关于血清的一些问题

实验室里常会遇到的关于血清的问题 1.血清的运用领域 血清:离体的血液凝固之后,经血凝块聚缩释出的液体,即血清。血清可以抗病毒,增强抵抗力血清属于生物制剂.小牛血清含在离开母体后自身产生的一些代谢物质,当然也包括一些生长激素,而胎牛血清绝大部分的物质来自于母体。 血液凝固析出的淡黄色透明液体。如将血液自血管内抽出,放入试管中,不加抗凝剂,则凝血反应被激活,血液迅速凝固,形成胶冻。凝血块收缩,其周围所析出之淡黄色透明液体即为血清,也可于凝血后经离心取得。 在凝血过程中,纤维蛋白原转变成纤维蛋白块,所以血清中无纤维蛋白原,这一点是与血浆最大的区别。而在凝血反应中,血小板释放出许多物质,各凝血因子也都发生了变化。这些成分都留在血清中并继续发生变化,如凝血酶原变成凝血酶,并随血清存放时间逐渐减少以至消失。这些也都是与血浆区别之处。但大量未参加凝血反应的物质则与血浆基本相同。 为避免抗凝剂的干扰,血液中许多化学成分的分析,都以血清为样品。 血清(serum)细胞培养的发展,培养基的质量又是关键,而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。 在动物血清的应用中牛血清又是最为广泛的,所以血清是医药生物技术产品中重要的原之一。保证血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节。 1.血清种类:目前用于组织培养的血清主要是牛血清,培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因:来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的,但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。 牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛;新牛血清取自出生24小时之内的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。显然,胎牛血清是品质最高的,因为胎牛还未接触外界,血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。 2.血清的主要成分:血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已知,但还有一部分尚不清楚,且血清组成及含量常随 - 1 - 供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等,这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。对血清的成分和作用的研究虽有很大进展,但仍存在一些问题。主要是: 第一:血清的成份可能有几百种之多,目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚,尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识,这给研究工作带来许多困难; 第二:血清都是批量生产,各批量之间差异很大,而且血清保存期至多一年,因此,要保证每批血清的相似性极为困难,从而使实验的化和连续性受到限制; 第三:不能排除血清中含有易变物质,这被认为是“瓶中恶化”的原因之一。 3.血清主要作用: ●提供基本营养物质:氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等,是细胞生长必须的物质。 ●提供激素和各种生长因子:胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的松、地塞米松)、类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)等。生长因子如成纤维细胞生长因子、皮生长因子、血小板生长因子等。 ●提供结合蛋白:结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质,如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等,转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。 ●提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。 ●对培养中的细胞起到某些保护作用:有一些细胞,如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用。这种作用是偶然发现的,现在则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。 血清蛋白形成了血清的粘度,可以保护细胞免受机械损伤,特别是在悬浮培养搅拌时,粘度起到重要作用。 血清还含有一些微量元素和离子,他们在代谢解毒中起重要作用,如SeO3,硒等 2.保存血清最好的方法? 我们建议血清应保存在-5℃至-2O℃。然而,若存放于4℃时,请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶,建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放 回冷冻。 3.收到的血清部分或完全融化,该怎么办? 将FBS置于4°C或室温使其完全融化,轻轻摇动血清瓶使血清混合均匀后重新置于-20°C冻结,血清品质不会收到影响。 4.培养基中添加了血清和抗生素后,可长期保存吗? 一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。 5.如何解冻血清才不会使产品质量受损? 我们建议您将血清从冷冻箱取出后,先置于2~8℃冰箱使之融解,然后在室温下使之全融。但必须注意的是,融解过程中必须规则地摇晃均匀。 长时间储存在2-8℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。因此,推荐在-20℃以下储存血清,并避免反复冻融。 解冻血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。请勿将血清置于37℃太久。 若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量。 6.血清融化后含有沉淀,是怎么回事? 该沉淀是血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)聚集形成的凝块,这是血清的正常特性,不影响血清的品质,可以静置使其自行沉淀或离心后使用。 7.血清解冻后发现有絮状沉淀物出现,该如何处理? 沉淀包含纤维蛋白和脂蛋白。这是正常特性,不会影响产品性质。 血清中沉淀物的出现有许多种原因,但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成,而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后,也会存在于血清中,亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物,并不影响血清本身的质量。 若您欲去除这些絮状沉淀物,可以将血清分装至无菌离心管内,以400g,1-2分钟稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物,因为它可能会阻塞您的过滤膜。 大多情况轻轻摇动沉淀并加热至37℃就会再溶解。所以,使用产品时要摇动并加热血清至37℃,沉淀会自然消失。 8.血清瓶底有果冻样物质,如何处理? 不当的血清灭活操作(灭活的温度,时间以及温度的均一性)会使血清中的蛋白降解,在血清瓶底部聚集形成果冻样成分。该血清不能继续使用,建议丢弃。 9.如何避免沉淀? 按如下操作可避免沉淀的产生: (1)解冻血清时,请随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。 (2) 血清分装冻存时,须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一。 (3) 勿直接由-20℃直接至37℃解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。 (4) 勿将血清置于37℃太久,否则血清会变得浑浊,同时血清中许多较不稳定的成份也会因此受到破坏,从而影响血清的品质。 (5) 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。 (6) 若必须做血清的热灭活,请遵守56℃,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。 10.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀? 胎牛血清没有预老化,储存在2-8℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这 应该不会影响血清的质量。 推荐在-20℃储存胎牛血清,避免反复冻融。 血清在贮存解冻过程中会产生沉淀,这是由于血清中含有大量脂蛋白、 纤维蛋白及多肽类物质,在-15℃冷冻保存解冻后就会自然形成沉淀,随着保存时间的延长,沉淀量会增加。 因此在融化血清时一般应先在4℃放置使之解冻,然后放在室温使血清完全融化,以避免沉淀的增加。 添加血清时应避免把沉淀加入培养液,否则由于沉淀的存在会使得所培养的细胞产生大量黑点,或者细胞表面将会覆盖一层油状物质,影响细胞的正常生长。为减少血清的损失,可以把有沉淀的血清收集起来进行离心处理,将上清液加入培养液使用(一般不建议采用过滤的方法除去沉淀,因为沉淀会堵塞滤膜而无法过滤)。 11.如何避免沉淀物的产生? 我们建议您在使用血清的时候,注意下列的操作: 解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃),实验显示非常容易产生沉淀物。 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。 若必须做血清的热灭活,请遵守56℃,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。 12.伽马射线辐照对于牛血清制品中各种病原微生物的灭活效果 通常情况下,胎牛血清是采自无动物疾病的牛群,经过连续三次0.1 微米孔径滤膜的除菌过滤后获得,而小牛血清采用的是0.2 微米孔径的滤膜过滤。病原微生物的检测方法通常为酶联法。但是仅仅经由除菌过滤的牛血清在生物安全性方面,具有以下不足之处: a) 尺寸小于0.2微米(或0.1微米)的微生物,无法滤除; b) 酶联法检测结果阴性,不一定代表完全没有病原微生物的存在;如果存在病原微生物但是没有达到酶联法检测的灵敏度下限,同样显示为阴性结果; c) 其他未知的病原微生物也可能存在(检测种类以外的其他病原微生物) 伽马射线辐照在除菌过滤的基础上,进一步降低了微量病原微生物的存在可能性,为牛血清的“清洁和安全”打上了双保险,符合各种生物制品的安全要求。 辐照对于各种具有代表性的病原微生物的灭活效果统计,详见下表(辐照剂量25~35kGy): 名称种属微生物大小灭活效果(对数减少量Log reduction) 大肠杆菌革兰氏阴性杆菌 1.5-4.0 um > 6 短小芽孢杆菌革兰氏阳性杆菌, 芽孢0.6-2.5 um > 6 白色念珠菌真菌(二相性) 2-3 um > 6 Acholeplasma laidlawii 支原体0.3-0.8 um > 8 JH Strauss 噬菌体24-26 nm 1 牛病毒性下痢病毒披膜病毒单链RNA包膜病毒30-60 nm 6 牛副流感病毒3型副粘液病毒单链RNA包膜病毒100-250 nm 6 牛传染性鼻支气管炎病毒疱疹病毒双链DNA包膜病毒100 nm 5 牛蓝舌病病毒环状病毒双链DNA 60-80 nm > 3 猫白血病病毒逆转录酶病毒100-120 nm > 3 小鼠微小病毒细小病毒单链DNA非包膜病毒25 nm 2 猪细小病毒 经由伽马辐照的牛血清产品,对比没有经过辐照的同一批号的牛血清产品,其促细胞生长性能不受影响。 SAFC Biosciences的 SER-TAIN TM伽马辐照处理技术,是经由美国FDA验证的技术,每个操作步骤都经过严格验证(包装方式、辐照剂量计算、辐照时间、温度控制等环节),确保每一次、每一批的牛血清都经过标准化的辐照处理,从而确保辐照效果的一致性和稳定性。 13.为什么要热灭活血清? 加热可以灭活补体系统。 激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究,培养ES细胞,昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。 14.有必要做热灭活吗? 