人骨髓巨核细胞分化发育过程中神经生长因子基因表达

人骨髓巨核细胞分化发育过程中神经生长因子基因表达 122 13 1999 CH IN E SE JOU RN A L O F A N A TOM Y V o lN o 解剖学杂志 1999 年 22 卷 3 期 人骨髓巨核细胞分化发育过程中神经生长因子基因表达 3 3 3 3 3 3 3 3 3 陆 璐曹铮丁斐 顾晓松顾静 陈秀芳 吴芳颐 ()南通医学院组织学与胚胎学教研室, 3 分子生物学研究室, 南通 226001 3 3 附属医院血液研究室 () , 检测人骨髓巨核细胞分化发育过程中神经生长因子 基因表达情况。 结 实验通过原位分子杂交技术摘要N GF 果显示 神经生长因子 探针与其互补的 杂交反应信号存在于各级不同发育的巨核细胞胞浆中。原巨 ΒDN A m RN A 核细胞数量很少, 较难发现, 杂交反应阳性的胞浆很少, 呈线状。幼巨核细胞阳性胞浆较少, 杂交反应产物分布较为 均匀。颗粒型巨核细胞胞浆丰富, 杂交反应产物深浅不一, 常见较为细小的阳性颗粒, 成熟型巨核细胞体积很大, 胞 浆中的阳性颗粒大小不一, 有些阳性颗粒随着胞浆的脱落而散在于细胞周围。 结果提示神经生长因子在骨髓巨核 细胞系的发育成熟过程中可能发挥调节作用。 关键词 神经生长因子; 巨核细胞; 基因表达 神经生长因子是神经系统最重要的生物活4% 多聚甲醛, 0. 25% 乙酸酐2100 ƒ三乙 mm o lL 性分子之一, 它由被支配的细胞产生, 与神经元 醇 胺。 各步骤间用 洗涤。 滴加预杂交液PB S 轴突末梢的膜受体特异性结合, 形成复合物进 43?30 分钟, 加入地高辛标记的人2神经生长 Β 入轴突, 经逆行运至神经元胞体, 促进神经元的 1 () 因子 22探针, 43?杂交过夜。D igh ΒN GF DN A 分化、发育、修复并调节其正常功能。 新近研 抗地高辛抗血清2碱性磷酸酶复合物 4?过夜,究表明神经生长因子是一个多功能的生长因 2系统显色, 以左旋咪唑抑制非特异 N B T BC IP 子, 它 对 非 神 经 系 统 也 存 在 着 广 泛 的 生 物 效 2 性反应。另设空白对照组不加地高辛2人2神经 Β应。本文通过原位杂交方法, 检测在人骨髓巨 生长因子 探针。DN A 核细胞分化发育过程中神经生长因子基因表达 情况, 以探讨神经生长因子对造血系统的功能 意义。 2 结果 探针以地高辛2人2神经生长因子 Β DA N 检测正常人骨髓巨核细胞系在分化发育过程中 1 材料与方法神经生长因子基因表达情况, 结果显示 20 份标 本 中 有 17 份 骨 髓 巨 核 细 胞 神 经 生 长 因 子 1. 1 主 要 试 剂甲 酰 胺, 硫 酸 葡 聚 糖, 鱼 精 杂交呈阳性反应, 3 份标本巨核细胞未聚 蔗 糖, 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 等 购 自 m RN A , DN A S igm a 见杂交信号。在阳性标本中, 杂交信号存在于各公司。 地高辛探针标记试剂盒购自 Bo eh r in ge r 级不同发育阶段的巨核细胞和组织嗜碱性细胞 公司。M an n h e im () 1. 2 探针中。杂交反应产物为紫蓝色, 见于阳性细胞的胞 2人 神经生长因子 h ΒN GF DN AΒ3 浆中, 细胞核阴性。 红系粒系等造血细胞呈阴 的制备与标记按文献进行。 性。 在骨髓巨核细胞系中, 原巨核细胞数量很 1. 3 标本采集与制备 取本院内科门诊骨髓 细胞形态学检查正常的骨髓涂片 20 份, 4% 多 少, 较难发现, 偶而可见处于向幼巨核细胞过渡 阶段的原巨核细胞, 其胞核呈圆形或椭圆形, 常聚甲醛固定 15 分钟, 4?冰箱贮存备用。 3 有凹陷, 占据细胞的绝大部分, 杂交反应阳性的 1. 4 原位杂交 参照陆璐方法进行, 其主要 ( 甘氨紫蓝色胞 浆 很 少, 呈 线 状 位 于 细 胞 核 一 侧 图 步骤如下: 骨髓涂片依次入 100 ƒ mm o lL ( ) ) 酸, 0. 3% 2蛋 白 酶 1。幼巨核细胞胞体近圆形, 细胞核常呈肾形或100, 1 ƒ, T r ito n X K Λgm l 细胞、幼巨核细胞、颗粒型巨核细胞和成熟型巨不规则形, 胞浆中的杂交反应产物分布较为均 () 匀 图 2。颗粒型巨核细胞体积较大, 核形不规核细胞几个阶段。 地高辛标记的人22神经生长 Β 探针与其互补的 杂交信号 因子 则, 常扭曲或呈层叠状, 胞浆中的紫蓝色杂交反 DN A m RN A ( )应产物深浅不一, 常见细小的阳性颗粒 图 3。 在巨核细胞系的各个发育阶段均有表达, 提示 成熟型巨核细胞体积更大, 核呈分叶状或不规在骨髓巨核细胞系的发育成熟过程中可能需要 神经生长因子的参与。自从 1950 年发现神经生 则形, 胞质的杂交反应信号微弱, 可见大小不一 长因子以后, 又相继发现表皮生长因子等许多 的阳性颗粒, 部分阳性颗粒随着胞浆的脱落而 生长因子。经几十年的研究, 人们认识到这些生 () 散在于细胞周围 图 4。 