钙离子载体A23187联合嘌呤霉素激活行卵母细胞质内单精子注射后未受精卵母细胞的研究

钙离子载体A23187联合嘌呤霉素激活行卵母细胞质内单精子注射后未受精卵母细胞的研究 钙离子载体A23187联合嘌呤霉素激活行卵母细胞质内单精子注射后未受精卵母细胞 的研究 - 182-中华妇产科杂志2006年3月第41卷第3期ChinJObsmtGynecol.March2006.VoL41…N0_3 钙离子载体A23187联合嘌呤霉素激活 行卵母细胞质内单精子注射后 未受精卵母细胞的研究 鹿群陈子江高选马水英李梅胡京关李媛 【摘要】目的观察钙离子载体A23187联合嘌呤霉素对卵母细胞质内单精子注射(ICSI)后未 受精卵母细胞的激活作用.方法将体外成熟(IVM).ICSI和常规ICSI后未受精卵母细胞,按行ICSI 后体外培养的时间,分为IVM-ICSI22h组(33个),IVM—ICSI44h组(18个),ICSI44h组(37个), ICSI68h组(25个),分别采用钙离子载体A23187联合嘌呤霉素进行激活处理.应用荧光原位杂交 (FISH)技术,对来源于双原核合并第二极体合子的激活胚胎进行性染色体分析.结果钙离子载体 A23187联合嘌呤霉素能激活行ICSI后22—68h未受精的卵母细胞.其中IVM-ICSI22h组卵母细胞 激活率为88%(29/33),总卵裂率为62%(18/29),4细胞阶段胚胎发育率为28%(5/18),1个胚胎发 ,ICS144h组,ICSI68h组的未受精卵母细胞激育到桑椹胚阶段;而IVM-ICSI44h组 活率分别为 56%(10/18),65%(24/37),52%(13/25);总卵裂率分别为 20%(2/10),42%(10/24),46%(6/13), 仅ICSI44h组有1个胚胎发育到4细胞阶段.FISH对激活胚胎的分析显示,4个胚 胎为XX,9个胚 胎为XY.结论钙离子裁体A23187联合嘌呤霉素能有效激活行ICSI失败的卵母细 胞;行ICSI后 22h内,是对未受精卵母细胞进行辅助激活较为理想的时机.激活的双原核合并第 二极体胚胎中有 雄原核的存在. 【关键词】卵母细胞;卡西霉素;嘌呤霉索;精子注射,细胞质内;原位杂交,荧光 Oocyteactivationwithcalci11111ionophoreA23187andpuromycinonhumanoocytesthatfailto fertilize8fterlntracytoplasmlcspermin~ectionLUQun,CHENZi-jiang,GAOXuan,MAShui—ying, LIMei,HUring— mei,LIYuar~ReproductiveMedicineCenter,ShandongPr~incialHospital.Shandong University,Mn25DD2,China Correspondingauthor:cHZi-jiang(Email:chenzifiang@hotmail.com) 【Abstract】 ObjectiveToinvestigatetheeffectofassistedoocyteactivationwithcalciumionophore A23187andpuromycinonhumanoocyte8thatfailtofertilizeafterintracytoplasmicsperminjectionfICSI). MethodsA1l113discardedooofte8thatshowednoevidenceoffertilizationat16— 18hoursafterinvitro maturation(IVM)-ICSIcyclesandconventionalICS1wereassignedtofourgroupsaccordingtothetimeafter ICSI:1VM-ICSI22?hourgroup(n=33),1VM—ICSI44一hourgroup(n=18),ICSI44一 hourgroup(n=37) andICSI68-hourgroup(n=25).仙 unfe}rtilizedoocyteswereexposedtocalciumionophoreA23187 (5Ixmo]/L)for5minutesandsubsequentlyincubatedwithpuromycin(10m1)for4hours.After incubation,theoocyteswereculturedinvitrofor3— 5days.Theactivationrate.proportionofoocyte8that showedpronucleusformationandcleavageratewerecalculated幽 eractivation.Sexchromosomalanalysis