【doc】谷氨酸钠致痫大鼠大脑皮质mGluR5的表达变化

【doc】谷氨酸钠致痫大鼠大脑皮质mGluR5的表达变化 谷氨酸钠致痫大鼠大脑皮质mGluR5的表 达变化 第32卷第4期第361页 2003年8月 华中科技大学(医学版)Vo1.32No.4P.36i JHuazhongUnivSciTech[HealthSci]Aug.2003 谷氨酸钠致痫大鼠大脑皮质mGluR5的表达变化 蔡秋云段东晓董大翠王良 .华中科技大学同济医学院基础医学院解剖学系,武汉430030 郑州大学医学院生理学教研室,郑州450052 摘要目的探讨谷氨酸钠(GluNa)致痫时大鼠大脑皮质代谢型谷氨酸受体 5(mGluRs)的表达变化.方法 将动物随机分为正常对照组,生理盐水组,GluNa致痫组.在GluNa诱导大鼠癫痫发 作2h后,进行SABC法免疫组 织化学染色.结果正常对照组大鼠大脑皮质各层均有丰富的mGluR表达,特别是 第V层锥体细胞.生理盐水组 mGluR表达同正常对照组相比没有明显改变.而GluNa致痫组mGluRs表达明显 下调.结论在癫痫发作早期 mGluRs表达下降可能是神经细胞的一种自我保护作用. 关键词癫痫;谷氨酸钠;受体,亲代谢性谷氨酸盐;大脑皮质 中图法分类号R742.1,R154,R322.8l AlteredExpressionofMetabrotropicGlutamateReceptorSubtype5(mGluR5) intheCerebralCortexofSodiumGlutamateKindledRats CaiQiuyun,DuanDongxiao,DongDacuietal DepartmentofAnatomy,SchoolofBasicMedicalSciences,ToncgJiMedicalCollege, HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030 DepartmentofPhysiology,MedicalCollegeofZhengzhouUniversity,Zhenzhou450052 Abstract0bjectiveToinvestigatetheexpressionofmetabotropicglutamatereceptorsubtype5 (mGluR5)incerebralcortexduringseizuresinducedbysodiumglutamate(GluNa).MethodsAnimals wererandomlydividedintothreegroups:normalgroup,salinestimulationgroupandGluNagroup.Twoh afteronsetofseizureinducedbyGluNa.SABCimmunohistochemicalstainingwasdone.ResultsThere wasintensiveexpressionofmGluR5inalllayersofcerebralcortexinnormalgroup,especiallyinV.No differencewasfoundintheexpressionofmGluR5betweennormalgroupandsalinestimulationgroup. However.theexpressionofmGluR5inGluNagroupwasobviouslydecreasedascomparedwiththatof normalgroup.ConclusionDown— regulatedexpressionofmGluR5attheearlystageofseizureonsetmay playanimportantprotectiverolefortheneuron. Keywordsepilepsy;sodiumglutamate;receptors,subtypemetabotropicglutamate;cerebral eortex 兴奋性氨基酸谷氨酸(Glu)异常增高可导致 癫痫的发生.介导Glu发挥其生物效应的受体有 两类,即离子型谷氨酸受体(iGluRs)和代谢型谷 氨酸受体(mGluRs).代谢型受体分为mGluR, mGluR.亚型.根据氨基酸序列的同源型,信号转 导机理及药理学特性,将mGluRs分为3组.第 1组包括mGluR1和mGluR5;第?组包括mGluR2 和mGluR3;第?组包括mGluR4,mGluR6,GluR7 和mGluR..