通心络胶囊对全脑-局灶脑血大鼠的脑缺血耐受及脑源性神经营养因子的影响

通心络胶囊对全脑-局灶脑血大鼠的脑缺血耐受及脑源性神经营养因子的影响 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 通心络胶囊对全脑-局灶脑血大鼠的脑缺血耐受及脑源性神经营养因 子的影响 通心络胶囊对全脑-局灶脑血大鼠的脑缺血耐受及脑源性神经营养因子的影响 摘要:目的 采用全脑一局灶脑缺血耐受大鼠模型，观察通心络胶囊对脑缺血耐受作用的影响。方法 线栓法制备大鼠全脑缺血,局灶脑放血再灌注模型(PC,MCAO)及局灶脑缺血再灌注模型(MCAO)。在不同缺血时间点观察通心络组、PC,MCAO组及MCAO组大鼠神经行为评分，用免疫组化法脑源性神经营养因子(BDNF)阳性细胞数。结果 神经行为评分在通心络组、PC,MCAO组和MCAO组的2h组之间无统计学意义(P>0.05)，通心络24h，3d，5d组均显著低于对应时程的PC,MCAO组和MCAO组(P<0.05);各组缺血半暗带BDNF阳性细胞数均增高，但通心络组的阳性细胞数显著高于对应时程的PC,MCAO组和MCAO组(P<0.05)。结论 通心络胶囊能提高大鼠局灶脑缺血半暗带BDNF的表达水平，促进神经元的修复，诱导脑缺血耐受。 关键词:通心络胶囊;脑源性神经营养因子;缺血预处理 中图分类号:R743.3 R285.6 文献标识码:A 文章编号:1672,1349(2007)10,0961,03 有短暂性脑缺血发作(TIA)史者脑卒中的发病风险更高，因此，预防TIA病人脑卒中复发十分重要。新近的研究结果显示，通心络胶囊不仅可以治疗急性缺血性脑卒中，也可用于TIA病人的二级预防。本研究旨在观察通心络胶囊对全脑缺血后再次局灶脑缺血再灌注大鼠的脑源性神经营养因子(BDNF)的影响，探讨BDNF与脑缺血耐受的关系及通心络胶囊的干预作用，研究通心络胶囊在二级预防中的神经保护作用及其机制。 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 1 与方法 1(1 药物与试剂 通心络胶囊，河北以岭药业股份有限公司生产，主要由人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等组成。兔抗大鼠BDNF单克隆抗体为北京中山生物技术有限公司生产。免疫组化试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。水合氯醛、肝素钠、4,多聚甲醛均由四川大学华西医学中心基础医学院临床药理前基地动物实验室提供。 1(2 实验动物与分组 130只清洁级健康成年SD雄性大鼠，体重(240,270)g，四川大学华西医学中心实验动物中心提供。实验前在室温下(20?,25?)保持昼/夜各12 h，环境适应性喂养1周，给普通饲料和自由饮水。随机分为4组，即假手术组(10只)，大脑中动脉再灌注(MCAO)组(40只)，全脑缺血(PC,MCAO)组40只，通心络组40只，即全脑缺血3 min后给予通心络灌胃5d，1g/kg用蒸馏水配至1 mL，每日1次。所有大鼠在全脑缺血后当天开始灌胃。MCAO组在再灌注2h，24h，3d，5d后取材，PC,MCAO组及通心络胶囊组分别在第2次再灌注2h，24h，3d，5d后取材。假手术组在实验开始5d后取材。 1(3 大鼠全脑,局灶缺血模型 1(3(1 全脑缺血模型 采用Simon等制作全脑缺血模型的方法:用10,水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。将大鼠四肢和头部固定于手术台上，颈部备皮，常规消毒铺洞巾。行颈部正中切口，逐层分离暴露双侧颈总动脉。