W_15菌株产生的纤溶酶蛋白的提取与纯化_cropped

W_15菌株产生的纤溶酶蛋白的提取与纯化_cropped 河 北 农 农 大 学 学 农Vol . 30 No . 第 30 卷第 1 1期J OU RNAL O F A GR ICUL TU RAL U N IV ERSI T Y O F HEB EIJ an . 2 0 0 72 0 0 7 1 年月 () 文章编号 : 1000 - 1573 200701 - 0065 - 03 W 215 菌株农生的农溶农蛋白的提取农与化 1 2 1 ,2 2 2,,,,王峰李农娜朱宝成武翠农袁洪水 (1 . 河北大学 生命科院 学学, 河北 保定 071002 ; 2 . 河北农农大学 生命科院学学 , 河北 保定 )071001 摘要 : 农微生物中农取溶栓农物 从,从土壤 、豆中豉农得农农溶农活性高的 1 株菌株 ,命名农 W - 15 。农农农 , 36 kDa ,1 571 U K/ mg 农酵上液中农溶活性的蛋白农分子农量农农 清农的比活农 。 : ; ; ; 编 编 编 农溶农 菌株 农农 农化 中编分编号 : Q 814 . 文献编编编 : 1A Isolation and purif ication of f ibrinolytic enzyme f rom W 215 stra 1 2 1 ,2 2 WAN G Fe ng, L I Shu2na, ZHU Bao2che ng, WU Cui2ho ng, YUAN Ho 22shuing (1 . College of Life Science , Hebei U niversity , Baoding 071002 , Abstract : In o rder to gain t hro mbolytic drug f ro m microo rganism , a st rain named W215 wit h high yield of fibrinolytic enzyme was separated f ro m t he soil and t he fer mented soybean . It was p roved t hat a potent fibrinolytic enzyme p urified f ro m t he cell2f ree super natant was estimated to be 36 kDa and it s spectific activit y was 1 571 U K/ mg. Key words : fibrinolytic enzyme ; st rain ; screening ; p 血管堵塞所引起的心肌梗塞和农梗塞 ,是当前1 株高农农溶农的菌株 ,并从农酵液中品中分到离 分农化出农离溶农 ,旨在农微生物中农取溶栓从农 物提农床死亡的主要原因之一 。其病因是农农蛋白聚集 于农 供技农支持 。脉管壁所农致 。因此 ,研制和农展高效 、特异 、 安全 、副作用小的溶血栓农物 ,一直是近年全世界来1材料方与法1 范农的农农农农 。自 1987 年 ,由日本的农农洋行等首先农 材料1 . 1农农豆中存在农豆激农以 来,又农物从中 分到蚓农离蚯 2 3 屠宰农的土壤 , 、豆瓣农 。各农地的豆豉溶农,植物中分到蒲农溶离黄农等一些具有农溶活 培编基1 . 2性的蛋白农 。 富 集 培 农 基 : 血 粉 2 % , 白 农 1 % 猪蛋微生物是农得溶栓农物的一重要源个来 。如从, NaCl4015 % ,p H 712 ;( ) 枯草芽农杆菌 豆激农,B aci l l u s ubt i l is农得了农 农子培农基 农 糖 :115 % ,115 % , KH蛋白葡萄( ) 农球菌 S t re pt ococcus 农 得 了 农 激 , 农 霉 中2 56 菌农( ) POS t re ptoycesY405 农本 文 从 不 同 得到农溶。4 农 收稿日期 : 2006 - 03 - 31 () : 1981 - ,,,,.作者编介 王 峰 男 河北石家庄人 在农农士生 主要事微生物制农从研究 () : 1962 - ,,,,,.通编作者 朱成宝 男 河北农人献 教授 博士生农农 主要事微生物及生化农从学研究 E2mail : zhu2222 @126 . co m ; Tel : 0312 - 7528258 μ蔗蛋: 3 % , 115 % , 农酵 培 农 基 糖 白 农 干燥得干粉 。取 A 和 B 10L 点农农蛋白板农农溶 CaCl20102 % , MgSO0105 % , KHPO016 % , KHPO活性 , A 的 溶 圈 明 农 大 于 B , 农 取 A 农 行 4 2 2 44 011 % ,p H 712 。下 一 步 究研 。 1 . 3方法1 . 3 . 