5时我们认为两种药物具有互动作用。该活性筛选 combination drug B alone 模型既可以测试样品单独使用时的抗真菌活性,又可以评价样品与其他药物联合使用时所暨南大学硕士学位论文 第二章 两株海洋放线菌发酵液活性成分研究 产生的互动抗真菌活性。通过活性测试发现氯仿层具有一定的互动抗真菌活性 FICI0.375,于是继续对氯仿层进行活性追踪分离,结果发现氯仿层的子流分Ms252-C4-3 具有良好的抗真菌活性,而互动活性并不显著。最后从活性流分中分离得到了 4个微量的 化合物(活性追踪分离流程见图 2-1),并对这 4个化合物进行抗真菌及互动抗真菌活性评 价,结果是均表现出一定的抗真菌活性活性测试结果见表 2-2。 表 2-2 No. Ms252 抗真菌及互动抗真菌活性测试结果 FICI 测试样品名称 抗真菌 测试样品名称 互动抗真菌 MIC μg/mL MIC μg/mL Ketoconazole 0.016 Ketoconazole0.004选取 1/4MIC Cyclosporin A 64 Cyclosporin A 2 0.281 100 100 - Ms252-总 Ms252-总 100 100 - Ms252-菌丝体 Ms252-菌丝体 100 100 - Ms252-空白培养基 Ms252-空白培养基 Ms252-C 50 MS252-C 6.25 0.375 Ms252-C1 100 MS252-C1 25 0.5 Ms252-C2 50 MS252-C2 50 - Ms252-C3 100 MS252-C3 100 - MS252-C4 100 MS252-C4 25 0.5 Ms252-C5 100 MS252-C5 100 - MS252-C1 100 MS252-C1 100 - MS252-C1-1 100 MS252-C1-1 100 - MS252-C1-2 100 MS252-C1-2 100 - MS252-C1-3 100 MS252-C1-3 100 - MS252-C4-1 100 MS252-C4-1 100 - MS252-C4-2 100 MS252-C4-2 100 - MS252-C4-3 25 MS252-C4-3 12.5 - 25 Ms252-C4-3-1 25 - Ms252-C4-3-1 单体 1 25 Ms252-C4-3-2 25 - Ms252-C4-3-2 单体 2 25 Ms252-C4-3-3 25 - Ms252-C4-3-3 单体 3 25 Ms252-C4-3-4 25 - Ms252-C4-3-4 单体 4 注:进行互动抗真菌筛选时 MIC 值为每个样品分别与 Ketoconazole 联合 使用时所测得, Cyclosporin A为阳性对照药。粗流分样品测试浓度为 100 μg/mL,单体测 试浓度 32 μg/mL。14 暨南大学硕士学位论文 第二章 两株海洋放线菌发酵液 活性成分研究 No. Ms252 16 L发酵液 367.2 g 离心30mins 3600r/min 上清液 菌丝体 氯仿等体积萃取3次2倍体积乙酸乙酯超声提取 Ms252-C* 菌丝体乙酸乙酯提取物 9 g, 2.45% 0.50 g, 0.14% 硅 胶开放柱 层析16 g + 200 g, 500 ml 环己 烷/乙 酸乙酯 100%98%70% 0% 甲醇 Ms252-C1 Ms252-C2 Ms252-C3Ms252-C4*Ms252-C5 总回收率 99.20% 5.27 g 0.59 g0.13 g0. 70 g2.19 g ODS 开 放柱层析 甲醇/ 水 90%Ms252-C4-3* 0.029 g, 5.0% HPLC 65%甲醇 compd.1 1.9 mg compd.2 1.0 mg compd.3 1.6 mg compd.4 1.0 mg *表示活性流分 图 2-1 No. Ms252 活性跟踪分离流程 2.2 菌株 No. 172221 发酵液活性成分研究 菌株 No. 172221由中国热带农业科学院热带生物技术研究所洪葵教授课题组提供,经 洪葵教授鉴定为 Streptomyces sp.。该菌株种子培养基 YE 配方 g/V:葡萄糖 0.4%,酵 母粉 0.4%,麦芽粉 10%,海盐 1.8%, pH 7.2, 121 ?C灭菌 20 min。