wasperformedbydualcolorfluorescenceinsituhybridization(FIsH)ontheembryosthatdisplayedtwo pmnucleiandasecondpolarbody.ResultsThecombinationofcalciumionophoreA23187withpuromycin couldactivatetheunfertilizedoocytes22— 68hoursaflerICSI.BestresultswereachievedinIVM—ICSI22一 hourgroup,whichelicited88%(29/33)ofactivationrate,62%(18/29)ofcleavagerateand28%(5/ 18)of4-cellembryos.Oneembryointhisgroupdevelopedtothemorularstage.Theactivationrateand developmentalpotentialoftheactivatedembryosinIVM—ICSI44-hourgroup. ICSI44.hourgroupandICSI 68一 hourgroupdecreased.FISHanalysisshowed4embryoswithXXand9embryoswithXYin16embry0s. 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30470703) 作者单位:250021济南,山东大学山东省立医院生殖医学中心[鹿群(现在北京大学 人民医院生殖医学中心 100044)] 通信作者:陈子江(Email:chenzijiang@hotmail.corn) . 基础研究 中华妇产科杂志2006年3月第41卷第3期 ChinJObstetGvnccol,March2006.Vo1.41.No.3 ConclusionsThecombinationofcalciumionophoreA23187withpuromycincouldeffective lyactivate unfertilizedoocytes22— 68hoursafterICSI.TheculturedtimeofunfertilizedooeytesafterICSIaffects activationefficiencyanddevelopmentalpotentialoftheactivatedembryos.Theactivatedzy gotesthatdisplay twopronucleiandasecondpolarbodycandevdopnormally. 【Keywords】 Oocytes;Calcimycin;Puromycin;Sperminjections,intracytoplasmic;Insitu hybridization,fluorescence 卵母细胞激活是受精的关键环节之一,激活失 败是导致卵母细胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperminjection,ICSI)受精失败的主要原因….有 学者认为,采用适当的措施激活行ICSI后未受精的 卵母细胞,可以促其正常发育,形成囊胚.本研 究自2003年8月至2004年6月,观察钙离子载体 A23187(calciumionophoreA23187)联合嘌呤霉素 (puromycin)对行ICSI后未受精卵母细胞的激活作 用;并通过荧光原位杂交(fluorescenceinsitu hybridization,FISH)技术,分析被激活胚胎的性染 色体,进而探讨钙离子载体A23187联合嘌呤霉素 作为行ICSI失败后辅助激活措施的可行性,为该技 术应用于临床提供必要的实验依据. 材料与方法 一 ,未受精卵母细胞的来源 未受精卵母细胞的来源一是体外成熟(invitro maturation,IVM).ICSI后未受精的卵母细胞,二是 常规行ICSI后未受精的卵母细胞.本研究经山东 省立医院生殖医学中心伦理学委员会批准;纳入本 研究的患者均签订了知情同意书,自愿捐献给本研 究行ICSI后未受精的卵母细胞共129个. 1.行IVM.ICSI后未受精卵母细胞:来源于山东 省立医院生殖医学中心就诊的多囊卵巢综合征患 者,均于自然周期行未成熟卵泡穿刺.获得的未成 熟卵母细胞在体外培养成熟后,行ICSI.行ICSI 16—18h后,在倒置显微镜下观察卵母细胞是否有 原核形成,将未见原核和第二极体的卵母细胞定为 未受精卵母细胞_4J.收集行ICSI22h及以后仍未 受精且卵母细胞质内无明显空泡及碎片,形态正常 的卵母细胞,共67个.