6D EA E Sep haro se Fast Flow 农 离 子 交 农从农村屠宰农的土壤1 . 3 . 1菌株的分离与农化( ) 装 好 的 柱 115 cm ×20 cm 用 p H 农析 910 、及市面上农置的豆豉 、豆瓣农中采集农品后 ,农农品20 mmol/ L Tris - HCl 充分平衡 , 农品也用同农农农行无菌水浸提 ,充分振农后于 50 ?放置 2 h ,取上 冲液 溶 解 , 制 成 10 mL 、10 mg/ mL 的 溶 液 清液农行富集液培体农 ,农富集培农所得到的菌液 用 。采 用 NaCl 梯 度 洗 脱 , 依 次 农 0 、011 、无 菌 水 农 行 系 列 稀 农 , 取 不 同 稀 农 度 的 - 3 - 5 - 6 013 、015 、017 、1 . 0 mol/ L 。紫外 280 nm 波农农μ() 菌 液 10 、10 、10 20 L 涂布于普通农菌 培农基平 板 ,37 ?倒置培农 24 h 后 ,挑取农菌落 。农 。农农各洗脱峰的 农活 ,收集农农含有农溶活性的农分 1 . 3 . 2 农溶农活性的农定 照文参献 7 稍加修 。1 . 3 . 农 的 农 度 和 分 子 农 量 采 用 SDS 改 。取 1 %低溶点农脂糖 8 mL ,凝血农 2 U , 018 % 农 定7-PA GE 农 农 农 的 农 度 和 分 子 农 量 。农 农 胶 农 农农蛋白原 8 mL 混 匀,倒入直径 9 cm 的平皿 , 室 度 农μ温放置至乳白色 ,打孔加农 。将 10 L 农品液点在 农脂糖农农蛋白平板孔中 , 37 ?恒培温农 , 18 h 后 农5 % ,12 % 分农度农离胶。 (察溶圈大小 ,农量溶圈的垂直直径 相互垂直的两 1 . 3 . 8Bradfo rd定依据 农溶液中蛋白农农度农) 直径,并点农农准品尿激农 20 ,40 ,60 ,80 ,100 IU , 以,法 。以牛血白蛋白作农农准清尿激农溶圈的垂直直乘农的农农农坐径数横农 ,农 度农农数 2农果与分析农坐农 ,作出尿激农农准品的农准曲农 ,用 于农定农溶农的活 ( ) 性 ,农溶农的农位以相于尿当激 农的农位 U K来示 编溶编编生菌的编编2 . 1。从农村屠宰农的土壤及市面上农置的豆豉 、豆1 . 3 . 3 农溶农农生菌的农农 得到的各菌株将接 于 ( 牛肉膏蛋白农液培农基体中 250 mL 三角瓶 ,装 液瓣农中 , 共 农 农 到 具 有 溶 栓 能 力 的 菌 株 ) 量 50 mL ,于 32 ?,160 r/ min 培农 54 h ,取农酵 ( 18 株 农μ上液 清10 L 在农农蛋白平板上点农 。) 1。由于 W 215 菌株具有农高的农溶活性 ,因此农 于 37 ?恒培农温 18 h 后 ,农察溶圈出农情及况 其作了农一步的究研 。W 215 菌株的菌落特征农淡 农量大小 。农取 W 215 菌株农行下一步究研 。黄色 ,不透明 ,有光农 ,湿黏农农稠 ,农形 ,农农整农 ,易 挑1 . 3 . 4 农溶农农生菌的培农 新农的斜面培从农 物取 ,菌落直农径 3,5 mm 。中 , 挑 取 一 农 接 农 于 100 mL 农 子 培 农 基 中 , 于 ( ) 200 r/ min37 10 mL 振农培农 夜 。取 液?农农子 () 接入 100 mL 农酵培农基 500 mL 三角瓶中 ,于 30 () ? 振农培农 160 r/ min48 h 后 ,将农酵液 10 000 r/ min 离心 10 min ,收集上液清 。 1 . 3 . 5 硫酸农分农农析 农了平衡硫酸农溶解农 农生 的酸化作用 ,向农酵上液中加入酸农清磷冲液编 1 编编菌株的编溶编活性编至农农度农 50 mmol/ L 后 ,再加硫酸农 。先农慢加 入定 Fig. 1 Fibrinolytic activity of the f iltrated stra 硫 酸 农 使 农 和 度 至 30 % , 4 ?放 置 4 h 后 , 编溶编蛋白的编化2 . 24 ?农硫酸农分农农析得到的 30 %, 65 %的蛋白 沉12 000 r/ min 15 min , , 心 去 农 蛋 白 离除再 淀 A 和 65 %,85 %的蛋白沉淀 B 农行了农溶活 性加 至() 的农定 ,A 的农溶活性明农大于 B 农 2。65 % , 4 静 置 农 夜 后 , 4 12 000 r/ ?? min 离心 15 min ,收集沉淀 A 。农农加入硫酸农使农和 度 农 85 % ,4 ?置农静夜 ,4 ? 12 000 r/ min 离心 15 min , B 沉淀溶于少农 PB S ,收集沉淀。后用截留编 2 蛋白沉淀 A 和 B 的编溶活性分比编 子量农 14 000 农 。然后真空冷农的透析袋透析除Fig. 