亲和层析法制备人血浆白蛋白

亲和层析法制备人血浆白蛋白 () 文章编号 :100322843 20000120067205 亲和层析法制备人血浆白蛋白 凌云 , 姚金鑫 ( )成都生物制品研究所 ,成都 610063 摘要 :低温乙醇法 FIV 沉淀中含有白蛋白 96 . 00 ?13 . 52g/ kg. 15 倍生理盐水磷酸缓冲液可 ( ) 溶解其中的 87 . 44 % 约 83 . 94 ?11 . 11g/ kg . 通 过 DEAE Affi2Gel Blue 亲 和 层 析 及 DEAE2 Sepharose FF 离 子 交 换 层 析 两 步 分 离 的 纯 化 工 艺 , 可 从 FIV 溶 解 液 中 回 收 白 蛋 白 48 . 18 ? 1 . 11g/ kg FIV ,回收率为 57 . 40 ?1 . 94 % . 白蛋白溶液呈淡黄色 ,澄清透明 ,纯度为 98 . 28 ?1 .68 % ,单体含量 97 . 00 ?2 . 19 % ,吸收度为 0 . 028 ?0 . 006 . 白蛋白试制品能耐受 57?C50h 热稳 定性试验. 各检测指标显示 ,通过亲和层析综合阴离子交换层析回收纯化的白蛋白制品各主要 生化指标符合质检要求. ( ) 关键词 :亲和层析 ;离子交换层析 ;组分 IV FIV;白蛋白 + 文献标识码 :A中图分类号 :Q512 . 1 白蛋白是一种在临床上大量使用的血浆蛋白制剂. 国内外普遍采用低温乙醇法血浆蛋白 分离工艺 ,从人血浆中分离纯化正常人血浆白蛋白. 有资料报道 ,低温乙醇法分离工艺形成的 FIV 沉淀中残留有较大量的白蛋白 ,导致分离过程中大量白蛋白的流失 ,影响了血浆白蛋白的 1 ,3 ,7 回收. 随着血浆资源的日渐紧俏 ,生产规模的扩大 ,回收 FIV 中的白蛋白 ,提高人血浆蛋 白的充分利用已是一个值得探讨的问题. 目前 ,已应用于 FIV 白蛋白回收的方法有多种 ,如热 2 ,7 1 ,3 变性工艺 、柱层析工艺等. 亲和层析技术的应用亦是其中之一. 亲和层析通过生物分子对偶联配基的分子识别 ,产生亲和力 ,从而达到分离纯化生物大分 子的目的. 1976 年 ,Travis 等人将染料 Cibacron blue 3 G2A 偶联到琼脂糖凝胶上 ,成功制备了对 1 ,3 白蛋白具有亲和力的兰色亲和凝胶 ,并将其应用于白蛋白规模化制备获得成功. 在此我们 开展了亲和层析技术综合离子交换层析技术纯化制备 FIV 沉淀中白蛋白的研究.1 材料与方法 1 . 1 FIV 沉淀 随机抽取 96 年度成都生物制品研究所常规低温乙醇工艺生产过程中形成的 FIV 沉淀 , - 30?C 冰冻保存. 1 . 2 亲和凝胶 DEAE Affi2Gel Blue ,美国 B IO2RAD 公司赠品 ;DEAE2Sepharose FF 凝胶 ,瑞典 Pharmacia Biotech AB 出品. 1 . 3 FIV 的溶解 FIV 在 15 倍生理盐水磷酸缓冲液中充分溶解 ,除去不溶物后上清液经 EKS 板澄清过滤 ,使 FIV 溶解液澄清适合于层析分离. 收稿日期 :1999211218 () 作者简介 :凌云 1962 - ,男 ,成都生物制品研究所师 1 . 4 不溶物中蛋白及白蛋白含量的检测 FIV 溶解后产生的不溶物 ,5 倍 0 . 5mol/ L NaCl 再次 溶解 ,检测混悬液中总蛋白含量及白蛋白的含量. 1 . 5 亲和层析 填装 DEAE Affi2Gel Blue 亲和层析柱 ,柱高 20cm. p H7 . 5 生理盐水磷酸缓冲液 (平衡柱床 ,层析线流速 20cm/ hr . FIV 溶解液上柱吸附 ;上柱量 :0 . 15g FIV 沉淀/ ml 凝胶 约 32mg ) ( 蛋白/ ml 凝胶;2 . 5 倍柱床体积的平衡缓冲液洗去大部分杂蛋白后 ,2mol/ L NaCl 含 8mmol/ L ) 辛酸钠磷酸缓冲液洗脱白蛋白. 280nm 紫外光连续监测蛋白峰 ,按峰收集蛋白组分. 1 . 6 白蛋白的精制 填装 DEAE2Srpharose FF 柱 ,柱高 15cm ,体积约为亲和凝胶柱床体积的 15 %. PH4 . 5 醋酸钠缓冲液平衡 DEAE2Sepharose FF 柱 ,层析线流速为 120cm/ h. 合并两次亲和层析分离后获得的白蛋白组分 ,调节 p H 至 4 . 50 并调节盐浓度与平衡液保 持一致 ; + 4?C 放置. 白蛋白组分澄清后在 DEAE2Sepharose FF 柱上吸附 ,收集流穿蛋白峰. 最后 经脱盐浓缩 、病毒灭活 、除菌分装等后处理 ,制备成试制品 . 纯化制备见图 1 . FIV ?制品 ? 溶解?亲和层析?离子交换层析? 