已有资料证明I组受体参与了癫痫发 作[】].但这些报道大都集中在对海马的研究.大 脑皮质是一个与癫痫发病有着密切关系的部位,细 胞含有丰富的mGluR受体【3].在GluNa诱导癫痫 发作时,大鼠大脑皮质mGluR表达如何变化,目 前尚未见到相关报道.本实验采用免疫组织化学方 蔡秋云,女,1956年生,主管技师 法,对此进行观察. 1材料与方法 1.1动物模型的制备 成年健康SD大鼠3O只,华中科技大学同济 医学院实验动物学部提供,体重18O,200g,随机 分为正常对照组,生理盐水组,GluNa致痫组. 将100mgL一谷氨酸钠溶于1ml生理盐水中,配成 浓度为100mg/ml致痫液.腹腔注射0.4戊巴比 妥纳(40mg/kg)麻醉动物,大鼠麻醉后,固定 于立体定位仪上,暴露右侧脑膜,缓慢注射3ttl 致痫液于大鼠侧脑室,留针10min,动物存活观 察2h.生理盐水组注射3l生理盐水,步骤同 前.正常对照组不做任何处理. 1.2行为观察 参考Diehl的评估,将动物癫痫发作的行 ?362?华中科技大学(医学版)2003年8月第32卷第4期 为表现分为6级.0级:无反应;工级:须动,咀 嚼;II级:头面部抽搐;III级:前肢或后肢抽搐; ?级:四肢节律性抽搐;V级:四肢强直性抽搐, 并伴甩尾或翻滚.观察各组大鼠的行为2h,记录 痫痛性发作的潜伏期(即注入致痫剂到首次抽搐之 间经历的时间)及发作程度.?级及?级以下表现 为轻型发作,?,V级表现为重型发作. 1.3免疫细胞组织化学方法 将各组大鼠麻醉后用4多聚甲醛灌注,取 材.修块后置于4多聚甲醛于4.C冰箱中固定3 , 4h,后入20蔗糖过夜.次日做冠状连续冰冻 切片,片厚40ptm.将切片入新鲜配置的0.3双 氧水5,10min,蒸馏水洗2min×3次.正常小牛 血清封闭,37?温箱中1h,甩去多余液体,不 洗.加一抗兔抗mGluR多克隆抗体,于4.C冰箱 中过夜.次日加二抗,37?温箱中1h,PBS洗2 min×3次.加SABC,37?温箱中1h,PBS洗2 min×3次.DAB室温下显色4min,脱水,透明, 封片,显微镜下观察.对照实验,用缓冲液代替第 一 抗体孵育切片,结果为阴性. 1.4图像及统计学处理 在明视野显微镜下认定结构部位后,经 HPIAS一1000型全自动医学彩色图像分析系统在 17186.5ptm.标准框下对阳性信号进行扫描.每组 标本测10个视野范围(×200)内阳性反应细胞面 积/扫描面积(R)和平均光密度值(OD值),对 所得数据进行统计学处理(,检验). 2结果 咀嚼,达到工级;20,60min时出现头面部抽搐 及前肢或后肢抽搐,约为?级;70,90min后出 现严重边缘性惊厥状态,表现为流涎,姿势失衡, 四肢强制性抽搐,并伴甩尾和翻滚,达到V级,持 续至2h.生理盐水刺激组,正常对照组均无痫性 发作. 2.2大鼠大脑皮质mGluR免疫细胞化学变化观察 光镜下,正常对照组大鼠大脑皮质各层可见大 量mGluR免疫反应阳性细胞,反应产物呈深棕 色,分布于细胞膜上,细胞核不着色.V层锥体细 胞mGluR表达最为丰富,阳性细胞密集(图1); 生理盐水组rnGIuR表达同正常组相比没有明显的 改变(图2);GluNa致痫组mGluR表达同正常组 和生理盐水组相比,mGluR免疫反应下降,阳性 细胞明显减少,着色浅(图3). 2.3图像分析结果 mGluR免疫反应强弱用平均光密度比较,数 值愈大,表示反应产物颜色愈深,正常对照组,生 理盐水组,GluNa致痫组的阳性细胞平均光密度 值及统计分析结果见表1. 表1大脑皮质mGluR阳性反应细胞面积/扫描面 积(R)及平均光密度(OD)值(一10, . - 4-S) 2.1大鼠行为学改变与正常组比较一P<0.01 侧脑室注射GluNa后,5,10min出现须动, 图1正常对照组大鼠大脑皮质第V层mGluR(十)免疫反应细胞×100 图2生理盐水组大鼠大脑皮质第V层mGluR(十)免疫反应细胞×100 图3GluNa致痫组大鼠大脑皮质mGluRs(十)免疫反应细胞×100 蔡秋云等.谷氨酸钠致病大鼠大脑皮质mGluRs的表达变化?363? 3讨论 有资料表明癫痫患者的脑脊液和病灶中的Glu 含量明显高于正常人_4].我们将GluNa直接注射 到大鼠侧脑室,使大鼠脑脊液中兴奋性氨基酸Glu 含量异常增高,诱发大鼠癫痫发作.其致痫机制比 马桑内酯等致痫剂更为清楚. 谷氨酸受体可分为离子型受体和代谢型受体. 离子型谷氨酸受体(iGluRs)在以往是主要的研究 对象,其拮抗剂在临床上也得到应用.然而,临床 试验表明iGluRs拮抗剂有严重的神经毒性作用, 从而限制了该类药物的应用. 