实验显示,经过正确处理的热灭活血清,对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进,或完全没有任何作用,甚至通常因为高温处理影响了血清的质量,而造成细胞生长速率的降低。 而经过热处理的血清,沉淀物的形成会显著的增多,这些沉淀物在倒置显微镜下观察,像是“小黑点”,常常会让研究者误以为是血清遭受污染,而把血清放在37℃环境中,又会使此沉淀物更增多,使研究者误认为是微生物的分裂扩 增。 常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间,而时间则从15分钟到60分钟不等,其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。看看你养的细胞是什么,一般的话估计问题不大,要是很珍贵的细胞还是慎重一点啊。 热灭活目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质, 在对补体灭活以外,热处理同时也对血清中可能存在的支原体具有灭活作用。 若非必须,可以不需要做热处理这一步。不但节省时间,更确保血清的质量。此外,有研究结果证实热灭活步骤减弱了胎牛血清和小牛血清对细胞的促粘附作用。 15.细胞培养中出现黑点是污染吗?如何处理? 一旦您在细胞培养的过程中发现有黑点生成, 首先,要肉眼观察培养基是否混浊, 然后,在镜下观察培养细胞生长的状态,黑点是否游动。 如果细胞被污染,微生物则会大量繁殖,培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括细菌污染、支原体污染等。 如果在镜下观察细胞,生长状态良好,与黑点出现前相比,没有任何变化,那么,黑点的出现可能与以下几种情况有关: (1)细胞生长过老,破碎的细胞残骸; (2)血清质量不好,反复冻融的结果; (3)配制培养基的pH值偏高,不宜细胞生长; (4)配制培养基的水质、容器不合格。可应用离心、过滤的方法去除这些黑点; (5)培养原代细胞中出现小黑点,可能是原代组织中的杂质,多次传代可以消除。 16.细胞培养中如何防止黑点? (1) 尽可能地减少血清冻融次数。 (2) 培养基无需37℃水浴。 (3) 培养基保持最佳PH值7.0- 7.2。 (4) 严格控制配制培养基的水质,容器定期刷洗。 (5) 掌握细胞传代的最佳时机,细胞切勿生长过老。 17.融化后血清的颜色和之前用过的血清颜色不一致是什么原因? 正常的血清颜色是澄清透明的琥珀色,不同批次的血清由于血红蛋白含量的不同颜色会有深浅差异,颜色不会影响血清品质。 18.牛血清对细胞及病毒滴度的影响 血清是一种成分复杂的混合物,不同批次血清对细胞生长的促进作用不同。大规模细胞培养中由血清引起的细胞生长状态不佳及病毒滴度的影响表现在以下几个方面: 1、细胞生长速度缓慢,长满单层时间长;从同一细胞瓶中分出两瓶细胞, 用同一种培养液,分别加入10%的对照血清和待检血清,在相同条件下培养72小时,会出现对照血清长满单层,而待检血清大约只有60~70%,这种血清就不适合用来大规模培养细胞。 2、细胞传代后形态不正常,细胞状态发生变化;由于血清的质量问题, 使原本状态正常的细胞经传代后形态会变差;比如:细胞瓶里会出现一些蠕动的小黑点(并非污染),或者细胞表面形成一层油状覆盖物;细胞的轮廓变得模糊,细胞之间的间隙被血清中的蛋白颗粒填充,从而影响细胞向四周扩展生长。 3、细胞传几代后就出现脱壁现象,不能连续传代;质量较差的血清缺 乏某种细胞的贴壁因子,会使细胞在传代过程中逐渐丧失贴壁的能力。细胞会从正常的贴壁状态,边缘开始萎缩,上翘。观察到的现象就是细胞表面不光滑,晃动细胞瓶会看到细胞表面有絮状物随培养液波动。随着传代次数增加,细胞萎缩的情况越来越严重,直到最终完全脱壁而死亡。 4、细胞长的很好,致密的单层,状态也很正常,但是接毒后细胞基本不发生病变,做滴度检测几乎测不出抗原滴度。这种情况也许是因为 血清中含有与接种的病毒有同源的特异性抗体。比如血清中经常会存在乙脑抗体,牛腹泻病毒抗体等,如果存在这些抗体,就会把接进去的病毒给中和掉。如果抗体滴度很高,病毒会被抗体完全中和,就没有病毒颗粒在细胞中增殖,所以会检测不到病毒滴度。这种情况给疫苗企业造成的损失是相当大的,不产毒等于前面所做的那么多工作全部白费,浪费人力、物力,尤其是时间上的浪费,从 培养细胞开始到接病毒,到收液至少需要一两个月,一旦出现不产毒的情况,那么这一两月时间就白白浪费掉了,这也是牛血清给疫苗企业造成的风险之一。 