[DOC]EDA蛋白对人牙乳头间充质细胞一般生物学活性及EGFR表达的影响

[DOC]EDA蛋白对人牙乳头间充质细胞一般生物学活性及EGFR达的影响 EDA蛋白对人牙乳头间充质细胞一般生物 学活性及EGFR表达的影响 JournalofOralScienceResearch,Dec.2006,Vo1.22,No.6 EDA蛋白对人牙乳头间充质细胞一般生物学 活性及EGFR表达的影响 甘云娜王忠义陈苏民赵桂文叶晓兰沈丽娟 (1.第四军医大学口腔医院修复科陕西西安710032; 2.第四军医大学生物化学和分子生物学教研室) [摘要]目的:研究EDA蛋白对人牙乳头间充质细胞一般生物学活性及EGFR表达的影响.方法:测定转染和未 转染plRES2一EGFP—EDA的人牙乳头间充质细胞的生长曲线和碱性磷酸酶活性;免疫荧光法观察转染和未转染 EDA的人牙乳头间充质细胞EGFR的表达,对荧光照片进行灰度扫描,统计学.结果:和未转染者相比,转染 EDA的人牙乳头间充质细胞的增殖有轻度减弱,其碱性磷酸酶活性则有显着减弱.正常人牙乳头间充质细胞有 EGFR的微弱表达,而转染EDA的人牙乳头间充质细胞中EGFR的表达明显增强.结论:EDA基因对人牙乳头间 充质细胞的增殖和活性有抑制作用;这可能与其上调人牙乳头间充质细胞的EGFR的表达有关. [关键词]人牙乳头间充质细胞转染EGFR [中图分类号]R596[文献标识码]A[文章编 号]1671—7651(2006)06—0604—03 BioactivityandEGFRExpressionofHDPMCellsAffectedbyEDAGene.GANYun—rta,WANGZhong一,CHEN Su—ming,eta1.CollegeofStomatology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032 [Abstract]Objetive:TostudybioactivityandEGFRexpressionofhumandentalpapillamesenchymal(HDPM)cellsaf- fectedbyEDAgene.Methods:GrowthCHIVeandALPactivityofHDPMcellstransfectedoruntransfectedwithplRES2一 EGFP—EDAweredetectedandcompared.ImmunofluorescenceappraisalwasusedtodetecttheexpressionofEGFRof transfectedoruntransfectedHDPMcells.Photoesweretakenandgrayscaleswerescanned.Results:Comparedwithan? transfectedcells,HDPMcellstransfectedwithEDAdecreasedtheproliferationandALPactivity.EGFRexpressionwas foundtobeenhancedsignificantlyintransfectedcells.Conclusion:EDAgenedecreasestheproliferationandALPactivity ofHDPMcells,whichmightberelatedtotheincreasedexpressionofEGFR. [Keywords]HumandentalpapillamesenchymalcellsTransfectionEGFR 无汗外胚层发育不全综合征(anhidr0tic/hyp0. hidroticectodermaldysplasia,HED)是一种以毛发,汗 腺,牙齿等外胚层来源的器官发育不全为主要特征 的先天性遗传性疾病….其中,x染色隐性遗传的 无汗外胚层发育不全综合征(X—linkedhypohidrotic ectodermaldysplasia,XLHED)的致病基因为定位于 Xql2—13.1的EDA基因,由KereJ等于1996年 定位克隆成功.大量实验研究表明,EDA基因在 小鼠牙齿的形态发育中起重要调控作用.然而,有 关其对人体细胞和组织的影响还知之甚少.我们已 经建立了稳定转染EDA基因的人牙乳头间充质细 胞,本试验将进一步观察EDA基因对人牙乳头间充 作者简介甘云娜(1975,),女,安徽人,博士,主治医师,主要从事 先天缺牙和牙槽嵴增高的研究工作. 通讯作者甘云娜,电话:(029)84776128 质细胞一般生物学活性及EGFR表达的影响. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1稳定转染pIRES2一EGFP—EDA的人牙乳 头间充质细胞. 