影响酶促反应的因素温度

影响酶促反应的因素温度 实验五 影响酶促反应的因素—温度、pH、 激活剂及抑制剂 目的和要求 1 通过检验不同温度下唾液淀粉酶和脲酶的活性，了解温度对酶活性的影响 2了解pH对酶活性的影响，学习测定酶的最适pH的 3了解酶促反应的激活与抑制，学习检定激活剂和抑制剂影响酶反应的方法和原理 原 理 酶的催化作用受温度的影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度。通常温度每升高10摄氏度，反应速度加快一倍左右，最后反应速度达到最大值。另一方面酶是一种蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。反应速度达到最大值时的温度称为某种酶作用的最适温度。高于或低于最适温度时，反应速度逐渐降低。大多数动物酶的最适温度为37-40摄氏度，植物酶的最适温度为50-60摄氏度。但是，一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用的时间长短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的方向移动。通常测定酶的活性时，在酶反应的最适温度下进行。为了维持反应过程中温度的恒定，一般利用恒温水浴等恒温装置。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。实践证明大多数酶在干燥的固体状态下比较稳定，能在室温下保存数月以至一年。溶液中的酶，一般不如固体的稳定，而且容易为微生的污染，通常很难长期保存而不丧失其活性，在高温的情况下，更不稳定。 酶的活性受环境pH的影响极为显著。通常各种酶只有在一定的pH范围内才表现它的活性。一种酶表现其活性最高时的pH值，称为该酶的最适pH。低于或高于最适pH时，酶的活性逐渐降低。不同酶的最适pH值不同，例如，胃蛋白酶的最适pH为1.5-2.5，胰蛋白酶的最适pH为8等。应当指出酶的最适pH受底物性质和缓冲液性质的影响。例如，唾液淀粉酶的最适pH约为6.8，但在磷酸缓冲液中，其最适pH为6.4-6.6，在醋酸缓冲液中则为5.6。 酶的活性常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂;有些物质能使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。例如，氯化钠为唾液淀粉酶的激活剂，硫酸铜为其抑制剂。很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性。值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。例如，氯化钠达到1/3饱和度时就可抑制唾液淀粉酶的活性。 试剂和器材 一、试剂 [1] 0.3%氯化钠的0.2%的淀粉溶液 [2] 0.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液 [3]0.1%淀粉溶液 (新鲜配制) [4] 稀释200倍的唾液 [5] 1%氯化钠溶液 [6] 1%尿素溶液 [7] 0.2M磷酸氢二钠溶液 [8] 0.1M柠檬酸溶液 [9] 0.1%硫酸铜溶液 [10] 碘化钾-碘溶液:将碘化钾20克及碘10克溶于100毫升水中，使用前稀释10倍。 [11] 脲酶提取液:取黄豆粉6克，加30%乙醇250毫升，振荡10分钟，过滤，可保存1-2星期。 [12] 奈斯勒(Nessler)试剂:称取5克碘化钾，溶于5毫升蒸馏水中，加入饱和氯化汞溶液(100毫升约溶解5.7克氯化汞)，并不断搅拌。直至产生的朱红沉淀不再溶解时，再加40毫升50%氢氧化钠溶液，稀释至100毫升，混匀，静置过夜，倾出清液存于棕色瓶中。 (奈斯勒试剂是含有大量汞盐的强碱性溶液，所以，它是具有腐蚀性的剧毒试剂。实验时必须严格遵守操作规程，谨防中毒。此外，作酶学实验时所用的玻璃仪器等一切器皿必须洁净，以除去能抑制酶活性的杂质。因此，用奈斯勒试剂作完实验后，必须将它所沾污的试管等一切器皿充分洗涤干净。) 二、器材 [1] 试管和试管架 [2] 吸量管(0.5 1 2 5 10亳升) [3] 烧杯(500、100毫升) [4] 锥形瓶(50 100毫升) [5] 玻璃漏斗 [6] 水浴锅 [7] 铁三脚架 [8] 煤气灯 [9] 恒温水浴 [10] 滤纸 [11] 滴管 [12] 量筒(100毫升) [13] 玻璃漏斗 [14] 白瓷板 [15] 秒表 操作方法 一、 温度对唾液淀粉酶活性的影响 唾液淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小分子的糊精及麦芽糖。