5、细胞生长的状态一般,产毒少,毒价低。这种情况比较常见,细胞是 病毒的载体,由于血清质量不好,导致细胞生长状态不好,病毒就无法进行正常的复制。并非所有病毒都不能复制,所以就造成疫苗的效价不够,可能造成不合格产品。 19.牛血清给生物制品带来的问题 对于使用传统培养基培养的大多数细胞来说,添加牛血清是必不可少的。但是牛血清的使用也给细胞培养和生物制品的生产带来很多问题,并成为生物制品生产水平达到最优化和实现经济性目标的一大障碍。 1、批间差异血清是一种成分复杂而且不确定的混合物,不同来源的血清成 分存在很大的差异,因此支持细胞生长的效果也有较大差别。而每批血清的批量是有限的,所以换血清批号时要预先做大量的筛选实验,以确定对细胞生长影响最小的血清。不但增加工作量,而且如果因为一时筛选不出合适的血清还会导致生产停滞。 2、动物来源成分因为来源于动物,所以有可能携带传染源,包括病毒和有毒物 质,任何一种传染源都有可能对正在生长的细胞系或者制品带来风险;不同来源的血清存在某些特异性病毒抗体(比如:乙脑抗体、牛腹泻性病毒抗体等),直接影响接毒后病毒的复制,可能导致不产毒或毒价偏低,从而给疫苗生产造成巨大损失。 3、提高生产成本目前市场销售的血清平均价格约0.25元/ml,按10%添加 量计算,1L培养液中血清所占的成本是25元,培养基及其他添加物的成本约为6元,每升培养液的成本中血清约占80%,由此可见血清在疫苗生产中占据了大量的生产成本。 4、行业竞争导致质量难以提高由于国内牛血清生产厂家增多,而用户的 数量有限。为了获得客户资源,很多血清厂家都在进行低价销售,行业内形成一种恶性的价格竞争。低价格带来的结果就是低质量的血清。目前很多血清厂家都处于维持生存的状态,因此难以投入大量资金和人力来提高血清的质量。 5、血清蛋白引起的疫苗纯化问题由于血清含有大量的不同分子量的未知 蛋白和多肽类物质,势必会增加提取,分离,纯化的步骤,增加了下游纯化处理的难度,因此在疫苗纯化阶段给纯化工作带来很大的困难; 疫苗产品中牛血清白蛋白残留量要求不高于50ng/剂,为达到纯化的目的,纯化工艺不得不添加新的仪器设备;在除去牛血清白蛋白残留的同时,也会损失大量的有效目的产物,从而降低了疫苗的产率; 牛血清中的某些蛋白与目的产物的分子量接近,在纯化过程中不能完全被去除,由于血清残留而导致的生物制品不合格,或者因为杂蛋白含量大造成严重不良反应的情况时有出现.因此也会严重影响疫苗产品的质量。 6、改变培养液的pH值牛血清的pH理论值为7.0~8.0,培养基在加入规 定量的碳酸氢钠后(即达到细胞生长所需要的渗透压),再加入10%的牛血清,一般会使培养液的pH值发生改变。因此在使用过程中应注意pH的变化,如有必要可用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调pH到所需值。 7、由于血清的营养成分丰富,非常适合细菌、真菌和支原体等生长。 国产血清大部分采用手工分装,因此容易把微生物带入而使得血清被污染。使用前如果没有及时发现,将会把污染物带入正在培养的细胞中,而使得细胞不能正常生长。 如何判断胎牛血清质量 一、外观 拿到血清,最先接触的是血清外观,对于缺少细胞培养经验的人来说,外观的判断尤为重要 1、颜色 根据血红蛋白含量的不同,胎牛血清可表现出黄色或红色,我国的细 胞培养用血清标准是不高于20mg/dl,实际上,血红蛋白含量的高低对血清并无直接影响,这个指标的意义在于能体现出采血过程的严谨程度,良好的操作能降低血清的溶血。 国产血清的采血点很分散,大多是由屠户采血后马上离心收集,所以很少 会有溶血,表现出明亮的蜡黄色,当然,国产血清也很少有标准意义上的胎牛 血清。 进口胎牛血清或多或少总有点溶血,因为真正的胎牛血清凝血功能差,红细胞容易破裂。 总的来说,国产的血清呈现出蜡黄。进口的血清,质量最好的呈现出谈黄、微红色,如Gibco 16000,差点的呈现出橘红色或鲜红色。 当然,热灭活血清或保存不当的血清,由于血红蛋白的破坏氧化,会呈现出暗红,甚至咖啡色。 2、沉淀 很多血清客户,会发现进口血清有沉淀,从而怀疑血清的质量问题,这是没有根据的。 沉淀是由纤维蛋白的凝聚产生,对血清质量没有任何影响,沉淀的产生原因很多,和厂家的加工生产方式密切相关。 国产的血清:大多来自北方,由于价格低廉,保存环境都不好,从采血、 冷冻、运输到生产会经过多次冻融,每次冻融过程,就会析出部分纤维蛋白沉淀,这样,血清成品过滤后看起来反而更加的“干净”,很少有沉淀产生。 