未加地高辛2人2神经Β长因子具有一些共同的特征, 即它们都是多肽 探针的空白对照组巨核细胞胞生长因子 DN A或小分子蛋白质, 都具有多种生物学活性, 它们 往往以自泌和旁泌作用调节细胞的增殖与分 () 浆中未见任何杂交信号 图 5。 化。 神经生长因子基因在巨核细胞中的表达可 3 讨论能有促进巨核细胞分化的作用。 3. 3 造血细胞在发育成熟过程中需要有稳定 3. 1 神经生长因子的研究已有 40 多年, 其分 的造血微环境和多种造血因子的协同作用。 神 子结构、理化性质、基因结构、受体结构和性质 经生长因子作为一种非特异性刺激因子对中性 等均已先后被阐明, 尤其是近 10 年细胞生物学 粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等的分化和分子生物学新技术的的介入更促进了神经生 8 均具有诱导作用, 这种作用依赖于 淋巴细 T 长因子研究的发展。 最初发现神经生长因子的 胞的存在。 已有证据表明在淋巴细胞表面存在 1 作用是促进背根神经节和交感神经的生长, 在 着神经生长因子受体。因此, 巨核细胞系产生 的神经生长因子可能与 淋巴细胞表面的神 此后约 30 年内, 对神经生长因子生物学效应的 T 经生长因子受体结合, 促发了淋巴细胞释放多 研究仍局限在周围神经系统。 直到 80 年代, 人 种造血生长因子, 后者诱导造血细胞的分化。神 们发现神经生长因子对正常脑的发育及其机能 经生长因子基因在巨核细胞中的表达进一步丰 的维持同样至关重要, 从而使神经生长因子生 富了对神经生长因子生物学效应的研究。 巨核 物学效应的研究从周围神经系统扩大到中枢神 细胞表达的神经生长因子对其它造血细胞有无 直接作用, 它在巨核细胞分化发育中究竟有何 经系统。 进入 90 年代, 发现许多非神经组织和 细胞表达神经生长因子 和神经生长因 m RN A 作用均需要进一步研究阐明。子受体, 使人们对非神经组织的神经生长因子 生物学效应产生了极大的兴趣, 已有证据表明 神经生长因子影响淋巴细胞的增殖分化, 调节 4, 5 它们的免疫应答。免疫组化和原位杂交研究 发现, 神 经 生 长 因 子 及 其 存 在 于 腺 垂 m RN A 6, 7 参 考 文 献体、睾丸、附睾、卵巢等器官, 虽然它们的意 义尚未完全阐明, 但提示神经生长因子可能与 1 周廷冲. 多肽生长因子2基础与临床. 北京: 中国科学 8 内分泌和生殖系统功能的调节有关。M a t su da 技术出版社, 1992, 105. 在人外周血细胞培养中加入神经生长因子, 发 2 王丽辉, 童坦军. 神经生长因子. 生物化学与生物物理 () 现它能促进多种造血细胞集落的生长和分化, 进展, 1992, 19 1: 19. 3 陆 璐, 曹 铮, 丁 斐, 等. 人 地高辛 ΒN GF DN A 我们通过原位杂交方法在人骨髓巨核细胞系中 标记探针的制备及在小鼠颌下腺中的基因表达. 中国 观察到神经生长因子 的存在, 其结果与 m RN A () 组织化学与细胞化学杂志, 1997, 6 4: 346. 的报道从不同角度证实神经生长因子 M a t su da 4 . 与造血组织的功能密切相关。 O t ten U N e rve g row th fac to r induce s g row th and . d iffe ren t ia t io n o f h um an B lym p ho cy te sP ro c N a t l 3. 2 人骨髓巨核细胞系的发育经历了原巨核 1989, 86: 10059. A cad Sc i U SA , 5 T ho rp e LW . M ech an ism s o f lym p ho cy te ac t iva t io n 1990, by ne rve g row th fac to r. A nn N Y A cad Sc i, imm a tu re ra t o va ry: E ffec t o f dene rva t io n and 1990, 126: 594: 78. ho rm o na l t rea tm en t. E ndo c r ino lo gy, 357. 6 M acG ro gan D , D e sp r is G, R om and R , e t a l. 28 M a t suda H , Co ugh lin M D , B ienen sto ck J , e t a l. E xp re ssio n o f th e Βne rve g row th fac to r gene in m a le sex o rgan s o f th e m o u se, ra t and gu inea p ig. J N e rve g row th fac to r p rom o te s h um an h em opo ie t ic 1991, 28: 567. . N eu ro sc i R e s, co lo ny g row th and