随着多种mGluR的激活剂及拮抗剂的发现, 人们对mGluR的研究也更深入.Tizzano等口用 选择性激动剂3,5-DHPG在小鼠产生致痫作用, Dalby等_2]用mGluRs拮抗剂4一羧基一3羟基一苯甘 氨酸(4C3HPG),4一羧基一苯甘氨酸(4CPG)发现 其对小鼠听源性癫痫发作,DMCM诱导的癫痫发 作以及电刺激的癫痫发作均有保护作用.这些都说 明InGluR参与了癫痫发作的调节.InGluR表达 的强弱是Glu发挥其生物效应的一个调节因素. 在GluNa致痫2h后,我们观察到:正常组大鼠大 脑皮质各层均有rnGluR表达,V层锥体细胞 InGluR表达尤为丰富.生理盐水组InGluR表达 同正常组相比没有明显改变.而GluNa致痫组 mGluR表达明显下调.江文等用红藻氨酸致痫 大鼠,2h后处死大鼠同样也观察到大鼠海马 CA,CA区mGluRmRNA表达明显下降.此结 果说明,大脑皮质与海马一样,也属对癫痫的敏感 区域,是mGluR激动剂作用的重要靶区. 大脑皮质第V层锥体细胞为投射神经元,似乎 全部以Glu为递质,含丰富的mGluR受体_3].其 轴突组成皮质脊髓柬进入脊髓灰质形成投射纤维. 皮质脊髓束是哺乳动物的主要下行传导束,其纤维 直接或间接通过中间神经元支配前角运动细胞进而 控制骨骼肌的随意运动和调节肌张力.癫痫在临床 上是以神经元异常放电而引起肌肉高度亢进,抽搐 为特征.mGluR主要存在于突触后膜,在树突棘 含量最高_6].树突棘是哺乳动物脑内兴奋性氨基酸 突触后成分,在癫痫发作时,大脑皮质细胞,特别 是第V层锥体细胞mGluR表达下降,可抑制兴奋 性氨基酸谷氨酸能神经元的突触传递,有助于减轻 惊厥. 为什么在癫痫发作早期mGluR表达下降?有 学者提出,机体内存在一种内源性抗痫系统,此系 统的激活,促使mGluRmRNA表达下降J. mGluR的作用主要是诱导癫痫的发作_7].因此, mGluR表达下降,其诱导癫痫发作的作用也随之 被削弱.mGluR表达下降对神经元是有保护作用 的].一在癫痫发作早期机体可通过调控此系统,对 机体起一种自我保护作用.我们的实验结果为此论 点提供了形态学依据. 参考文献 1TizzanoJP,GriffeyKl,SchoeppDDeta1.Induction orprotectionoflimibicseizuresinmicebymGluRsub— typeselectiveagonist.Neuropharmacology,1995,34: 1063 2DalbyNO,ThomsenC.Modulationofseizureactivity inmicebymetabotropicglutamatereceptorligands.J PharmacolExpTher,1996,276:516 3朱长庚主编.神经解剖学.北京:人民卫生出版社, 2002.661,662 4RonneEngstromE,HilleredL,FlinkReta1.Interce— rebralmicrodialysisofextrecellularaminoacidsinhu— manepilepticfocus.JCerebBloodFlowMetab,1992, 12:873 5江文,黄远桂,王洪典等.红藻氨酸诱导大鼠癫痫发 作时海马mGluRmRNA表达变化的动态观察.第四 军医大学,2001,22(4):324 6LujanR,RobertsJD,ShigemotoReta1.Differential plasmamembranedistributionofmetabotropicgluta— matereceptorsmGluIalphamGluzandmGlu5,relative toneurotransmitterreleasesites.JChemNeuroanat, 1997,13:219 7MerlinLR,GaloyanSM.RoleofNMDAreceptorac— tivationingrouponemetabotropicglutamatereceptors- mediatedepileptogensisinvitro.SocNeurosci,1998, 24:2138 8BrunoV,Ksiazekl,BattagliaGeta1.Selectiveblock— adeofmetabotropicglutamateteceptorsubtype5isneu— roprotective.Neuropharmacology,2000,39:2223 (2002-12-19收稿)