后处理 图 1 白蛋白亲和层析制备流程示意图 1 . 7 检测 根据《中国生物制品规程》95 年一部规定的方法检测白蛋白制品主要的生化指 () () () 标 . 1醋纤膜电泳法检测蛋白纯度 ; 2双缩脲法检测蛋白浓度 ; 3单体含量检测在 Pharmacia ) (() 公司生产的 FPLC 快速液相蛋白层析仪上完成 ,凝胶柱为 Superose 12 HR 10/ 30自动完成紫 () () ) 外吸收峰的积分 ; 5分光光度计上检测 403nm 波长的吸收度 ; 6其它检测 :a,聚丙烯酰胺电 8 ) ) 泳按资料中的方法进行 ; b物理外观检测 :物检灯下目检制品外观 ;c热稳定性试验 :制品在 50C? 水浴中孵育 50h 后 ,观察加热前后物理外观有无变化. 2 结果 ( 2 . 1 FIV 的溶解 FIV 沉淀中含总蛋白 272 . 27 ?28 . 63g/ kg FIV 湿重 n = 5 , p = 0. 05 , t - 1 = n ) 2 . 776,其中白蛋白的含量为 96 . 00 ?12 . 52g/ kg FIV 湿重 ,占 FIV 蛋白总量的 35 . 26 % . FIV 总 蛋白中的 212 . 60 ?34 . 79g 蛋白/ kg FIV 可溶解于 15 倍生理盐水磷酸缓冲液中 ; 其中白蛋白的 溶解量为 83 . 94 ?11 . 11g/ kg FIV. 结果见 1 . 表 1 FIV 中白蛋白含量的检测结果 ()()样品 总蛋白含量 g/ kg FIV 白蛋白含量 g/ kg FIV 272 . 27 ?28 . 63 ?13 . 52 96 . 00 FIV FIV 溶解液212 . 60 ?34 . 7983 . 94 ?11 . 11 59 . 67 ?20 . 83 12 . 06 ?4 . 72 FIV 不溶物 ( )n = 5 , p = 0 . 05 , t - 1 = 2 . 776 n ( ) 2 . 2 纯化 FIV 溶解液中 ,白蛋白的纯度为 39 . 48 ?6 . 83 % n = 5 , p = 0. 05 , t - 1 = 2 . 776. n 亲和凝胶吸附后 ,平衡缓冲液可洗去大部分杂蛋白 ;2mol/ L NaCl 洗脱的蛋白组分中 ,白蛋白纯 度提高到 88 . 38 ?3 . 24 % . DEAE2Sepharose FF 层析步骤使白蛋白在流穿峰中得到进一步纯化 , 纯度达到 97 . 67 ?1 . 45 % . 各纯化步骤的紫外监测结果见图 2 . 图 2 各层析步骤紫外监测 a . DEAE Affi2Gel Blue 亲和层析图谱 b. DEAE2Sepharose FF 离子交换层析图谱 经 DEAE Affi Gel Blue 亲和层析 、DEAE2Sepharose FF 离子交换层析两步纯化后 ,FIV 溶解液 ( ) 中 58 . 04 ?2 . 01 % n = 5 , p = 0. 05 , t - 1 = 2 . 776的白蛋白得到回收 ,总蛋白回收为 23 . 58 ?2 .n 23 % . 各步骤的总蛋白回收 、白蛋白回收及白蛋白纯度见表 2 . 聚丙烯酰胺电泳结果显示 ,回收 获得的白蛋白制品 ,电泳检测为白蛋白. 电泳图谱见图 3 . 表 2 层析过程中总蛋白 、白蛋白回收及纯度 ( )( )( )样品 总蛋白回收 % 白蛋白回收 % 纯度 % FIV 溶解液 100 ?6 . 83 100 39. 50 亲和白蛋白 28 . 30 ?2 . 70?6 . 4588. 38 ?3 . 2462 . 58 DEAE - 白蛋白 23 . 58 ?2 . 2358 . 40 ?2 . 0197. 67 ?1 . 45 制品 23 . 07 ?2 . 0457 . 40 ?1 . 9498. 28 ?1 . 68 ( )n = 5 , p = 0 . 05 , t - 1 = 2 . 776 n 图 3 各层析步骤蛋白组分的聚丙烯酰胺电泳图谱 ( ) 样品分别为 从左至右: a :血浆 ; b : FIV 溶解液 ;c :亲和层析杂蛋白 ; d :亲和层析白蛋白 ;e :DEAE - 层析白蛋白 ;f :DEAE - 层析杂蛋白 2 . 3 质量检测 根据《中国生物制品规程》95 版一部的要求 ,对多批终制品进行质量检测 ,制 ( ) 品外观为淡黄色 、澄清透明 ,制品纯度为 98 . 28 ?1 . 68 % n = 5 , p = 0. 05 , t - 1 = 2 . 776,单体 n 含量为 97 . 00 ?2 . 19 % , 吸收度为 0 . 028 ?0 . 006 . 经 57?C 50h 热稳定性试验后 ,制品外观无变 化 ,仍为澄清透明液. 