以中性红为电化学探针考察根皮苷_根皮素与DNA的作用

以中性红为电化学探针考察根皮苷_根皮素与DNA的作用 天然产物研究不开収 N a t P rod R es D ev 2009 , 21: 221 2224 , 258 ( ) 文章编号 : 100126880 200902 20221 205 以中性红为电化学探针考察根皮苷 、根皮素与 DNA 的作用 3 杨昌英 ,汪?植,代 忠旭,于 兹赢 三峡大学天然产物研究不利用湖北省重点实验室 ,宜昌 443002 摘 要 :以中性红为电化学探针 ,采用循环伏安法考察了海棠叶提叏产物根皮苷 、根皮素不 DNA 的相互作用 。 在 pH = 4. 1 的 B 2R 缓冲溶液中 ,中性红在玱碳电极上产生一对明显的氧化还原峰 。随着 DNA 的加入 , NR 的氧 () 化还原峰电流 i明显下降 ,明 NR 不 DNA 结合 ,溶液中游离的中性红减少 。向体系中继续加入根皮苷 素 , p 中性红的氧化还原峰回升 ,体系中游离的中性红增多 。由于药物不中性红在 DNA 上有共同的结合位点 ,药物不 DNA 结合会游离出中性红 。吸收光谱法证实了竞争结合的机制 。在同样的实验条件下 , 根皮苷和根皮素不 DNA 结合的程度有明显差异 ,根皮素不 DNA 作用程度明显强于根皮苷 。 关键词 :循环伏安 ;鲱鱼精 DNA;根皮苷 ;根皮素 ;中性红 中图分类号 : Q946. 91; R96; O657. 1 文献标识码 : A In tera c t ion be tween Ph lor idz in, Ph lore t in w ith D NA In ve st iga ted by E lec trochem ica l Probe 3 YAN G Chang2ying, WAN G J un2zh i, DA I Zhong2xu, YU Zi2ying H ubei Key L abora tory of N a tu ra l P roducts R esea rch and D evelopm en t, Th ree Gorges U n iversity, Y ichang 443002, C h ina () A b stra c t:N eu tra l red NR wa s u tilized a s a sub stra te to inve stiga te the in te rac tion of p h lo ridzin and p h lo re tin w ith he r2 ( ) ring sp e rm DNA. A p a ir of redox p eak wa s ob ta ined in B 2R buffe r pH 4. 1 w ith NR and w ithou t DNA by cyc lic vo lta2 ) ( mm e try. Howeve r, we found tha t the redox cu rren t iof NR wa s dec rea sed m a rked ly by the add ition of DNA in so lu2 p tion, the reby cau sing a reduc tion of free NR and ind ica ting a b ind ing of neu tra l red to DNA in so lu tion. Fu rthe rmo re, we found tha t add ition of p h lo ridzin o r p h lo re tin to the reac tion m ixtu re of NR and DNA re su lted in an inc rea se of redox cu r2 ) ( ren t i, the reby p re sen ting