d iffe ren t ia t io nP ro c N a t l A cad , 1988, 85: 6508.7 L a ra H E , H ill D F , Ka tz KH , e t a l. T h e gene Sc i U SA enco d ing ne rve g row th fac to r is exp re ssed in th e GEN E EX PR E SS IO N O F N ERV E GROW T H FA C TO R DU R IN G D EV EL O PM EN T O F M E GA L O CA R YO C Y T E S IN HU M A N BO N E M A R ROW 3 3 3 , , , ,L u L u C a o Z h en g D in g F e iG u X ia oson g 3 3 3 3 3 3 ,, G u J in g C h en X iuf a n g W u F a n gy i (, 3 D ep a r tm en t of M olecu la rH is tology a n d Em b ry ology D ep a r tm en t of 226001 , , , B iology N a n ton g M ed ica l C ol leg eN a n ton g )3 3 , D ep a r tm en t of H em a tology A f f il ia ted H osp ita l of N a n ton g M ed ica l C ol leg e () T h e exp re ssio n o f n e rve g row th fac to r N GF gen e du r in g deve lopm en t o f m ega lo ca ryo cy te s . w a s stu d ied b y in situ h yb r id iza t io nT h e re su lt s show ed th a t th e po sit ive h yb r id ized sign a ls fo r . N GF m RN A w e re lo ca lized in a ll k in d s o f m ega lo ca ryo cy te sM egak a ryo b la st s w e re few in . n um b e r an d h ad lit t le po sit ive cy top la smT h e p rom ega lo ca ryo cy te s h ad a sm a ll am o u n t o f , . po sit ive cy top lam sw h ich w a s equ a lly d ist r ib u tedT h e g ran u la r m ega lo ca ryo cy te s h ad a . ab u n dan t po sit ive cy top la sm an d show ed th e deg ree s o f h yb r id ized reac t io nT h e po sit ive g ran u le s , . w e re sm a llw h ile th e th rom bo cy to geno u s m ega lo ca ryo cy te s w e re la rge rT h e re w e re som e . po sit ive g ran u le s o f la rge r size in th e cy top la smSom e po sit ive g ran u le s w re sca t te red a ro u n d th e . ce lls af te r th e cy top la sm d ropp edT h e stu dy su gge st s th a t N GF m ay p lay regu la t ive ro le in th e .deve lopm en t an d m a tu ra t io n o f m ega lo ca ryo cy te s in bo n e m a r row ; ; Key word s n e rve g row th fac to rm ega lo ca ryo cy tegen e exp re ssio n 图版说明1 向幼巨核细胞过渡阶段的原巨核细胞, 胞浆出现神经生长因子 阳性杂交信号, ×1000.m RN A 2 神经生长因子 杂交阳性幼巨核细胞, ×1000.m RN A 3 神经生长因子 杂交阳性颗粒型巨核细胞, ×1000.m RN A 4 神经生长因子 杂交阳成熟型巨核细胞, ×1000.m RN A 5 未加地高辛2人2神经生长因子 探针的对照组, 巨核细胞呈阴性反应, ×1000.Β DN A