进口的胎牛血清:过滤分装前很少会反复冻融,生产后的成品也是清澈 的,但随着时间的推移,血清中的大量纤维蛋白会析出形成沉淀。当然,进口的新生牛血清,一般牛龄都在2周左右,血清中的各种蛋白含量明显偏高,生产后血清可能会浑浊,甚至有大量沉淀。 当然,购买回来的血清都是冰冻状态,使用时需要融化,融化过程最好在温度较低的状态下慢慢进行,否则沉淀相对较多,虽然沉淀并不直接影响血清的质量,但对细胞的显微观察有一定的阻碍。 3、澄清度 进口胎牛血清由于蛋白和脂类等物质含量低,表现为稀薄、清淡,而国产血清,因为绝大多数是新生牛血清,相对而言更加粘稠,颜色略深,这对于初步接触血清的人很难判断,但把两者进行对比,可容易分辨。 二、主要技术指标 目前国内血清的质量标准是2005版的《中华人民共和国药典》,主要指标有以下几点: 1、内毒素 国产血清标准为不高于5EU/ml。内毒素是细菌破碎后细胞壁的成分, 因此内毒素含量的高低可表现出采血到生产一系列过程中的无菌操作情况。 目前,国产血清基本都能达到这一要求,很多进口胎牛血清内毒素含量反而更高,如Gibco 26140,只要求不高于50EU/ml,高出我国标准10倍,即使是 16000,也要10EU/ml,血清质量也未见影响。可见,内毒素含量偏高不影响质量,除非含量极高,预示着已经污染。 2、总蛋白含量 胎牛血清一般范围是30-40mg/ml,数值偏高,说明采血的牛龄偏大,不是胎牛,数值偏低,表明血清可能掺水了。 3、血红蛋白 标准为不高于20mg/dl,颜色越红,数值越高,反之,数值越低。 4、pH 国产血清,大多高于7.5,进口胎牛血清,大多低于7.5,具体原因未知,可能和牛龄有关,这也能用来初步鉴别血清的来源。 5、微生物 包括细菌、霉菌、支原体、噬菌体、各类病原性病毒等。随着国内血清厂家生产条件的改善提高,细菌、霉菌等“大型”微生物几乎能100%控制,支原体经过0.1um过滤,大多也能清除。大肠杆菌噬菌体的污染还是比较严重的,主要是生产环境过程中带入,又无法过滤,很难彻底清除,但对血清质量影响不大。 病原性病毒,特别是BVDV,在国产血清中几乎90%以上都存在, 这类微生物是影响国产血清质量的重要因素之一,而进口胎牛血清中基本都控制的很好。 6、免疫球蛋白 国产血清的只是定性检测,结果也很不准确,进口胎牛血清大多定量检测。免疫球蛋白的数值能完全体现出采血的时的牛龄情况,国产血清,基本都是新生牛的,血清中容易产生IgM,IgG的含量也偏高,进口胎牛血清,不含IgM,IgG 的含量也较低。 7、其它 不管是国产还是进口血清,都是不测抗生素的 除外)。国外,抗生素的使用很严格,用量也很少,每头奶牛的产品包括血清都可以溯源的,因此可以做到胎牛血清中不含抗生素或含量极低;国内,抗生素的滥用已成了普遍现象,国产血清中残留很高,对细胞培养极为不利,这是国产血清质量差的根本原因。 三、血源 市场上的血清血源主要分为中国、北美、南美和澳洲。 1、国产血清质量差,这是公认的,主要原因并不是生产厂家的责任,而是天然环境差和抗生素的大量使用。国内环境污染严重,同时饲养过程中抗生素极其滥用,有毒有害物质会大量残留在血清中,最终不利于细胞的生长。 2、南美血清,来源很多,如Bioind的巴拿马、Gibco的乌拉圭、巴西等,这些血清由于采血的不可控性,质量参差不齐,当然,相对于国内血清来说好的多。另外,国内销售的南美血清大多颜色鲜红,如Bioind、Gibco、Hyclone 等品牌,但阿根廷的血清例外,这可能和各国的采血、生产工艺有关。 3、北美血清,主要来自美国和加拿大,如Hyclone的SH30396、SH30070、SH30071、Gibco的16000-04 4、26140-079等。这类血清,等级越高的颜色越淡,淡黄中带一点微红SH30070和SH30396对比就很明显,特级胎牛血 清基本就能进行干细胞培养。北美血清还有一个显著特点就是每瓶血清都能溯源,这对一些大型的疫苗厂、药厂尤为重要。 4、澳洲血清,来源主要是新西兰和澳大利亚,这是在北美血清禁运之后进入 中国市场的,一般不具有溯源功能,由于生产、运输等原因,价格相对来说比较贵。拿Gibco的10099和16000颜色更淡 价比更高。 四、牛血清在细胞培养基中的主要功能: 牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能。 