成熟视网膜神经节细胞三维培养

成熟视网膜神经节细胞三维培养 成熟视网膜神经节细胞三维培养 236 第30卷第2期 2004年3月 吉林大学(医学版) JournalofJilinUniversity(MedicineEdition) Vo1.30No.2 March.2004 [文章编号]1671—587X(2004)02—0236—03 成熟视网膜神经节细胞三维培养 张小猛,徐眷玲,庞利民, 吉林长春130041; (1.吉林大学第二医院眼科, 张晓光,高野雅彦 2.日本北里大学眼科,日本228—8555) [摘要]目的:建立成熟视网膜神经节细胞的三维培养模型.:将边长500um的方形网膜片神经纤维层 向下浸入12孔培养板的胶原溶液层中,胶原溶液凝固后,培养孔内加入无血清MEM培养液.相差显徽镜观察生 长情况.应用羊抗鼠FITC—Thy一1.1单克隆抗体鉴定培养的神经节细胞突起.结果:视网膜神经节细胞突起在凝胶 中呈螺旋迂曲生长,可存活2周以上.免疫组化荧光显色神经节细胞突起呈阳性反应.结论:应用凝胶做支持物 对成熟视网膜神经节细胞进行三维原代培养.是一种成功的,可广泛应用的培养方法. [关键词]视网膜神经节细胞;组织培养/方法;三维培养 [中圈分类号]R一332;Q813.11[文献标识码]A Establishmentofnewculturesystemforretinalganglioncells ZHANGXiao—meng,XUChun—ling,PANGLi—min.ZHANGXiao— guang,MASAHIKOTakano. (1.DepartmentofOphthalmology,SecondHospital,JilinUniversity,Changchun130041,China; 2.DepartmentofOphthalmology,KitasatoUniversity,SchoolofMedicine.Japan228-8555) Abstract:ObjectiveToestablishanewculturesystemforretinalganglioncells(RGCs).MethodsFourmale Wistarratsaged10weeks.retinawasisolatedfromthechoroid.thepigmentepitheliumandadherentvitreous. Theretinalexplantsfrommid— peripheralretinasweredissectedinto16pieces(approximately0.5mmX0.5mm square).FourpiecesofretinaltissueswereembeddedinthetypeIcollagengelwiththenervefiberlayer downwardonplasticdish.Eachdishwaspre—coatedwith10mg?L_.poly—L— lysine.Theexplantswerecultured inserum—freeMEMandmaintainedat37? inanincubatorundera5CO2/95airatmosphere.Thenumberof outgrowingneuralprotuberanceswascountedunderphasecontrastopticsusinginvertedmicroscope. Immunohistochemicalmarkers,monoclonalantibodiesagainstneurofilamentandThy1.1wereusedtOidentifythe natureoftheoutgrowingprocesses.ResultsUsingthethree-dimensionalculture,theretinalexplantswerestably embeddedjustbelowthesurfaceofthegel,andtheycouldbeculturedfor2weeksormore.Theoutgrowing neuralprotuberancescouldelongatemorefreelyintogelinthethree— dimensionalculturethaninthetWO- dimensionalone.ConclusionRGCscanbeculturedsucecessfullyinthethree— dimensionalculture. Keywords:retinalganglioncells;tissueculture/methods;three—dimensionalculture 许多疾病可造成视网膜神经节细胞的损伤和死 亡,导致永久性失明,如青光眼,视网膜变性,糖 尿病视网膜病变,脱髓鞘性疾病,肿瘤,视神经病, 缺血和外伤等?.