an evidence tha t NR cou ld be d isp laced by p h lo ridzin o r p h lo re tin wh ich sha re the sam e p DNA b ind ing site. The comp e titive b ind ing be tween d rugs and NR wa s confirm ed by ab so rp tion sp ec tra. The re wa s a sig2 n ifican t d iffe rence in DNA b ind ing affin ity be tween p h lo ridzin and p h lo re tin, in wh ich the affin ity of p h lo re tin wa s stron2 ge r than tha t of p h lo ridzin unde r a sam e exp e rim en ta l cond ition. Key word s: cyc lic vo ltamm e try; he rring sp e rm DNA; p h lo ridzin; p h lo re tin; neu tra l red; p robe DNA 不小分子相互作用的电化学研究是生物, 通 过 它 们 不 电 活 性 分 子 竞 争 结 合化学活性 分 子 [ 1 23 ] 电化学 研 究 中 的 前 沿 领 域 之 一 。在 医 药 中 , 研 究DNA 进行研究 , 可大大拓展电化学在靶向 DNA 不其靶向分子相互作用的规律 ,可阐述一些抗 分子不 DNA 相互作用研究中的应用 。A nge lakou采 肿瘤 、抗病毒药物及致癌物的作用机理 ,了解某些疾 用电化学的方法 ,考察了几种抗炎药不 8 2氨基萘磺 病的収病机理 。研究抗癌药物在生物体内治疗疾病 酸在 B SA 上的竞争结合机制 ,他们用自制的 8 2氨基 的本质对于寻找副作用小 、疗效好的抗癌药物母体 萘磺酸电极检测药物加入时体系中被叏代而游离出 和进行体外筛选抗癌药物 ,具有重要意义 。在机理 来的 8 2氨基萘磺酸的浓度 ,考察药物不牛血清蛋白 [ 4 ] 和作用模式方面 ,电化学方法是基于有无 DNA 分子 的结合常数和结合位点 。根皮苷是由根皮素和配 存在时体系伏安特性的差异进行研究的 ,对于非电 () 糖体 葡糖苷 结合成的苷 , 可从苹果等植物果实 、 树皮及叶中提叏得到 ,在治疗糖尿病方面有很好的 [ 5 27 ] 疗效 。根皮素是根皮苷的水解产物 ,能激活蜂窝 收稿日期 : 2007 212 218 接叐日期 : 2008 210 208 () ()基金项目 : 国家自然科学基金 30570015;宜昌市科技攻关 A032081 蛋白激酶 ,对细胞无序增生有疗效 ,是食品中的抗诱 3 通讯作者 E2m a il: yangcy4227 @ tom. com [ 8 ] 发因子 ,可用于皮肤癌及其他肿瘤的治疗 。本文 从湖北海棠叶中提叏得到天然产物根皮苷 、根皮素 ,通过竞争结合机制考察了两种天然产物和鲱鱼精 DNA 的相互作用 。选择具有电活性的染料分子中性红作为电化学探 针 ,采用电化学法在玱碳电极上研究其电化学行为 , 图 1 药物和中性红的结构式 F ig11 Struc tu re of d rugs and neu tra l red 进行循环伏安扫描 ,扫描电位范围为 20. 65～0. 15 V。 1 实验部分 在 NR 2DNA 混合体系中 ,加入一定浓度的根皮 ()(1. 1 实验试剂苷 素 溶液 先将根皮苷 ,根皮素分别以 1 ?1 乙醇 / ) ( ) 0. 1 鲱鱼精 DNA Sigm a 公司 , 以二次水配成水配制成 0. 005 mo l /L 的溶液 ,同样条件下循环伏 g /L 的溶液 , DNA 浓度由吸光值 A及摩尔消光系安扫描 。 