2 Compare A with B of f ibrinolytic 67第 1 期王峰等 : W - 15 菌株农生的农溶农蛋白的提取农化与 农 A 农行 D EA E Sep haro se Fast Flow 农子交离菌株 ,采用农农的硫酸农分农农析 ,农子交农农析离 方法 ,分到农离泳农的农溶农蛋白 ,农农农子交农 农析离洗农农析 ,NaCl 3 。梯度洗脱出个峰 脱的 3 个峰 ,均具有农溶农活性 ,可农微生物 胞外分泌多农农溶农 。本究研离只是分提农出其中 的 1 农 分 子 量 农 农 36 kDa 的 农 溶 农 , 其 比 活 农 1 571 U K/ mg ,农一步农化出农溶活性更高的有待 蛋白农 。 参考文献 :1SIM I H , HAMADA H , TSU SHIMA H , et . A alnovel ( ) fibrinolytic enzyme noot to kinasein t he vegetable cheese nat to ,a t ypical and pop ular soybean food in t he () 编 3 D EAE Sepharose Fast Flo w编离子J apanese diet J . Ex perientia ,1987 43:1 110 - 1 111 .2交编M IHARA H , SU M I H , YON E TA T , et al . A 编析分离编溶编的编析novel fibrinolytic enzyme ext racted f ro m t he eart hworm 编, L u m 2 bricus r ubel l us J . J a pan J Physiol ,1991 ,41 Fig. 3 Elution prof ile of f ibrinolytic 3() 3:461 .protease purif ied by D EAE sepharose fast f PA GElo w ion2exchange column chromatogra phy裴光源 ,王中枢. 蒲农溶农的分黄离农化及部分性农的 农农农农一蛋白 ,分子量农农 36 kDa 。但是峰 2 和( ) 1研究J . 生物化生物物学与学理农 ,1991 , 23 : 14 4-峰 3 含有多农蛋白 ,可农农采用另离外的蛋白分方 19 .法农行分离 。FUJ I T IA M , NOMU RA L Purificatio n of a st ro ng fibri2 nolytic enzyme in t he vegetable cheese nat to , a 5pop ular soybean fermented food in J apan J . Biochem () Bio p hys Res Co mmun ,1993 ,197 3:1 340 - 1 347 . MAL KE H , RO E B , F ERR E T T I J . Nucleotide se26 quence of t he st rep to kinase gene f ro m S t reptococcus equi2 () si m il is H46A J . Gene ,1985 34:357 - 7362 . 王农 ,王敏 ,王以光 ,等. 农霉菌农生的新型农溶农的农 化和 ( ) 性农的研究J . 生物工程学 农,1999 ,15 2: 147 - 152 .8 AS TRU P T , MULL ER TZ S. The fibrin plate met 1 . 蛋白分子量 Mar ker ;2 . 粗农液 ;3 . 峰 1hod for estimating fibrinolytic activit yJ . Arch Biochem 编 4 峰 1 的 SDS 2PAGE 编() Bio 2 p hys ,1952 40:346 - 351 .9泳编刘常金 ,江慎农 ,王昌禄. 枯草杆菌 SBS6 中一农农溶Fig. 4 SDS 2PAGE of the f raction 农的农化及部分特性 J . 天津科技大学学农 ,2005 ,20 110() 2:22 - 24 .2 . 3编溶编比活的编定,. J . ,慕娟 党永农豆激农的分离农化 西北农农学志 用尿激农作农农照 ,农农化的农溶农的活性农 行了农定 () 2002 ,17 4:155 - 157 11, 农用 PB S 配制成 0107 mg/ mL 农度 , 取. 农农林 ,农小勇 ,农建安 ,等 . 枯草杆菌溶栓农的分离 农μ10 L 点农农蛋白平板 ,农量溶圈直 径,依据尿激农 农() 化究研 J . 中生化农物农国志 ,2000 ,21 5:219 -准曲农 ,农出农活农 111 U K ,农算出农的比活农()农农 :祁振声3农农 从离不同农品中分农农到 1 株农溶活性农高的