建立视网膜神经节细胞(retinal ganglioncells,RGCs)体外培养体系,探索各种疾 病导致RGCs损伤的机制,促使RGCs再生是挽救 视功能的关键.本文作者应用三维视网膜神经节细 胞培养方法观察成熟视网膜神经节细胞的再生及其 生长周期,为今后体外研究视网膜神经节细胞的生 理学及药理学奠定基础. [收稿日期]2003—09—12 [基金项目]长春市科技发展项目(Ol—l12536) [作者简介]张小猛(1973一).男.吉林省长春市人.在读医学博士.主要从事眼底病研 究. 张小猛,等.成熟视网膜神经节细胞三维培养237 材料与方法 大鼠培养网膜的获得10周龄的Wistar系 鼠4只,乙醚麻醉后摘出完整眼球,在显微镜下 欠除去角膜,巩膜和脉络膜,再除去晶体和玻璃 分离网膜.上述操作要求动作轻巧快速准确,分 网膜时,要把玻璃体完全清除干净.切除周边网 取距视盘1.0,1.5mm处网膜,切成边长 'm的方形网膜片16片.上述操作要求在培养 勾完成,无菌操作,避免细菌污染. :网膜片的培养在0V环境下,将配置好的胶 骞液滴于用10mg?L-1多聚赖氨酸包被的培养 央,形成直径15mm的胶原溶液层.胶原溶液 以下成分组成:?用CH.COOH溶液稀释的 :I型胶原(从大鼠尾巴提取)pH3.0;?10倍 蔓的MEM培养液;?每100ml含NaHCO. :Og和Hepes4.77g的0.05mol?I_.NaOH. :?:?一8:1:1.将网膜片的神经纤维层向下 人胶原溶液层中,每孔4片.37C水浴5min.液 变原凝固成盘状凝胶,网膜片固定在其中(图 ).培养孔中加人培养液,置于5CO,37'C恒 喜中.隔日换培养液.培养液成分如下:不含血 向MEM,2.7g?L的葡萄糖,5mg?L的胰 茛,16.1mg?L-1的肉毒碱,792mg?L的小牛 青白蛋白,5.2g?L-1的Na2SeO3,3.7g?I ._;? 潜? : ,- 囊蠢:《 ABC 的NaHCO3,3.6g?L的Hepes.用相差显微镜观 察生长情况. 1.3免疫组织化学染色取培养3,6,9d后的网 膜片,行抗大鼠Thy一1.1单克隆抗体免疫细胞学检 查,同时设立阴性对照组.方法:在培养孔中加人 2多聚甲醛(PBS,pH7.4)固定30rain.PBS冲 洗3次后,实验组加人Thy1.1单克隆抗体 (1:1oo),阴性对照组加入含1%小牛血清白蛋白 的PBS,4C振荡过夜.3次冲洗后加FITC一标记的 羊抗鼠抗体(1:30),4?振荡过夜.荧光显微镜观 察结果.. 2结果 Olympus倒置显微镜下观察,可见视网膜片在 培养24h内出现短而小的再生神经突起(见图 1B),48,72h后再生突起数目逐渐增多,长度逐渐 伸长,形成典型的神经突起形态(见图IC),前端有 其生长的特征性的伞状生长圆锥结构(见图1D). 第7天左右(见图1E),再生突起数目达到顶峰,以 后逐渐回落,第15天仍能观察到再生的神经突起. 神经突起在凝胶中盘旋迂曲生长,逐渐伸长,最长 可超过3mm.少数突起之间相互连接.用抗大鼠 FITC—Thy一1.1单克隆抗体对培养物进行免疫细胞 化学染色,生长的突起呈阳性反应,证明其来源于 大鼠神经节细胞. 舞 |. ' t? ; __ D 豢一 ?I }棼 ? 警 E 1Resultsofobservationunderinvertedmicroscope t.etinaltissuewasfixedintothree—dimensionalcollagengel(×40);B:Phase— contrastmicrographofculturedretinaat24 rsinvitro(×200);C:Phase—contrastmicrographofculturedretinaat3daysinvitro(× 200);D:Aregeneratingneurite 1flspreadgrowthcone(×400);E:Phase— contrastmicrographofculturedretinaat7daysinvitro(×200) 讨论 传统观点认为哺乳动物的中枢神经系统的轴突 乏损伤后是不能再生的.但近年来的研究表明,视 皂的神经节细胞在轴突受损伤后,和末梢神经一 巳具有一定的再生能力.特别是应用RGCs体外 培养技术,可以明确的观察到RGCs的轴突再生. 自Raff等l-2采用完全消化法于体外成功地培 养了生后2,3d大鼠RGCs以来,许多学者曾先后 对其进行过研究"j.目前采用的体外培养方法有纯 化培养和体外混合培养.纯化培养的细胞数少,胞 体较小,突起较短,大多只能存活48h.有人在培 238吉林大学(医学版)第3O卷第2期2004年3月 养皿中加入生长因子(表皮生长因子,成纤维生长 因子)或神经营养因子如脑源性神经营养因子 (BDNF),神经营养素一4(NT一4)等进行培养],但 细胞因子价格昂贵,人为加入辅助物可能会影响 RGCs的生理功能.