根据行ICSI后体外培养的 不同时间,对67个卵母细胞进行分组,行IVM—ICSI 22h卵母细胞33个(IVM.ICSI22h组),行IVM- ICSI44h卵母细胞18个(IVM-ICSI44h组),行 IVM.ICSI后22h,随机选取16个未受精的卵母细 胞作为对照(对照组). 2.行ICSI未受精卵母细胞:来源于山东省立医 院生殖医学中心就诊的不孕症患者,均因男方严重 少弱精子症或阻塞性无精子症,女方常规检查未发 现明显异常.采用常规超促排卵,ICSI辅助授 精.收集行ICSI44h后仍未受精,形态正常的卵母 细胞,共62个.根据行ICSI后体外培养的不同时 间,对62个卵母细胞进行分组,行ICSI44h卵母细 胞37个(ICSI44h组),行ICSI68h卵母细胞25个 (ICSI68h组). 二,方法 1.卵母细胞激活及激活判定:将未受精卵母细 胞置于含5I~mol/L钙离子载体A23187(美国Sigma 公司产品)的人类输卵管液(humantubalfluid medium,HTF;美国IrvineScientific公司产品)中, 37?避光放置5min.经HTF洗涤5次后,置于含 1Og/ml嘌呤霉素(经二甲基亚砜溶解,均为美国 Sigma公司产品)的HTF中,在37?,5%CO:培养 箱中培养4h(即激活处理).对照组未受精卵母细 胞直接置于含0.1%二甲基亚砜的HTF中培养4h. 在未受精卵母细胞激活处理16,18h后,在倒置显 微镜下观察,记录第二极体排出及原核形成的情况. 以未受精卵母细胞中出现原核或卵裂(含细胞核) 判定为激活J.根据未受精卵母细胞判定时原核 及第二极体排出的情况不同,激活类型分为:单原核 合并第二极体合子,双原核合并第二极体合子,三原 核合子及即刻卵裂胚胎.将被激活的胚胎分别置于 培养液G1.3,G2.3(瑞典Vitrolife公司产品)中,进 行序贯培养. 2.性染色体分析:采用FISH技术,对被激活的 胚胎进行性染色体分析.探针为人x染色体着丝 粒区域特异d.卫星DNA(DXZ1)和Y染色体长臂特 异重复序列(DYZ1),分别用异硫氰酸荧光素 (FITC)及得克萨斯红(TexasRed,美国Vysis公司产 品)直接标记探针.操作步骤参见试剂盒说明.当 细胞内同时出现1个红色,1个绿色信号时,诊断为 男性胚胎细胞(XY);当细胞内同时出现2个绿色信 号时,诊断为女性胚胎细胞(XX). 三,统计学方法 采用SPSS10.0统计分析软件.对未受精卵母 细胞的激活率,卵裂率等进行Fisher检验或x 检验. 结果 中华妇产科杂志2006年3月第4l卷第3期 ChinJObstetGynecol,March2006,Vo1.41,No.3 一 ,行IVM—ICSI后未受精卵母细胞的激活情况 VM-ICSI22h组的未受精卵母细胞激活率为 显着高于IVM-ICSI44h组及对照组,与IVM. 4h组及对照组分别比较,差异均有统计学意 <0.05,P<0.01).激活类型以双原核合并第 合子为主,IVM-ICSI22h组,IVM-ICSI44h IlJ为59%,60%.IVM-ICSI22h组中,双原核 二极体合子的卵裂率显着高于单原核合并第 本合子,两者比较,差异有统计学意义(P< .随着行ICSI后体外培养时间的延长,未受 }细胞的激活率,卵裂率和胚胎发育总体呈下 争,见1.IVM-ICSI22h组总卵裂率为62% 9),4细胞阶段胚胎发育率为28%(5/18),1 台发育到桑椹胚阶段(图1).而IVM.ICSI44h 日裂率为20%(2/10),多数胚胎发育停滞在 丑胞阶段. 二,行ICSI后未受精卵母细胞的激活情况 ICSI44h组及ICSI68h组的未受精卵母细胞 激活率分别为65%,52%;激活类型以双原核合并 第二极体合子为主,分别为42%,54%;ICSI44h组 及ICSI68h组的总卵裂率分别为42%(10/24), 46%(6/13),两组的激活率,总卵裂率比较,差异均 无统计学意义(P>0.05),见表2.ICSI44h组, IcsI68h组未受精卵母细胞激活后胚胎发育潜能 差,仅ICSI44h组有1个胚胎发育到4细胞阶段. 三,激活胚胎的性染色体分析结果 对16个来源于双原核合并第二极体合子的激 活胚胎进行FISH检查.获得34个卵裂球,检测了 29个卵裂球.有25个卵裂球有杂交信号,杂交率 为86%(25/29),3个胚胎无杂交信号.4个胚胎为 XX,9个胚胎为XY,其中1个胚胎出现性染色体嵌 合现象,表现为XY,XO.因此,性染色体正常的胚 胎有12个,占75%(12/16),见图2. IVM—ICSI22h组钙离子载体A23187联合嘌呤霉素激活的未受精卵母细胞发育 过程.A:未受精卵母细胞B:激活后形成的第二极 c:发育形成的2细胞胚胎D:发育形成的桑椹胚 表1行IVM-ICSI后各组未受精卵母细胞的激活情况 卵母塑堡 个数 单原核合并第二极体合子双原核合并第二极体合子 个数个数 三:厦核墅型墅堕 笨个数幂聂个数 :SI 组3329886211 :SI 组l8lO564400 ll6l6000 066022/6000 011/100000 :与IVM-ICSI44h组比较,P<O.05,与对照组比较,P<O.Ol;#与单原核合并第二 极体合子的卵裂率比较,P<O.05;?