1.1.2抗EGFR抗体(博士德公司),ALP活性检 测试剂盒(南京建成生物工程研究所),M1Tr,DMSO (华美公司),0.02%EDTA,D—Hanks液,96孔培 养板,24孔培养板(Costar公司),G418选择培养液, 细胞爬片,多聚甲醛,胰蛋白酶(Gibco公司). 1.1.3主要仪器CO2孵箱(FormaScientific, USA),YJ一875型超净台(苏州净化设备厂),荧光 显微照相系统. 1.2研究方法 1.2.1生长曲线的测定0.25%胰蛋白酶和 0.02%EDTA1:1消化细胞(转染和未转染EDA的 HDPM细胞)3,5nI1n一卉击消化液.加D—Hanks 液洗涤一加禽10%胎牛m清的DMEM终【消化一 吹打,制成单细胞悬液一细胞计数一按每扎l×LC)’ 细胞密度接种于96孔培养板,每孔2001.tl培养液 一每天取6孔细胞每孔))i1人2O1.MTT一37:噼 育4J卜_.,’,心吸弃I清一每孔加八150LDMsO一 在酶标仪中振荡10s.凑取490rim渡I=乏处的吸光度 值一绘制,长IHJ线: I22碱性磷酸酶活性的榆删同上法消化细胞. 进行细胞汁数,按每孔1×10细胞街鹰接种于24 孔培养板一24h后,随机挑选3孔作细胞汁数.另外 3孔用PBS液洗涤1次一每L加裂解液80L一振 动2min---移细胞悬液至Ep管中一按ALP活’检 删试制盒说明『5制备检删样品和对照一分光光度计 检测520tltll波长处的吸觅度值一?计算I×10细胞 基数下转染和未转染plRES2一EGFP—EDA的人牙 乳头问允质细胞的吸光度值 l23细胞免疫荧光染色取制备好的人刊乳头 间觅质细胞爬片一PBS洗涤5m|l1x2一加1:20稀 释的正常lI羊血清室温封闭3Orain一加EGFR抗 体,41过瘦一PBs洗涤5rainx3一加1:IOO稀释 的生物素化二抗.37温育30rain—PBS洗涤5 min×3一加SABC—Cy3荧光二抗.37?温育30 n1in—+PBs洗涤5ntin×3~50%H油封片+荧光 做镜]观察,照牛只一将照片转换成8值灰度像, IPP软件处理. 12.4统计学方法采FI1s;FR岫&逃×20J构凡乳,liiJ履川他 Fig2,FlIexpr,.~ionlll ?I】…l?1)I?.ll EGFR岣挺迅【x20l Fig,3t:q;bRlxpnssiunE’f【lI】F>M cell~tfim~J~,ilh pill2一El,}’PED.g 114 3讨论 l990年.Ble,herS.1{等发现外源性的EGF 可以部分纠I『[II1y小鼠的表征.蚓促进牙齿的萌 出和汗腺的发育KalmlangaJ等发现EGF匝IJ 以通过促进融合结台(f’uMonjILII4-Liol?)的饷化和结膜 囊的形成纠正rabby小鼠跟畸张F的延巡Vag- *的研究丧fl『=】HE1)患者的成纤维细胞i70一KD EGFR蛋闩和mRNA的表达下降(t-Tab1)y小鼠的 成纤维细胞平fI肝脏隔膜.也有EGFII丧达的下降.. HED患暂和Tabhy小鼠的血浆,液中,EGF的 水平却是正常的(;hang一Cui等采fH基因E: 片(tllit’rna/3~.)技术筮耻l’a1)ly小鼠胚胎皮肤EGFR 的在达水平较常/J,鼠i--降,转有刚)A—Al 后.Tabby小时胎皮肤EGFIt的表达水平得到饿 复本实验结l粜也表明EDA的过表达?n引起人 牙乳头充质细胞EGFR的丧达的增媸:u,能是转 606JournalofOralScienceResearch.Dec.2006,Vo1.22,No.6 染pIRES2一EGFP—EDA的人牙乳头间充质细胞 EGFR表达增强,从而增强了细胞对EGF的敏感性, 使得人牙乳头间充质细胞的ALP活性下降,说明 EDA蛋白的过表达可以抑制人牙乳头间充质细胞 向成牙本质细胞分化的能力. SiniEzer等发现瞬时转染EDA基因可引起 MCF一7细胞变园,而对COS一1细胞则没有形态方 面的影响,推测种属的差异使得COS一1细胞缺少 与EDA结合的某种因子.然而,MikkolaM.L等 的研究表明Ta基因的表达并不能改变他们所研究 的几类上皮细胞的形态,但会促进细胞与细胞外基 质的粘附.我们也发现EDA的过表达并不改变人 牙乳头间充质细胞的形态,但其生长和碱性磷酸酶 活性均受到抑制,而EGFR的表达得到加强.EDA 对细胞形态的改变可能只是个别类型细胞的特例, 而它的作用可以体现在更多类型的细胞中.这与其 在多种器官,组织中的广泛分布相一致.然而,EDA 基因突变的小鼠和人,其受累器官只局限在牙齿,皮 肤等需要表皮一间充质相互作用的器官中,提示 EDA的作用很可能发挥在表皮与间充质之间的相 互作用中,可能影响到表皮和间充质细胞之间的某 些核心因子的信号传递.