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胚胎干细胞在内膜损伤小鼠宫腔内移植的实验研究_吕一帆

2017-11-15 10页 doc 30KB 21阅读

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胚胎干细胞在内膜损伤小鼠宫腔内移植的实验研究_吕一帆胚胎干细胞在内膜损伤小鼠宫腔内移植的实验研究_吕一帆 目录英文缩略词表…………………………………………………………. 1中文摘要…………………………………………………………..........4Abstract……………… …………………………………………......... .5前 言…………………………………………………………................. 7材料与方法……………………………………………………………. 9实验一 mESC 培养、全能性鉴定及 ES 细胞悬液制备…………….12实验二 ICR 小鼠子 谀に...
胚胎干细胞在内膜损伤小鼠宫腔内移植的实验研究_吕一帆
胚胎干细胞在内膜损伤小鼠宫腔内移植的实验研究_吕一帆 目录英文缩略词…………………………………………………………. 1中文摘要…………………………………………………………..........4Abstract……………… …………………………………………......... .5前 言…………………………………………………………................. 7材料与方法……………………………………………………………. 9实验一 mESC 培养、全能性鉴定及 ES 细胞悬液制备…………….12实验二 ICR 小鼠子 谀に鹕四,椭票浮 ?.… 18实验三 mESC 在内膜损伤小鼠宫腔内移植及移植后观察…………21结果…………………………………………………………………… 25讨论…………………………………………………………………… 33结论…………………………………………………………………… 40致谢…………………………………………………………………….45综述…………………………………………………………………….46 英文缩略词表英文缩写 英文全称 中文全称ESC embryonic stem cell 胚胎干细胞mESC mouse embryonic stem cell 小鼠胚胎干细胞EDTA ethylene diamine tetraacetic acid 乙二胺四乙酸EGFP enhanced greem fluorescence protein 增强型绿色荧光蛋白PMEF primary mouse embryonic fibroblast 原代小鼠胚胎成纤维细胞MEF mouse embryonic fibroblast 小鼠成纤维细胞PBS phosphate buffered saline 磷酸缓冲生理盐水rpm revolutions per minute 每分钟转速min minute 分钟sec second 秒h hour 小时LIF leukaemia inhibitory factor 白血病抑制因子GFP green fluorescent protein 绿色荧光蛋白AFP α-fetoprotein 甲胎蛋白SMA actin,smooth muscle 平滑肌肌动蛋白 nestin 神经巢蛋白d day 天U unit 单位DAB 33-diaminobenzidine 3,3 一二氨基联苯 1 胚胎干细胞在内膜损伤小鼠宫腔内移植的实验研究 中文摘要背景:子宫内膜损伤是妇产科医生临床上经常遇到的问题,其治疗策略最重要的一点是促进子宫内膜再生和功能恢复,而对于局部重度或广泛的内膜损伤,目前的治疗方法尚难以解决子宫内膜重新再生问题,是临床治疗上的棘手问题。随着近年来干细胞分化理论深入研究,干细胞应用于临床治疗的研究也越来越多,这为子宫内膜损伤治疗提供了一种新的理念,由于胚胎干细胞(Embryonic stemcells,ESC)有很高的再生和分化潜能,胚胎干细胞于其内膜损伤内移植,为干进一步研究细胞治疗子宫内膜损伤奠定基础。目的:研究小鼠胚胎干细胞移植入内膜损伤小鼠宫腔内后的存活与迁徙情况。方法:利用 MEF 作为饲养层培养 EGFPES 细胞,于 ICR 小鼠肾被膜下移植,4周后对移植后肿物 HE 染色及 nestin、α-SMA 和 AFP 免疫组化染色观察;用热损伤处理子宫内膜方法制备 ICR 小鼠子宫内膜损伤模型,并进行一系列的时间观察损伤后子宫内膜情况;急性损伤后移植一定量(3-4×105 个)未分化的 GFP小鼠胚胎干细胞至内膜损伤小鼠宫腔内,14 天后取子宫,直接荧光显微镜观察和 HE 染色后及抗 GFP 蛋白抗体免疫组化染色后显微镜下观察小鼠胚胎干细胞的存活和迁徙情况。结果:ES 细胞在成纤维饲养层细胞上生长良好,呈克隆状生长,荧光显微镜下观察 ESC 有明显 EGFP 表达,发出绿色荧光,肾被膜下移植后有三个胚层标记表达(nestin、α-SMA 和 AFP)的畸胎瘤形成;子宫内膜热损伤处理后至 14d 天HE 染色观察子宫内膜没有修复表现;ESC 在内膜损伤小鼠宫腔内移植后,HE染色见,宫腔内见大量的脱落组织,成团,未见具体子宫内膜形态组织组织,子宫壁未见有修复发生,抗 GFP 免疫组化染色观察,阳性细胞成团散布在宫腔内容物中, 细胞大部分呈圆形,未见阳性细胞迁徙至宫腔壁。