发酵培养基 黄豆粉 配 方 g/V:黄豆粉 1.5%,可溶性淀粉 2.0%,酵母粉 0.5 %,蛋白胨 0.2%,氯化钠 0.4%, 海盐 1.8 %,pH 7.2,121 ?C灭菌 50 min。摇瓶发酵 30 L 1 L ?30),摇床培养 10 d。 30 L发酵液浓缩至5 L,依次用等体积氯仿、正丁醇萃取。氯仿萃取部分去除溶剂得到 固体(EC)约16 g。正丁醇萃取部分浓缩去除正丁醇,弃去不溶物,反复3次脱去无机盐, 15 暨南大学硕士学位论文 第二章 两株海洋放线菌发酵液活性成分研究 合并滤液浓缩至干,得到固体(EB)约32 g。EC经硅胶开放柱层析,环己烷-乙酸乙酯梯 度洗脱分成6个子流分 EC1~EC6。EB经硅胶开放柱层析,氯仿-甲醇梯度洗脱分成5个流 分 EB1、EB2、EB3、EB4、EB5。通过合作单位的HCT-116生长抑制测试对No. 172221 的各级流分进行活性筛选,该筛选模型运用MTT法检测细胞存活率,即将生长在对数生长 3 期的细胞,经0.01%的胰酶消化、计数,以2.0×10 / well的细胞密度接种在96孔板中100 mL, 置于5% CO 培养箱内37?C培养过夜。每一测试样品设六个浓度梯度,每一浓度设三复孔, 2 每一浓度分别加入到对应孔中, 5% CO 于37?C培养箱内培养72小时,加入20 mL的5 mg/mL 2 MTT。37 ?C孵育3小时后,吸弃上清,加入100 mL的DMSO溶解,使用Spectra 340 测550 nmL1光吸收值,参考波长690 nmL2),将L1-L2)值对抑制剂不同浓度作图,经 公式拟合得半数有效浓度IC μg/mL。 50 经过该活性筛选模型,发现氯仿层的子流分EC2~EC6和正丁醇层的子流分EB3~EB4均 表现出不同强弱的HCT-116细胞毒活性活性测试结果见表2-2,提示活性成分可能被分散 到多个流分中,没有达到预期使活性集中的分离目的。通过各种色谱方法从这些分散的活 性流分中分离到11个化合物(分离流程见图2-2。通过合作单位的HCT-116生长抑制测试 对这11个化合物进行活性评价,发现对HCT- 116细胞的生长抑制率均较低(活性测试结果 见图2-3),没有显示出较强活性。 表 2-2 Streptomyces sp. No. 172221流分 HCT-116 细胞毒活性测试结果 IC50 μg/ mL 样品编号 来源 测试浓度 μg/ mL 20 1.181 172221-总 发酵液 172221-C 20 0.202 氯仿层 172221-B 20 10 正丁醇层 172222-W 20 10 水层 172221-C1 20 10 氯仿层 172221-C2 20 0.782 氯仿层 172221-C3 20 1.610 氯仿层 172221-C4 20 0.017 氯仿层 172221-C5 20 0.046 氯仿层 172221-C6 20 0.149 氯仿层 172221-B1 20 10 正丁醇层 172221-B2 20 10 正丁醇层 172221-B3 20 9.568 正丁醇层 172221-B4 20 3.565 正丁醇层 172221-B5 20 10 正丁醇层16 暨南大学硕士学位论文 第二章 两株海洋放线菌发酵液活性 成分研究 No. 172221 30 L发酵液 883.1 g 5 L 蒸馏水悬浮 氯仿、正丁醇萃取 CHCl n-BuOH H O 3 2 172221-W 172221-C* 172221-B 754.7 g ,85.46 % 16.6 g ,1.88 % 32.4 g ,3.67 % 硅胶20+ 150 g, 350 ml 环己烷/ 乙酸乙酯 硅胶35+ 200 g, 420 ml 氯仿/甲醇 90% 0% MeOH C3* 90% 70% C6* C4* B3* B4* sephadex-LH20 ods开放柱层析 1.61 g, 4.97% 7.82 g, 24.14% C:M 1:1 甲醇/ 水 sephadex- sephadex- ods开放柱 c3b LH20 15% LH20 甲醇/ 水 0.19 g, 13.38% C:M 1:1 C6A1 MeOH ods开放柱 1.0 g, 62.11% HPLC 80%MeOH ods开放柱 15%MeOH c5c c5d compd.11 90% 20%甲醇 60% compd.15 0.2 g, 20.62% 0.15 g, 15.46% 4.2 mg 2.3 mg sephadex-LH20 硅胶柱层析 B3O2B3O3 A1-1 A1-2 MeOH 0.27 g, 16.73% 0.25 g, 15.28% 0.5g +50g HPLC HPLC ,125ml HPLC 10% 20% sephadex- sephadex-LH20 55%MeOH 氯仿/甲醇 MeOH MeOH LH20 MeOH compd. 