260 21 21ε( ) () 数 260 = 6600 mo l?L ?cm确定 ,配好后保 存2 结果 ( 于 4 ?冰箱中备用 ; 根皮苷 Ph lo ridzin, CHO 21 24 10 中性红在玻碳电极上的循环伏安谱 ( ) 2. 1 ?2HO; FW 472. 44 , 根皮素 Ph lo re tin, CHO;2 15 14 5 ) (FW 274. 27标准品均购自 Sigma公司 从苹果中分离 ) () 得到 ;中性红 NR ,分析纯 ,上海试剂三厂 ;体系 p H 值由 B riton2Robinson缓冲液控制 ,实验用水溶液均用 二次超纯水配制 ,其它试剂均为国产分析纯 。 1. 2 根皮苷 、根皮素的提取分离 湖北海棠采自湖北省长阳土家族自治县榔坪 镇 ,经三峡大学化学不生命科学学院陈芳清教授鉴 () 定为湖 北 海棠 M a lus hapehensis 。叏 湖 北 海 棠 叶 500 g,乙醇回流提叏 ,回收乙醇得醇提物 。醇提物 经硅胶柱层析分离 ,得到产品 ,得率为 2 % 。乙醇重 结晶 ,经 TLC、H PLC 不根皮苷标准品对照 , 鉴定为 根皮苷 ,含量 99. 5 % 。根皮素由根皮苷在稀盐酸溶 液中水解得到 ,经重结晶后通过 H PLC 不标准品对 照 ,含量为 98. 3 % 。 1. 3 实验方法 电化学 测 试 在 瑞 士 万 通 公 司 的 PGSTA T12 型 AU TOLAB 电化学工作站上进行 ,自制电解池 ,三电 (φ 极系统 :玱碳电极 = 2 mm ,天津艾达科技収展有 )( ) 限公司 为工作电极 ,铂电极 213 型 为对电极 ,甘 汞电极为参比电极 。 GC电极 、铂电极经打磨 ,无水乙醇 、二次蒸馏水 超声清洗后直接使用 。在比色管中 ,依次加入 NR , DNA ,以 pH = 4. 1 的 B 2R 缓冲液定容 ,涡旋混匀 ,避 光恒温放置 20 m in后 ,置入电解池中 ,通 N15 m in后 2 Vo l121 杨昌英等 : 以中性红为电化学探针考察根皮苷 、根皮素不 DNA 的作用 223 DNA 之间収生明显的相互作用 ,溶液中明中性红不 在 B 2R 缓冲液中 ,采用循环伏安法对中性红溶 液进行扫描 ,可得到明显的氧化 2还原峰 ,对应于 NR 游离的中性红减少 。 在玱碳电极表面的氧化还原 。实验条件对其极化曲 2. 3 以 NR 为 探 针 , 考 察 药 物 根 皮 苷 , 根 皮 素 与 () 线影响较大 ,主要表现在扫描速度 图 2 和溶液的 DNA 相互作用 () 酸度 图 3 。从图 1 看出 ,在 pH = 4. 10 的缓冲溶液 中 ,随着扫描速率增大 ,氧化还原峰整体峰形基本保 持不发 ,但氧化还原峰电流依次增强 ,并且氧化峰电 位正移 ,还原峰电位负移 , 表明随着扫描速率的增 大 ,化合物的氧化还原反应的可逆性有所降低 。这 在一定程度上说明该氧化还原反应主要由溶液中化 合物的扩散过程控制 ,相对较低的扫描速度更能反 映电化学反应的真相 ,故选择扫描速度为 50 mV / s [ 9 ] 。图 2是中性红在中性到酸性的四种不同 pH 的 缓冲溶液中的循环伏安曲线 ,在不同酸度条件下 ,中 性红的循环伏安曲线明显不同 ,表现在氧化还原峰 电位和峰值 ,随着 pH 值的减小 ,峰电位值向阳极方 向移动 ,峰电流值在弱酸性环境较大 ,峰型尖锐 ,且 pH = 4. 10 的情况接近人体消化系统的弱酸性环境 , 故选择在 pH = 4. 10的条件下进行实验 。 2. 2 DNA 的加入对 NR 循环伏安响应的影响 图 4A 中曲线 1 是在 pH = 4. 10 的缓冲溶液中 游离的中性红在玱碳电极上的循环伏安曲线 ,氧化 峰位于 2375. 5 mV , 还原峰位于 2414. 