结论:ES 细胞 MEF 饲养层上 呈未分化状态生长,并具有全能性;通过热损伤法可以成功建立子宫内膜损伤模型; 子宫内膜损伤后 mESC 宫腔内移植后能够在宫腔内存活、未见有向宫壁迁徙情况。 关键词:胚胎干细胞 移植 子宫内膜损伤 2 Experimental studies on transplantation of mouse embryonic stem cell into the uterine cavity of the ICR mouse with injuried endometrium AbstractBackgroud: At presentthe endometrium damage is one of the major problems whichgynecologist encountered in clinical for the treatment of endometrium damage themost important point in the treatment strategies is to promote regeneration andfunctional recovery of injuried endometrium The current clinical regenerationtreatment of the locally severe or extensive endometrium injury is still difficult tosolve which is the thorny issue of clinical treatment. In recent years with the study ontheory of stem cell differentiation more and more research on the clinical applicationof stem cells emerges in the academic reportswitch provides a new concept for thetreatment of endometrial damage. Because the embryonic stem cells ESC have highregeneration and the potential to differentiate to other type of cells so it is a goodmethod to study injuried endometrium application of stem cells by transplanting amumber of moese embryonic stem cells into the injuried endometrial lumina of theICR mice all the experimental research we did is to lay the foundation for the furtherstudy stem cell therapy for endometrial injury.Objective: The study was designed to study the mouse embryonic stem cells’intrauterine survival and migration after transplantation into the injuried endometriallumina of ICR miceMethods:We cultured the EGFPES cells on the MEF feeder layer and maintained itin the undifferentiated state detected its all-round identification by transplantating itinto the kidney capsule and tumor formation 4 weeks after transplantation thenanalyzed it by HE staining and nestin α-SMA and the AFP immunohistochemicalstainingWe make some endometrium injury of ICR mice models by thermal injury ontissue and observe the situation of injuried endometrium in a series of time then (3-4×105)transplant a number of undifferentiated