检测结果显示 ,制品主要生化指标符合规程要求. 终制品的回收率为 48 . 18 ?1 . 11g/ kg FIV . 其结果见表 3 . 表 3 终制品主要生化检测结果 ( )( )( )()项目 外观 热稳定性试验 纯度 % 单聚体 % 吸收度 % 白蛋白收率 g/ kg FIV 检测结果范围 96. 7,100 ,99 . 5 ,0 . 034 ,49 . 16 淡黄 、澄清透明 合格 95 . 30 . 02047. 20 平均98 . 28 ?1 . 6897 . 00 ?2 . 190 . 028 ?0 . 00648 . 18 ?1 . 11 ( )n = 5 , p = 0 . 05 , t - 1 = 2 . 776 n 3 讨论 当前 ,在国内 ,低温乙醇法血浆蛋白生产线投浆量占全国总投浆量的绝大部分 ,不可避免 地 ,在 FIV 中流失的白蛋白量亦大. 在我们的检测中 ,FIV 中的白蛋白含量为 96 . 00 ?13 . 52g/ kg FIV 湿重 , 大致相当于每升血浆约 3 . 2g 白蛋白在 FIV 中流失 , 这一数据约低于中外资料报4 ,6 道. 尽管如此 ,FIV 仍可作为白蛋白制备的起始原材料 ,进行人血浆的综合利用. 然而 ,在国 内的各种报道中 ,有关废弃组分中白蛋白回收的报道甚少. 我们希望通过建立回收 FIV 中白蛋 白方法来探讨进行废弃资源的再利用 、提高血浆的利用率的可能性 . 在我们建立亲和层析回收 FIV 白蛋白的研究中 ,平均每公斤 FIV 可回收 48 . 18g 白蛋白 , 这大致相当于每吨血浆可多回收白蛋白约 1 . 62 公斤. 由此可以肯定 ,亲和层析技术的应用 ,可 使血浆资源得到进一步的利用 ,提高单位血浆的白蛋白回收率. 参考文献 : 1 Harvey M J . 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Published by Pharmacia Fine Chemicals. 1983 :21,24 . 8 Application of Aff inity Chromatogra phy to Purif ication of Human Al bumin L ING Yun , YAO Jin2xin ( )Chengdu Institution of Biological Products , Chengdu. 610063 ( ) Abstrate : Cold Fraction IV F ?paste contains 96 . 00 ?13 . 52g/ kg of albumin. 87 . 44 percent of () the albumin about 83 . 94 ?11 . 11g/ kgcould be dissolved in 152fold volumes of PBS2saline from F ?pasre , of which 48 . 18 ?1 . 11g/ kg of albumin could be recovered by a two2step process with a DEAE Af2 fi2Gel Blue affinity chromatography and a DEAE2Sepharose FF ion2exchange chromatography. The recov2 () ery rate is 57 . 40 ?1 . 94 % to Fiv solution. The albumin preparation shows a little yellow colour , and is clear. The purity of albumin is 98 . 28 ?1 . 68 % , monomer is 97 . 00 ?2 . 1 % , and Abs1 % 403nm icm 0 . 028 ?0 . 006 . The albumin preparation is stable after heat2treat at 57 ?for 50 hours. All biochemical index of albumin preparation purified from Fiv paste is capable of meeting the requirement in“Chinese Regulation of biological Products”. ) ( Key words : affinity chromatography ; ion2exchange chromatography ; fraction IV F ?, albumin