乌梢蛇

乌梢蛇 乌 梢 蛇 【炮制】 乌梢蛇 去头及鳞片，切寸段。 乌梢蛇肉 去头及鳞片后，用黄酒闷透，除去皮骨，干燥。 酒乌梢蛇 取净乌梢蛇段，照酒炙法(附录? D)炒干。 每100kg乌梢蛇，用黄酒20kg。 本品为段状。棕褐色或黑色，略有酒气。 【PCR鉴别】 照聚合酶链式反应法鉴别。 DNA 取本品粉末约0.5g，液氮中充分研磨使成粉末，取适量（约0.1g）至1.5mL离心管中，加入275μl消化液（细胞核裂解液200 μl，0.5M EDTA 50μl，蛋白酶K（20mg/ml）20μl，RNA酶溶液 5μl），55?温育1小时，入250μl Wizard SV Lysis Buffer混匀，加到柱中，10000r/min离心3分钟；弃掉过滤液，加入800μl洗脱液（醋酸钾162.8mM，Tris-HCl 22.6mM（pH7.5），EDTA 0.019mM（pH8.0），60% 乙醇），10000r/min离心1分钟；弃掉过滤液，用洗脱液反复洗脱3次，每次10000r/min离心1分钟；弃掉最后一次过滤液 后再离心2分钟，将过滤柱转移入新的离心管中，加入100μl无菌双蒸水，室温放置2分钟后，10000r/min离心2分钟，滤液-20?保存备用。取对照药材粉末约0.5g，同法制成对照药材模板DNA溶液。. PCR 鉴别引物：5’GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA3’和5’CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG3’。PCR反应体系：25μl反应体系包括10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP（2.5mM）2μl，鉴别引物（10μM）各0.5μl，高保真TaqDNA聚合酶（5U. /μl）0.2μl，模板0.5μl，无菌双蒸水19.3μl。PCR反应参数：95?预变性5分钟后，进行30次循环（95? 30秒，63? 45秒），后延伸72? 5分钟。 用琼脂糖凝胶电泳法，胶浓度为1％，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed； . 供试品与对照药材鉴别PCR产物的上样量分别为8μl，DNA分子量标记上样量为2μl（0.5μg/μl）。电泳结束后，凝胶在凝胶成像仪上或紫外透射仪上观察，供试品与对照药材凝胶电泳 图谱在300-400bp之间应有单一条带。