GFP embryonic stem cells into theacute uterine cavity with acute injuried endometrium. Kill the mice and draw the 3uterine tissues in 7th day and 14th day after transplantation observe the transplantedmouse embryonic stem cells’ survival and migration directly by fluorescencemicroscopy and under the microscope after HE staining and Anti-GFP antibodyimmunohistochemical staining.Results: ES cells grew well on the MEF feeder cells as a clone-like the EGFP- EScells was observed expressing high green fluorescence under fluorescence microscopeand has teratoma formation with three germ layers markers expression nestinα-SMA and AFP when transplanted into the kidney capsule we established mousemodel with injuried endometrium successfully We transplanted a number of EGFP-ES cells into the the uterine cavity of ICR mouse with acute injuried endometrium wefound that there was a lot of shedding tissue and no specific morphology ofendometrial tissue in the cavity of uterus no repair in the uterine wall by HE stainingalso we could observe a cluster of positive round cells in the the cavity of uterine afteranti-GFP antibody immunohistochemical staining 7 days laterbut we have notobserved into positive cells migrate to the uterine wall.Conclution:ES cells grows on the MEF feeder cells in the undifferentiated state andhas all-round differentiation potential establish the endometrial damage model byusing the hot water’s thermal effect on endometrium when the undifferentiated mESCtransplanted into the acute uterine cavity with injuried endometrium mESC cansurvive in the uterine cavity。Key words: embryonic stem cells endometrium injury transplantation 4 前言 子宫是维持女性生理特征和生育功能的重要器官,而这些特征和功能是通过子宫内膜得以实现。子宫内膜分为功能层和基底层,基底层靠近子宫肌层,对月经周期中激素变化不反应,功能层是由基底层再生的增殖带,在月经周期中卵巢分泌的雌、孕激素作用下的子宫内膜,出现增生、分泌的变化,月经来潮前子宫内膜崩解、脱落,月经来潮,在卵泡分泌的雌激素作用下子宫内膜的基底层开始增生,子宫内膜能感受卵巢激素的变化而周期脱落至出血,一旦损伤基底层,至其再生能力差,对卵巢所分泌的激素不能反应,亦导致子宫内膜生长停滞或缓慢,任何造成子宫内膜损伤,使肌层裸露的创伤均可能造成官腔粘连,破坏子宫内膜引起子宫腔粘连疤痕形成,子宫内膜纤维化及疤痕化、不同程度缺失、内膜变薄、增生及分泌不足、子宫前后壁粘连、宫腔积缩小。导致子宫内膜的再生能力下降,容受性降低,表现为闭经或持续不孕。 子宫内膜损伤的主要病因1有:1)宫腔操作后如:人工流产等;2)子宫内膜感染:常见于流产或产后感染。子宫内膜损伤病理表现为子宫功能层及基底层破坏,子宫内膜无法完成自我修复,子宫腔没有内膜覆盖,前后壁可发生纤维化、瘢痕及粘连。主要临床表现为闭经或月经量过少,周期性下腹痉挛性疼痛,持续不孕或反复流产等。