混合培养的RGCs存活率高,但 因受其它视网膜细胞的影响,在不同培养液中的表 现较复杂,结果难以解释. 本实验方法相对简化,神经突起生长成活率较 高,存活时间较长.网膜片在凝胶中固定,以凝胶 为支持物,神经突起呈三维立体生长,不易移动,易 于观察计数,且不需要昂贵的神经生长因子,仅用 无血清培养液可存活2周以上,染色方法简便.本 方法把RGCs和固有的神经支持细胞一起培养,比 单体细胞的单层培养及多种细胞的混合培养更接近 于体内环境,更适合观察神经突起生长,培养出的 神经突起更接近于生理状态. Thy一1抗原是存在于啮齿类动物许多细胞表面 的一种糖蛋白,Thy一1.1抗原仅表达在大鼠神经节 细胞上,被广泛应用于鉴定大鼠神经节细胞.本实 验培养生长物Thy一1.1单克隆抗体染色呈阳性,证 明培养生长物为大鼠神经节细胞突起. 以往的培养方法只能采用刚出生不久的动物, 如果动物年龄稍大,培养效果就大受影响,或不能 生长.绝大多数损害RGCs的疾病都发生在个体成 熟或老化时.如果使用体外培养的刚出生不久的动 物RGCs模型研究这些疾病,因此时RGCs尚处于 幼稚阶段,不能完全代表成熟或老化时的RGCs的 生理及病理状态.应用本方法培养成熟的RGCs,得 出的结论更具有说服力. [参考文献] [1]ShatzCJ,OlearyDD.RepairandreplacementtOrestoresight [J].ArchOphthalmo1.1993,111:472—477. F2]RaftMC,FieldsKL,HakomoriSI,eta1.Cell—type-specific markersfordistinguishingandstudyingneuronsandthemaior classesofglialcellsinculture口].BrainRes,1979,174:283— 308. [3]LeiferD,LiptonSA,BarnstableCJ.eta1.Monoclonalantibody tOThy一1enhancesregenerationofprocessesbyratretinal ganglioncellsinculture[J].Science,1984,224:303—306. [4]MontaguePR,FriedlanderMJ.Expressionofanintrinsic growthstrategybymammalianretinalneurons[J].ProcNatl AcadSciUSA.1989,86:7223—7227. [5]刘文文.徐萍,黄倩.胚胎与成人视网膜神经细胞 培养[J].中华眼底病杂志,2002,18:279?282. 应用骨折多功能复位固定器治疗胫骨多段骨折 解放军第208医院骨一科陈伟民 解放军96451部队医院李旭升 长春市合心医院张代玉 1996—2001年本院应用自制骨折多功能复位外固定器治疗胫骨多段骨折32例,均取得良好效果.现报道如下. 1临床 本组32例,男27例,女5例.年龄18,65岁,平均年龄为39岁.受伤原因:车祸29例.磋伤2例,机器绞伤1例. 其中闭合性骨折25例,开放性骨折7例,均伴有腓骨骨折.全部骨折均采用自制的骨折多功能复位外固定器固定. 2方法 2.1外固定器的机械结构及功用此器械为双架式结构,由3部分组成:?孔槽式固定轴8个,是一种圆柱形结构,以下 方的圆台为界分为上下两段.上段外有螺纹.中间有一长孔槽,供固定针插入固定(用其上的两个螺帽);下段光滑无螺纹, 供插人旋转臂的孔内,通过其下端的螺孔.用固定螺钉和垫圈固定在旋转臂上,螺钉放松,轴可在旋转臂上旋转.以适应固 定的移动;?旋转臂8个,上有空间十字交叉的两孔.一为固定轴的插孔,一为调节杆的穿孔,是孔槽式固定和调节杆的连 接装置,可在调节杆的套管上旋转,又可沿管滑动,以适应固定针的位置需要;?调节杆2个,由相同长度的左右两个套管 和调整螺杆组成,连接旋转臂把整个复位固定器组成一体,通过杆伸缩矫正畸形. 2.2手术方法硬膜外麻醉,根据小腿皮肤损伤情况可采用胫骨前直切口或前外侧切口,尽可能保留软组织,骨膜与大骨 片的连接,减少骨膜剥离,一般不作胫骨后的剥离,碎的大骨块先用螺丝钉互相固定.术中可根据情况,如两段以上骨折于 骨折上段横穿1枚斯氏针,再于骨折中段横穿2枚斯氏针,下段横穿1枚斯氏针, 使4根针对穿内外侧皮肤,骨折中段也可 不穿针,将骨折复位后上外固定架,固定后分别纵向加压,拧紧各部分,如骨折段数更多则用特制外固定架. 3结果 本组32例经随访1,1.5年,无一例骨折不愈合及骨髓炎形成,骨折愈合时间为2,6个月,拆架时间为3,11个月,膝 关节及踝关节功能均恢复正常,基本全部解剖复位.其中3例因骨折粉碎严重及骨丢失取髂骨植骨.伤口均无感染. (下转第241页)