亦或,在其他器官中存在 替代途径,完成正常发育所需的信号传导. 参考文献 [1]VanRamos,DaleL_Giebink.Completedenturesforachildwith hypohidroticectodermaldysplasia:Aclinicreport[J].JPD, 1995,74(4):329—331 [2]KereJ,SrivastavaAK.X—linkedanhidrotic(hypohidrotic)ecto— dermaldysplasiaiscausedbymutationinanoveltransmembrane protein[J].NatureGenet,1996,13(4):409-416 [3]甘云娜,王忠义,陈苏民.EDA在牙胚中的表达及其对人牙乳 头问充质细胞的作用[J].第四军医大学博士学位论文,2003, 4 [4]BlecherSR,KapalangaK.Inductionofsweatglandsbyepidermal growthfactorinmurineX—likedanhidroticectodermaldysplasia 【J].Nature,1990,345,542 [5]KapalangaJ,BlecherSR.Histologicalstudiesoneyelidopening innormalmalemiceandhemizygotesformutantgeneTabby(Ta) withandwithoutepidermalgrowthfactortreatment[J].ExpEye Res,1991,52(2):155 [6]VagasGA,FantinoE.Reducedepidermalgrowthfactorreceptor expressioninhypohidroticectodermaldysplasiaandTabbymice [J].JClinInvest,1996,97(11):2462—32 [7JChang—YiCui,MeredithDurmowiczEDAtargetsrevealedby skingeneexpressionprofilesofwild—type,TabbyandTabby EDA—A1transgenicmice[J].HumMolGenet,2002.11(15) :1763 [8JSiniEzer,David,Schlessinger.Anhidroticectodermaldysplasia (EDA)proteinexpressedinMCF一7cellsassociatedwithcell membraneandinducesrounding【J].HumMolGenet,1997.6: 1581 [9]MikkolaML,PispaJ.Ectodysplasin.aproteinrequiredforepi— thelialmorphogenesis,isanovelTNFhomologueandpromotescell — matrixadhesion[J].MechDev,1999,88(2):133 [收稿日期:2006—03—22](本文编辑王家伟) 欢迎订阅2007年《中国组织工程研究与临床康复》 (原《中国临床康复》)杂志 2007年《中国组织工程研究与临床康复》杂志组稿重点: 生物材料研究:组织工程支架材料,材料与宿主的关系,材料与组织的相容性,血液一材料相互作用评价,组织工程材料 学特征.康复工程研究:医学假体,人工器官,器官移植,骨关节植入物与人体的生物相容性,脊柱脊髓植入物与人体的生物 相容性,血管内介人物与人体的生物相容性,医用电子仪器设备,人体组织器官的三维有限元应力分析,人体组织器官的生物 力学特征.组织构建研究:各器官的组织构建,组织工程与干细胞的相容性,组织工程生物活性因子,组织工程分子生物学, 组织器官构建相关因素.种子细胞研究:干细胞生物学特征,干细胞移植实验,干细胞因子,干细胞实验技术方法,干细胞移 植治疗非血液系统疾病. 欢迎上述研究的英文稿件和应用中医药方法研究的相关稿件投稿. 本刊出版周期:一般稿件修回后6个月出版,”绿色 特快通道”承诺修回稿件3个月内出版.咨询电邮:szblO0@zglckf.com,电话:024—23389106,024—23384352.传真:024— 23381085.投稿电邮:kf23385083@sina.comkt22838105@sina.com.国内订阅邮发代号:8—584,本社订阅:辽宁省沈阳1200 邮政信箱,邮编:110004.更多信息详见WWW.zglckf.com.