而目前对于内膜损伤的治疗,主要通过手术分离损伤引起的粘连、促进子宫内膜生长、防止再粘连,对一些子宫内膜破坏严重纤维化或反复宫腔粘连者,有报道2疗效不足 50,临床上针对重度子宫内膜损伤处理相当棘手。如何采取有效措施治疗子宫内膜损伤带来的妇科并发症,是临床医生关注的焦点,而治疗策略最重要的一点是促进子宫内膜再生和功能回复。随着近年来干细胞分化理论深入研究,人体内所有组织细胞都是由干细胞分化而来,干细胞应用于临床治疗的研究也越来越多,这为子宫内膜损伤治疗提供了一种新的理念。早在上世纪 70 年代就有学者提出了子宫内膜再生可能是通过干细胞介导的,随后许多实验证实了子宫内膜干细胞来源,国外报道过在接受骨髓移植的白血病女性患者中检测到来源于男性骨髓供体标记的子宫内膜细胞,提出可能骨髓源性的干细胞能分化成子宫内膜组织,参与能膜再生,并且有动物实验证实3,4。这些研究表明干细胞可能参与子宫内膜形成,干细胞可以向子宫内膜细胞分化。 5 胚胎干细胞(embryonic stem cells ES)是在生物个体的生长和发育中起“主干”作用的原始细胞,它是从附植前早期胚胎内细胞团或附植后胚胎原始生殖细胞分离克隆出来的一种具有自我复制能力、无限增殖能力和全向分化潜能的细胞群体,这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小,同时又可以在一定条件下进一步 5 。实验已证实了全能胚胎干细胞在白细胞抑制因子(leukemiainhibitory factor,LIF)存在下可维持其未分化的增殖状态,去掉 LIF 后,胚胎干细胞可在体外自发或诱导向造血细胞、心肌细胞、肌肉细胞、神经细胞、肝细胞、视网膜上皮细胞、成骨细胞、胰岛细胞、内皮细胞等方向分化,ES 细胞在细胞移植治疗中具有潜在的应用价值。 目前关于胚胎干细胞直接移植的研究已有在脊髓、骨关节、脑内、侧脑室、骨骼肌、心肌等报道。Wichterle 报道6将胚胎干细胞直接移植至小鼠脊髓可以向神经细胞分化,Wakitani7等发现将胚胎干细胞注射至小鼠膝关节后没有诱导成为关节软骨细胞,而是形成了畸胎瘤,将胚胎干细胞移植至骨软骨缺损小鼠关节内,可以形成软骨样组织。国内有人将标记好的胚胎干细胞进行大脑纹状体内移植,4 周后于移植区周围有标记细胞存活,并可检测到酪氨酸羟化酶免疫阳性的神经细胞8。还有人9将胚胎干细胞直接进行侧脑室移植后,分别 于第 2 周和4 周观察细胞人可以存活,仍有较强的增殖能力。谢模英10等实验研究表明胚胎干细胞在局部肌肉注射移植入肌营养不良模型小鼠中后可存活有明显分化。Singla 等11在对小鼠胚胎干细胞心肌梗死部位移植后追踪观察发现干细胞可以在心肌内存活并可以向心肌细胞分化。这些实验结果表明胚胎干细胞具有分化成具体细胞的能力,特定的组织微环境对其定向分化有诱导作用12。因此我们设想通过首先建立子宫内膜损伤模型,将胚胎干细胞于其宫腔内移植,观察其在子宫内膜损伤子宫内微环境的存活,分化情况,为进一步研究干细胞治疗子宫内膜损伤奠定基础。 研究的内容包括:(一) 制备小鼠胚胎干细胞悬液;(二) 建立 ICR 小鼠子宫内膜损伤模型;(三) 将未分化的小鼠 ES 细胞移植至模型小鼠宫腔内,以了解其存活和迁徙情况。 6 材料与方法一、 实验研究技术路线 本研究总体上分为三大步骤。第一步:制备小鼠胚胎干细胞悬液;第二步 制备小鼠子宫内膜损伤模型;第三步:将未分化的小鼠胚胎干细胞移植至内膜 损伤模型小鼠宫腔内,通过直接荧光显微镜观察和免疫组化染色后显微镜下观 察 ES 细胞的存活和迁移情况,具体技术路线参见下图。 制备小鼠胚胎干细胞悬液 制备子宫内膜损伤模型 胚胎干细胞移植入子宫内 膜损伤小鼠宫腔内 移植后 14d 观察 直 接 H 免 观 E 疫 察 染 组 色 化二、 主要实验材料(一) 主要仪器设备1. 水平层流洁净操作台(CBH-1000A,上海瑞仰净化装备公司)2. 超低温冰箱(U410-86,NBS 公司)3. 电热恒温水箱(DK-8D,上海精宏实验设备有限公司)4. 恒温磁力搅拌器(90-2, D7411,Barnstead 公司)6. 超声波清洗机上海亚荣生化仪器厂)5. 超纯水仪( (KQ-3200E,昆山市超声波仪器有限公司)7. 电热恒温鼓风干燥箱(DGG-9070A,上海森信实验仪器公司)8. 倒置显微镜(ELW N.A.0.30,Olympus) 79. 数码相机(Sony DSC-W80)10. 石蜡切片机(Germany LEITZ 1512)11. 显微数码摄影系统(Olympus DP-50 图像采集系统)12. 二氧化碳培养箱(2323-2,shellab 公司)13. 生物净化工作台(BCN-1000,苏州净化设备有限公司)14. 微量移液器(Eppendorf)15. 25 ul 微量注射器(鸽牌,欣悦玻璃仪器有限公司)16. 一次性使用静脉留置针(REF388614,苏州碧迪医疗器械有限公司)17. 50ml 玻璃注射器(上海医疗器械有限公司)18. 手术器械:眼科剪、镊(上海浦伦医疗器械有限公司)19. Poly 防脱玻片(中杉金桥)20. 其他仪器和耗材:0.22μm 一次性过滤除菌器、塑料一次性细胞冻存管、程序化冻存盒、塑料一次性移液管、塑料一次性细胞培养皿、塑料一次性离心管、玻璃和一次性注射器、自制推进器。