例数少于 计算百分率 表2行ICSI后各组未受精卵母细胞的激活情况 例数少于lO例,不计算百分率 中华妇产科杂志2006年3月第4l卷第3期 ChinJObstetGynecol,March2006,Vo1.41.No.3 图2被激活胚胎的性染色体.A:核型为XXB:核型为XY (红色表示Y,绿色表示X) 讨论 一 ,钙离子载体A23187联合嘌呤霉素对人卵母 细胞的激活作用 钙离子载体A23187是最常用的人工激活剂之 一 ,通过钙离子的跨膜转运,使卵母细胞内迅速形成 单脉冲性钙波,使成熟促进因子(metaphase—promoting factor,MPF)和丝裂原激活蛋白激酶等短暂下降,导 致卵母细胞不完全激活J.嘌呤霉素是蛋白质合成 抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂,其作用机制可能是通过 抑制MPF和丝裂原激活蛋白激酶等相关蛋白质的合 成和磷酸化,弥补钙离子载体A23187的不足,使MPF 水平维持在低水平,诱导卵母细胞激活J.钙离子载 体A23187与嘌呤霉素联合应用,能促使体外受精失 败的人卵母细胞排出第二极体,形成单倍体的孤雌胚 胎].因此,理论上钙离子载体A23187联合嘌呤霉 素激活方案适于行ICSI后进行卵母细胞激活.本研 究结果显示,钙离子载体A23187与嘌呤霉素联合应 用,对行IVM—ICSI和ICSI后不同体外培养时间的卵 母细胞均有激活作用,卵母细胞激活率均在52%以 上,与有关文献报道结果相似M. 本研究发现,双原核合并第二极体合子的卵裂率 高于单原核合并第二极体合子.IVM—ICSI22h组中 有1个胚胎发育到桑椹胚阶段.可见,双原核仍然是 选择激活胚胎继续培养的主要指标. 二,钙离子载体A23187联合嘌呤霉素对人卵母 细胞激活的时机 人卵母细胞辅助激活的最佳时机尚不十分明 确"].目前,ICSI联合卵母细胞激活技术应用于临床 并获得妊娠的个案报道,均是在行ICSI后2h内实施 激活刺激].本研究结果显示,随着体外培养时间 的延长,卵母细胞激活率,卵裂率,胚胎发育潜能呈明 显下降趋势.IVM—ICSI22h组的未受精卵母细胞的 激活率,卵裂率及胚胎发育潜能显着高于ICSI44h 组及ICSI68h组.提示,行ICSI22h以后的未受精 卵母细胞的功能可能已经发生了退化.但IVM—ICSI 22h组的未受精卵母细胞激活率高达88%,与有关 文献报道的行ICSI后2h内的卵母细胞激活率相 近.表明行ICSI后的22h内,仍然是较为理想的 激活处理时机. 三,分析激活胚胎l生染色体的意义 本研究通过FISH技术,对l6个来源于双原核合 并第二极体合子的被激活胚胎进行性染色体分析,发 现9个胚胎为XY,4个胚胎为XX,并且XY型胚胎在 检测胚胎中所占的比例,与正常受精过程中的比例基 本接近.证实激活的双原核合并第二极体合子中Y ,钙离子载体A23187联合嘌呤 染色体的存在.提示 霉素的激活方式,能有效促进精子形成雄原核.因 此,可以初步排除胚胎是由孤雌激活发育而来的可能 性.这对于明确钙离子载体A23187联合嘌呤霉素的 激活方式的临床应用价值,有重要意义. 总之,本研究初步证实了小剂量钙离子载体 A23187联合嘌呤霉素能激活行ICSI后未受精的卵 母细胞,但其对胚胎的毒性,致畸l生及致突变性等问 题,有待深入研究. 参考文献 1RaweVY.OlmedoSB,NodarFN,eta1.Cytoskeletalorganization defectsandabortiveactivationinhumalloocytesafterIVFandICSI failure.MolHumReprod.2000,6:510-516. 2YamanoS,NakagawaK,NakagawaH,etaLFertilizationfailure andoocyteactivation.JMedInvest,2000,47:1-8. 3陈子江,李媛,赵力新,等.超声下未成熟卵泡抽吸术治疗多囊 卵巢综合征不孕的临床研究.中华妇产科杂志,2005,40:295- 298. 4NakagawaK,YamanoS,MorideN,etaLEffectofactivationwith CaionophoreA23187andpuromycinonthedevelopmentofhuman oocytesthatfailedtofertilizeafterintracytoplasmicsperminjection. 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