它们遇碘各呈不同的颜色。直链淀粉(即可溶性淀粉)遇碘呈蓝色;糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不呈现颜色。由于在不同温度下唾液淀粉酶的活性高低不同，则淀粉被水解的程度不同，所以，可由酶反应混合物遇碘所呈现的颜色来判断。 取3支试管，编号后各加入0.3%氯化钠的0.2%的淀粉溶液2毫升。将第1、2号试管放入37摄氏度恒温水浴中保温，第3号试管放入冰水中冷却，5分钟后，向第1号试管中加入煮沸5-15分钟的稀释唾液1毫升，向第2、3号试管加稀释唾液各1毫升。摇匀后，继续保温，20分钟后取出3支试管，各加碘化钾化钾-碘溶液2滴，混匀，比较各管溶液的颜色。判断淀粉被唾液酶水解的程度，并说明温度对唾液酶活性的影响。 二、 温度对脲酶活性的影响: 脲酶能催化尿素水解生成氨和二氧化碳，氨可与奈斯勒试剂作用生成橙红色化合物。由颜色深浅，可断定反应进行的程度。 取4支试管，编号。向每支试管中，各加入脲酶提取液1毫升。将第1号试管放在冰水里冷却，第2号试管在室温下放置，第3号试管在50摄氏度恒温水浴中保温，第4号试管在混水浴中煮。5分钟后向4支试管中各加入1%尿素溶液1毫升。混匀，10分钟后取出4支试管，将第3、4号试管用流动的自来水冷却至室温。然后，向4以度管中各加奈斯勒试剂5滴，摇匀。观察比较各试管颜色深浅，并说明温度对脲酶活性的影响。 三、 pH值对唾液淀粉酶活性的影响: 取8个50毫升锥形瓶，编号。按下表中的比例，用吸量管添加0.2M磷酸氢二钠溶液和0.1M柠檬酸溶液，制备pH5.0-8.0的8种缓冲溶液。 锥形瓶号 0.2M磷酸氢二钠(毫升) 0.1M柠檬酸(毫升) 缓冲液pH 1 5.15 4.85 5.0 2 6.05 3.95 5.8 3 6.61 3.39 6.2 4 7.28 2.72 6.6 5 7.72 2.28 6.8 6 8.24 1.76 7.0 7 9.08 0.92 7.4 8 9.72 0.28 8.0 取9支干燥的试管，编号。将8个锥形瓶中不同pH的缓冲液各取3毫升，分别加入相应号码(1-8号)的试管中。然后，再向每个度管中添加0.5%淀粉溶液2毫升。第9号度管与第5号试管的内容物相同。 向第9号试管中加入稀释200倍的唾液2毫升，摇匀后放入37摄氏度恒温水浴中保温。每隔1分钟由第9号试管中取出了一滴混合液，置于白瓷板上，加一滴碘化钾-碘溶液，检验淀粉的水解程度，待结果呈橙黄色时，取出试管，保温时间。注意，掌握第9号度管的水解程度是本实验成败的关键之一。 以1分钟的间隔，依次向1至8号试管中加入稀释200倍的唾液2毫升，摇匀，并以1分钟的间隔依次将8支试管放入37摄氏度恒温水浴中保温。然后，按照第9号度管的保温时间，依次将各管迅速取出，并立即加入碘化钾-碘溶液2滴，充分摇匀。观察各管呈现的颜色，判断在不同pH值下淀粉被水解的程度，可以看出pH对唾液淀粉酶活性的影响，并确定其最适pH。 四、 激活剂或抑制剂唾液淀粉酶活性的影响: 取3支试管，编号。向第1支试管中加入1%氯化钠溶液1毫升，向第2支试管中加入0.1%硫酸铜溶液1毫升，向第3支试管中加入蒸馏水1毫升作对照。再向每支试管各加入0.1%淀粉溶液3毫升和稀释的唾液1毫升。摇匀各管内容物，一齐放入37摄氏度恒温水浴中保温，10-15分钟后取出。冷后，各滴入2-3滴碘化钾-碘溶液，混匀。观察比较3支试管颜色的深浅，并解释之。 如果激活剂或抑制剂的作用不明显，主要原因可能是唾液淀粉酶活性不够高，可以适当延长反应时间或者降低唾液稀释倍数，然后再继续实验。 思 1、什么是酶的最适温度,有何实践意义, 2、为什么可以用碘化钾-碘溶液作指示剂检查温度对唾液淀粉酶活性的影响, 3、奈斯勒度剂的成分是什么,为什么可用它来检查脲酶的活性,使用中应注意什么, 4、酶在干燥的状态下与水溶液中，它的活性受温度的影响是否相同,这个性质对酶的 保存有意义, 5、酶反应的最适温度是酶的特征物理常数吗,它与哪些因素有关, 6 pH对酶活性有何影响,什么是酶反应的最适pH? 7 酶反应的pH是否是一个常数,它与哪些因素有关,这种性质对于选择测定酶活性的条件有什么意义, 8 通过几个酶学实验，你对下面的问题如何认识: (1)酶作为生物催化剂具有哪些特征, (2)进行酶的实验必须注意控制哪些条件,为什么, 9 激活剂可以分为哪几类,本实验中氯化钠是属于其中哪一类, 10 抑制剂与变性剂有何不同,试举例说明。 11酶反应的抑制作用有哪些类型,根据什么划分的,它们都有什么特点,