(二) 主要试剂1. DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medvurn, Chemicon)2. FBS Fetal Bovine Serum,Chemicon3. L –谷氨酰胺L-Glutamin Chemicon4. β 巯基乙醇 β-2-MercaptoethanChemicon)5. 核苷酸NocleosideChemicon)6. ES quailified 0.25Trypsin 0.03EDTA Chemicon7. NEAA non-essential amino acid Chemicon8. 细胞培养用 1×PBS (Hyclone)9. DMSO 二甲基亚砜,Sigma 公司10. 双抗(Chemicon)11. 丝裂霉素 C(Roche)12. LIF 白血病抑制因子Chemicon)13. 戊巴比妥纳(Sigma)14. 生理盐水(001034,福州海王制药有限公司)15. 免疫组化染色试剂盒(SP-9000 中杉金桥) 816. DAB 显色试剂盒ZLI-9032 中杉金桥17. 兔抗人 α-甲胎蛋白多克隆抗体 (ZA-0008 中杉金桥)18. 兔抗平滑肌肌动蛋白单克隆抗体 (RB-9010-P0 Thermo 公司)19. 兔抗神经巢蛋白抗体(BA1289 博士德)20. 兔抗 GFP 抗体 (AG-279 碧云天)21. 枸橼酸盐缓冲液(中杉金桥)22. PBS (中 杉金桥)23. 胰酶修复液(ZLI-9010 中杉金桥)(三) 主要试剂的配制1. ESC 标准培养液的配制(15ml)(1)取 DMEM 溶液 11.25 ml 放入一 15ml 无内毒素一次性离心管内;(2)加入 FBS 1 ml,混匀;(3)加入 β 巯基乙醇 0.15 ml,混匀;(4)加入 L –谷氨酰胺 0.15 ml,混匀;(5)加入核苷酸 0.15 ml,混匀;(6)加入 NEAA 0.15 ml,混匀;(7)加入双抗 0.15 ml,混匀;(8)加入 LIF,终浓度为 1000U/ml,混匀。放入 4?保存备用,使用前 37?培养箱平衡温度和 PH 值。2. 小鼠成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblast,MEF)培养液的配置50ml(1)取 DMEM 溶液 45 ml 放入一 50ml 无内毒素一次性离心管内;(2)加入 FBS 5 ml 于上述溶液中,混匀;(3)加入 L –谷氨酰胺 0.5 ml,混匀;(4)加入双抗 0.5 ml,混匀。4?保存备用,使用前 37?培养箱平衡温度和 PH值;3. MEF 冻存液的配制(10ml)(1)取 DMEM 溶液 6.8 ml 放入一 15ml 无内毒素一次性离心管内;(2)加入 FBS 1 ml 于上述溶液中,混匀;(3)加入 L –谷氨酰胺 0.1ml,混匀;(4)加入双抗 0.1 ml,混匀; 9(5)加入 DMSO 2ml,混匀。放入 4?保存备用。 )取 DMEM 溶液 8.3 ml 放入一 15ml 无内4. 丝裂霉素液的配制(20μg /ml)(1 毒素一次性离心管内;(2)加入 FBS 1 ml 于上述溶液中,混匀;(3)加入 L –谷氨酰胺 0.1 ml,混匀;(4)加入双抗 0.1 ml,混匀;(5)避光操作,加入丝裂霉素,使其终浓度为 20μg /ml,混匀,用锡箔纸包好,放入 4?保存备用,使用前 37?培养箱平衡温度和 PH 值。5. PBS 配制:8.0g NaCl,0.2g KCl,2.16g 0.2g KH2 PO4, 900ml 在超纯水中依次加入上述试剂后,搅拌Na2HPO4.12H2O, 使其溶解,测定 PH 值为 7.4,用超纯水定容至 1L,高压灭菌 20min。6. 4多聚甲醛固定液: 称取多聚甲醛粉末 8g 溶于 200ml PBSPH 7.4,在水浴中加热至 80?后,加热搅拌至完全溶解,倒入容量瓶中加 PBS 定容至 200ml,分装,-20?保存备用。7.细胞消化液:0.25胰蛋白酶,0.03EDTA,过滤除菌,4?贮存备用。8.2戊巴比妥钠:称取戊巴比妥钠粉末 0.2g,溶于 10ml 三蒸水中,混匀,4?保存备用。(四)实验动物及胚胎干细胞1. ICR 小鼠,周龄 16-20 周,SPF 级,获赠于福建医科大学细胞与发育中心;2. EGFP ES 细胞一株,获赠于福建医科大学细胞与发育中心(携带有 EGFP 基因的源于 129S1 小鼠的胚胎干细胞系)。三. 实验方法实验一 mESC 培养、全能性鉴定及 ES 细胞悬液制备 本实验分为三个部分:1.MEF 培养以制备 ES 细胞饲养层细胞;2. ES 细胞的培养和增殖;3.ES 细胞体内分化实验:ES 细胞悬液肾被膜下移植,移植后形成的肿物 HE 染色及三胚胎层免疫组化染色观察以鉴定其全能性。 实验中所用的材料及试剂配制:(见上)。 实验对象:ICR .
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