微动脉夹夹闭双侧颈总动脉3 min，观察大鼠瞳孔散大，翻正反射消失，即产生全脑缺血。术后提尾无前肢内收屈曲，爬行时无追尾，否则应剔除。 1(3(2 MCAO模型 采用改良的Zealonga线拴法。单沙尼龙线，直径0.285mm，加热将一端烤制光滑呈,球形，直径(0.25,0.28)mm，紫外线照射消毒备用。用10,水合氯醛350mg/k8腹腔注射麻醉大鼠。将大鼠四肢和头部固定于手术台上，颈部备皮，常规消毒铺洞巾。行颈部正中切口，逐层分离暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)，避免刺激迷走神经。经CCA切口插入尼龙线进入ICA约(18,20)mm 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 至大脑中动脉近端，阻断大脑中动脉血供2h后抽出尼龙线。术后提尾右前肢内收屈曲，爬行时追尾现象为成功标志。术中用烤灯维持环境温度(37.0,37.5)?。所有大鼠只栓塞左侧大脑中动脉。 1(4 神经行为学评分 MCAO后24 h采用Zealonga评分法。0分:无神经功能缺失症状，活动正常者;1分:不能完全伸展对侧前爪者;2分:爬行时出现向右转圈者;3分:行走时，身体向偏瘫侧倾倒者;4分:不能自发行走，意识丧失者;5分:死亡。评分为0分和4分以上剔除，随机补充保证每组10只。 1(5 脑组织切片制备及BDNF免疫组化染色 各组大鼠在的时间用10,水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉。开胸，经左心室灌注37?的肝素钠生理盐水100 mL冲净血液，再灌注40?4,多聚甲醛200 mL。开颅取脑，置于4,多聚甲醛中保存(24,48)h。取视交叉前后2 mm的左侧大脑组织，固定，脱水，石蜡包埋，连续切片，片厚4 μm，制成免疫组化片，60?烤片2 h备用。免疫组化染色采用链亲和素,生物素,过氧化物酶法。按试剂盒说明书提供的方法进行染色。BDNF阳性染色为细胞膜和细胞浆呈棕色。随机选取10×40视野10个，分别测定每个视野的阳性染色细胞数，取其平均值。 1(6 统计学处理 数据以均数?标准差(x?s)表示。用SPSS10.0版软件做t检验。 2 结 果 2(1 神经行为学评分 MCAO后2h，通心络组的神经功能评分与PC,MCAO组、MCAO组无统计学意义(P,0.05)。通心络组24h，3d，5d的神经功能评分均低于对应时间的PC-MCAO组和MCAO组(P,0.05)。通心络组神经行为学评分从第5天开始下降。详见表1。 2(2 BDNF免疫组化染色 全脑,局灶脑缺血再灌注2h，24h，3d，5d后各组均可见BDNF阳性细胞，通心络组再灌注2h，24h，3d，5d BDNF阳性细胞数逐渐增多，PC,MCAO再灌注组2h，24h，3d BDNF阳性细胞数逐渐增高，5d时开始下降，MCAO组2h，24h组BDNF阳性 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 细胞数逐渐增高，但从3d时就开始下降。通心络组2h，24h，3d，5d BDNF阳性细胞数分别高于PC-MCAO组和MCAO组的对应时程组(P,0.05)。详见表2。 3 讨 论 神经营养因子家族是一组由神经元支配的靶细胞分泌的小分子多肽，它们与神经元的存活和神经系统的生长密切相关，对视网膜神经节细胞、运动神经元、胆碱能神经元、多巴胺能神经元的存活和生长具有支持和促进作用。研究发现缺血后立即侧脑室灌注BDNF，脑梗死总体积可以减小33,，皮层梗死体积减小37,。实验研究结果表明，在脑缺血时BDNF的表达上调，在脑缺血中具有保护半影区神经元、抵抗损伤、促进损伤神经元修复、抑制迟发性神经元坏死、减小梗死体积的作用。