1、提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物,以及某些低分子营养物质; 2、提供结合蛋白,识别维生素、脂类、金属离子,并与有毒金属和热源物质结合,起解毒作用; 3、是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源; 4、起酸碱度缓冲液作用; 5、提供蛋白酶抑制剂,细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活,保护细胞不受损伤。 五、牛血清的质量要求 (一)WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求 1. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家,并应具备适当的监测系统。 2.有些国家还要求牛血清来自没有用过反刍动物蛋白饲料喂养的牛群。 3.要能证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。 4.血清要通过滤膜过滤除菌,保证无菌。 5.无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染,有些国家要求无大肠杆菌噬菌体污染。 6.要求血清对细胞有良好的支持繁殖作用。 (二)我国在对牛血清的质量标准最早在2000年版《中国生物制品主要原辅材料质控标准》中提出。包括物理性状、总蛋白,血红蛋白、细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素,支持细胞增殖检查。2005版药典颁布之后,小牛血清质量标准被纳入《中国药典》2005年版第三部生物制品分册。 (三)美国对牛血清的质量要求: Gibco 和Hyclone等美国主要血清供应商的牛血清都已进入到我国市场,他们 对血清质量标准有严格要求,从血清来源到产品质量都有明确规定。 1、血清来源:可从世界各地收集胎牛血清,但必须符合其质量标准和美国农业部进口要求。 2、血清的收集:必须符合工业生产的标准,低温采集,一次分离,分离后立即混合冻存。 3、血清的制备:超低IgG胎牛血清、透析血清、γ-射线辐照; 4、除菌过滤:0.22μm和0.1μm滤膜过滤; 5、成品分装:根据需要分装成不同规格。 六、牛血清质量检定指标 1、化学检定:包括渗透压(240~340)、pH(7.0~8.0)、总蛋白含量(3.5~5.0%)、血红蛋白(≤0.02%) 2、微生物检查:细菌和真菌——直接培养法、噬菌体——噬斑法和增殖法支原体——培养法和DNA染色法、牛病毒——细胞培养法。要求均为阴性 3、内毒素检测——凝胶法和动态浊度法要求内毒素含量≤10EU/ml 4、促细胞生长测定(SP2/0-Ag14标准规定) 1)最大增殖浓度≥1.0×106个/ml、倍增时间≤20小时 克隆率=(阳性孔平均数/培养孔总数)×100% 2)贴壁效率(VERO细胞、二倍体细胞等) 10%血清――50或100个细胞/孔贴壁效率(%)=(每孔克隆平均数/每孔存活的培养细胞平均数)×100 相对贴壁效率=被测血清贴壁效率/参考血清贴壁效 以上项目检定结果应符合2005版《中国药典》第三部的相关规定。血清厂家应在此基础上结合疫苗病毒生产工艺建立企业内控检定项目并建立相应的检定方法,保证疫苗病毒生产的稳定性,提高疫苗制品的质量。 血清分类 胎牛血清:(八月龄胎牛心脏穿刺取血) 适用于细胞株保藏及娇贵细胞培养。 超级新生牛血清:(出生12~24小时新生牛静脉采血,采血后静置自然析出的血清) 适用于淋巴细胞、骨髓瘤细胞、二倍体细胞等基础生物医学研究。 标准新生牛血清:(出生12~24小时新生牛静脉采血,经离心分离的血清) BVDV 抗原抗体均阴性,适用于原代、传代细胞培养和人用疫苗(vaccine)生产和研制。 特别适用于猪瘟疫苗(vaccine)的研制、生产。 普通新生牛血清:(出生12~24小时新生牛静脉采血,融血或微融血的血清)适用于普通原代、传代细胞培养和兽用疫苗(vaccine)及诊断试剂生产 小牛血清:(出生三月龄小牛动脉采血分离血清) 适用于生物医学研究等。 大牛血清: 适用于标准蛋白液、胆固醇液及牛血清白蛋白制备等。 马血清: 适用于兽用疫苗(vaccine)生产和诊断试剂生产。 山羊血清: 适用于生物医学研究基础等。 鸡血清: 适用于生物医学研究基础等。 兔血清: 适用于生物医学研究基础等。 - 1 -