5 5.4 mg MeOH HPLC compd. 10 compd. 9 68%MeOH compd. 6 7.2 mg compd. 8 5.9 mg 13 mg 20 mg compd. 12 5.2 mg compd. 7 5.9 mg compd. 13 4.7 mg compd. 14 2.7 mg *表示活性流分图 2-2 No. 172221活性跟踪分离流程 注:单体测试浓度为 20 μg/ mL 图 2-3 No. 172221单体 HCT-116 细胞毒活性测试结果 2.3 从活性部位分离得到化合物的名称、编号和结构 从两株放线菌活性流分中分离得到了 15个化合物,其中 4个吲哚类生物 碱,3个甾体 类化合物,2 个环二肽类化合物,1 个氨基酸,1 个异黄酮,1 个脂肪酸,1 个 核苷类,2 17 暨南大学硕士学位论文 第二章 两株海洋放线菌发酵液活性成分研究 个苯的衍生物。化合物的名称、编号和结构详见表 2-3。 表 2-3 化合物结构与名称 编 分离编号 结构及名称 分子式 号 HO HO1 NH C H N O Ms252-C4 19 18 2 2 -3-1 306 NH3,3-bis3'-indolyl-1,2-propanediolH NO 2 Ms252-C4-3 C H N O 20 13 3 -3 311 N N H Hstaurosporine aglyconCH 2 OHO 1' HN Ms252-C4-3 C H N O 16 12 2 2 3 N -2 264 5-9H-pyrido[3,4-b] indol-1-yl -2-furanmethanolCH 2OCH 3O HNN Ms252-C4-3 C H N O 18 14 2 4 4 -4 322 COOH1-[5-methoxymethyl-2?furanyl]-9H-pyrido[3,4- b] inddole-3-carboxylic acid 172221-C5- 5 C H O 28 50 3 C-B 434 HO OH OHmethylcholestane-3 β,5α,6β-triol 18 暨南大学硕士学位论文 第二章 两株海洋放线菌发酵液活性成分研究 6 172221-C5- C H O 34 60 8 O C-D 596 OH O OH OH HO HO OHergostane- β-D-glucopyranosideC H O 35 60 6 172221-C5- 7 C-C 576 O O OH HO HO OH??daucosterol OH N172221-C5- NH C H N O 8 11 18 2 d-b-B H 210 OcycloPro-LeuO H NNH 9 172221-C6- C H N O 10 16 2 2 H A1-2-3 196 Ocyclo-Pro-ValO H 10 OH 172221-C6- C H NO 5 9 2 NHA1-1-4 115 praline OH172221-C3b C H O 16 32 2 11 O -28 256 palmitic acid 19 暨南大学硕士学位论文 第二章 两株海洋放线菌发酵液活性成分研究 O N OH 172221-B3- C H NO 8 9 2 12 H O2-N4-27 151 N-phenylmethyl- carbamic acid O O C H O 19 20 4312 172221-B3- 13 O O3-N2-4 O1,3-propanediyl benzeneacetic acid ester 14 HO O 172221-B3- C H O 15 10 4 OH O2-N50 254 OdaidzeinNH 2NNHO 15 N 172221-B4- N C H N O 10 13 5 4 O N4-4 267 OHOH adenosine 2.4 化合物的结构鉴定 化合物 1 Ms252-C4-3-1 5'' HO 6'' 4'' 1 7'' 2 3''a HO 3 7a'' NH 4' 3'' 3'a 3' 1'' 5' 2'' 2' 6' N 1' 7a' H 7'3,3-bis3'-indolyl-1,2-propanediol + + 淡黄色固体 氯仿-甲醇。