主要是通过下面的机制:?抑制凋亡，脑缺血急性期细胞凋亡主要位 于缺血半暗带，迟发性神经元死亡主要也是细胞凋亡。研究发现，BDNF是调节Bel,2相关基因表达的上游信号，通过增加Bcl,2表达抑制细胞凋亡，在体内和体外均有神经保护作用;BDNF还能通过阻止Caspase,3的活性而抑制细胞凋亡。?影响神经细胞的分化和生存，维持神经元的存活，修复受损神经元。?拮抗兴奋性氨基酸，减轻毒性损伤。急性脑缺血时，谷氨酸浓度增高使大量Ca²⁺进入细胞内，破坏细胞内外的离子平稳，导致缺血中心坏死和半暗带神经元的迟发性死亡。BDNF能够诱导钙结合蛋白的表达，抑制Ca²⁺内流，稳定细胞内Ca²⁺浓度。?BDNF增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化酶等的含量，抑制脑缺血后一氧化氮合酶的表达、胶质细胞的活性和吞噬细胞的浸润，减少自由基的生成，减轻自由基损伤。脑缺血后蛋白激酶C(PKC)快速失活，BDNF增强PKC的活性而实现脑缺血神经保护。BDNF还能促进内皮细胞的分裂与分化，刺激神经血管的生成，促进神经功能的恢复。通过以上机制BDNF减轻脑缺血时半暗带神经元损伤，诱导脑缺血时产生缺血耐受性。 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 研究发现，脑缺血后产生的痰瘀热毒害络损髓是抑制神经干细胞(NSC)增殖分化的关键性病理因素，而解毒通络是治疗的重要方法。通心络胶囊能改善血管内皮细胞功能，保护和促进修复内皮细胞;降低胆固醇和低密度脂蛋白水平;抑制血小板聚集和释放;抑制血管平滑肌细胞增殖;降低血液黏度和纤维蛋白浓度;增加血管内皮细胞NO含量;降低血浆内皮素水平;具有益气化瘀、解毒通络、搜风解痉之功效，从而祛除了抑制神经，细胞增殖分化的病理因素，促进脑缺血后神经细胞的增殖和分化。本研究采用全脑,局灶脑缺血模型，模拟临床中丁IA病人再发脑梗死的脑部病变。结果显示，BDNF在脑缺血半暗区的皮质和皮层下的神经细胞中表达，通心络组第2次再灌注后BDNF的表达随时间逐渐增高，说明通心络能够诱导BDNF，产生脑保护作用。Kitagawa等发现了脑缺血耐受现象，指出脑缺血耐受是由于缺血预处理增加神经元对致死性脑缺血的耐受并减轻致死性脑缺血所造成的损伤。在本研究中PC,MCAD组第2次再灌注后神经行为学评分低于MCAO组，BDNF阳性细胞数高于MCAO组，说明缺血预处理能够减轻再次脑缺血的损伤，具有脑保护作用，与Kitagawa的研究相一致。通心络组在各时程的BDNF表达均高于对应的PC,MCAO组，通心络组第2次再灌注后BDNF的表达增高在第5天仍处于较高水平，而PC,MCAO组BDNF的表达在第3天达高峰之后降低，提示通心络进一步使BDNF的表达增加，并能使BDNF的表达在较长时间维持于较高的水平。通心络组第2次再灌注后24h，3d，5d的神经行为评分则低于对应的PC,MCAO组，显示通心络各组神经功能缺损较PC,MCAO各组减轻，与BDNF表达水平的变化具有一致性。在短暂脑缺血后给予通心络治疗能够进一步增加BDNF的表达，增强脑的缺血耐受，更加减轻再次脑卒中所致的神经细胞损伤。 BDNF是一种多效能的神经营养因子，对脑的缺血性损伤具有抵抗作用，可诱导脑的缺血耐受，促进神经元功能的修复。研究发现，由于外源性BDNF难以通过血脑屏障，无论通过侧脑室或静脉给药都不能很好发挥其保护作用，因此给予外源性通心络增加内源性BDNF在缺血性损伤脑组织中的表达，是增进由缺血预处理诱导的脑的缺血耐受效应的重要途径。 更多专业、稀缺文档请访问——搜索此文档，访问上传用户主页～ 本文编辑 郭怀印