ESI-MS m/z:329 [M+Na] , 635 [2M+Na] 提示该化 合物的分 + 子量为 306。HR-ESI-MS m/z 329.1269 [M+Na] 计算值分子式C H N O Na, 329.1262, 19 18 2 2 1 提示分子式为C H N O 。在 H-NMR DMSO-d , 500 MHz 谱中低场区表现出两组活泼 19 18 2 2 6 20 暨南大学硕士学位论文 第二章 两株海洋放线菌发酵液活性成分研究 质子信号δ 10.74 1H, d, J 2.0 Hz和 10.72 1H, d, J 1.5 Hz,提示结构中可能存在芳香环 上的-NH。 δ 8.0~6.5 共显示出 10个芳香氢信号,7.52 1H, d, J 7.5 Hz, 7.50 1H, d, J 6.5 Hz, 7.30 1H, d, J 2.0 Hz, 7.28 1H, m, 7.26 1H, m, 7.21 1H, d, J 2.5 Hz, 6.98 1H, t, J 7.5 Hz, 6.96 1H, t, J 7.5 Hz, 6.87 1H, t, J 7.5 Hz和 6.84 1H, t, J 7.5 Hz,提示芳环 上可能存在邻位取代结构。 6.98 J 7.5 Hz 6.96 7.52, J 7.5 Hz 7.30 J 7.5 Hz 7.21 6.87 J 2.0 Hz 7.50 J 2.5 Hz J 7.5 Hz J 6.5 Hz 7.28,m 6.84, J 7.5 Hz 7.26, m21 暨南大学硕士学位论文 第二章 两株海洋放线菌发酵液活性成 分研究 1 图 2-5-1 化合物 1的 H-NMR 13 图 2-5-2 化合物 1的 C-NMR 13 C-NMR DMSO-d , 125 MHz结合DEPT-135谱分析,化合物 1共含有 19个碳 原子, 6 其中 12个次甲基,1个亚甲基碳和 6个季碳。通过HSQC谱把碳与直接相连 的氢对应出来, 见表 2-5-1。 1 13 表 2-5-1 化合物 1 的 H及其对应的 C NMR 数据 δ δ C H 123.7 7.30 1H, d, J 2.0 Hz 123.3 7.21 1H, d, J 2.5 Hz 120.9 6.98 1H, t, J 7.5 Hz 120.7 6.96 1H, t, J 7.5 Hz 119.4 7.52 1H, d, J 7.5 Hz 119.3 7.50 1H, d, J 6.5 Hz 118.3 6.87 1H, t, J 7.5 Hz 118.2 6.84 1H, t, J 7.5 Hz 111.7 7.28 1H, m 111.4 7.26 1H, m 74.7 4.26 1H, m 65.1 3.281H, m,3.261H, m 36.3 4.56 1H, d, J 7.8Hz 注:数据对应基于 HSQC分析 1 1 在 H- H COSY谱中,δ3.26 和 3.28 的氢同时与δ4.26 的氢存在相关,δ 4.26 和 4.56 22 暨南大学硕士学位论文 第二章 两株海洋放线菌发酵液活性成分研究 的氢之间也存在相关见图 2-5-2,可以推测出片段A;δ10.74的氢和δ7.30的氢存在相关, δ10.72的氢和 7.21的氢存在相关,可以推测出片段B和C;由以下相关信号:δ7.52- 6.87- 6.96- 7.28 的氢之间顺次相关和δ7.50- 6.84- 6.95- 7.26 的氢之间顺次相关,可以推测出以下 结构D和E。 δ6.96 δ6.87 δ7.30 δ7.21 δ7.52 δ7.28 δ7.26 δ6.95 δ6.84 δ7.50 δ111.4 δ111.7 δ118.2 δ118.3 δ119.3 δ119.4 δ120.7 δ120.9 δ123.3 δ123.7 1 1 H- H COSY HSQC 1 1 H- H COSY HSQC δ4.56 7.50 δ4.26 7.26 6.96 6.84 111.4 117