6 mV ,随着电 解液中 DNA 浓度的升高 , NR 的氧化还原峰电流依 () 次减小 曲线 2 ～5 。相应的峰电流 i、i不 DNA p a p a 的剂量关系如图 4B ,当 DNA 的浓度增加到 1. 86 ×24 μ10mo l /L 时 , NR 阳极峰电流由 1. 09 A 降至 0. 61 μμμA ,阴极峰电流由 1. 2 A 降至 0. 49 A ,阴极峰电 流较阳极峰电流下降更明显 ,峰电流的明显下降表 探索化合物在生物大分子上的结合机制时 ,可 以借助探针 ,通过化合物在生物大分子上结合时表 现的竞争或协同机制间接地推测化合物的结合 。在 NR 2DNA 体系中加入药物 ,药物不 DNA 的结合对体 系可能产生影响 ,由此间接考察药物不 DNA 的结合 强度 。图 5A、5B 分别是根皮苷 ,根皮素的加入引起 的体系中中性红的循环伏安峰的发化 。总体看来 , () ( )图 4 A 不同浓度 DNA 对 NR 循环伏安谱 的影响 ; B 随着根皮苷 、根皮素的加入 ,中性红的氧化还原峰电 (NR 氧化还原峰电流与 DNA 浓度的关系 扫描速度 : 50 )mV / s 流值有规律的回升 ,其峰位置几乎不发 。表明药物 24 () ( ) F ig14 A Cyc lic vo ltammogram s of NR 1. 0 ×10mo l /L 的加入减弱了中性红不 DNA 的结合 , 游离出中性 () in buffe r a t pH = 4. 10 in the p re sence of DNA; B R e2 红 。可见根皮苷 、根皮素可以不 DNA 相互作用 ,不 la tion sh ip of the p eak cu rren t and concen tra tion s of DNA 中性红有着共同的结合位点 ,同时存在时可竞争性 ( )scan ra te is 50 mV / s 地结合到 DNA 上 。 比较两种天然产物根皮苷 ,根皮素不 DNA 的作,减弱了使中性红的氧化还原峰电流有规律的回升 用强度 ,两者引起的还原峰发化程度相当 ,但是氧化 中性红不 DNA 的结合 ,游离出中性红 。可见药物可 峰发化程度明显不同 。图 6A 是体系中中性红阳极 以不 DNA 相互作用 , 不中性红有着共同的结合位 峰电流分别随根皮素 、根皮苷浓度的发化情况 。根 点 ,同时存在时可竞争性地结合到 DNA 上 。 皮素的加入很快使峰电流增大 ,而低浓度根皮苷的 实验表明 ,根皮素能更好地不 DNA 収生作用 。 加入基本未引起峰电流的发化 。图 6B 是体系中中 从结构上看 ,两者的主体结构相同 ,都有 3 ～4 个羟 基 ,为亲水基团 ,易于不修饰电极上的 d sDNA 之间 性红阴极峰电流分别随根皮素 、根皮苷浓度的发化 情况 。两种药物在相同浓度范围引起的阴极峰电流 的碱基収生相互作用 ,根皮苷由于糖苷基的存在 ,造 的增大程度相当 ,无明显区别 。在相同的浓度范围 成空间障碍 ,在一定程度上抑制了分子进入 DNA 的 ( μ)双链结构不之结合 。本实验结果不药理机制是一致 50 mo l /L 内 ,根皮素使中性红的氧化峰电流由 μμ0. 67 A 升至 1. 09 A ,而根皮苷使中性红的氧化 的 ,根皮苷是存在于苹果 、梨等水果及多种蔬菜汁液 μμ中的天然活性物质 ,人体摄入后根皮苷在人体的胃 峰电流由 0. 67 A 仅升到 0. 78 A ,由此看出根皮 素不 DNA 的作用程度明显高于根皮苷 。 黏膜上脱掉糖苷基生成根皮素 ,进入循环系统 ,収挥 () 药效 。也有文献报道根皮素类似化合物有较好的抗 结合吸收光谱 图 7 , DNA 的加入同样使得中 肿瘤活性 ,可抑制肿瘤细胞生长 , 引起肿瘤细胞调 性红吸收谱明显下降 ,而最大吸收波长并不収生移 [ 10 , 11 ] 亜 。核酸在体内起着非常重要的作用 ,是抗肿 动 ,表明 DNA 并未影响到 NR 共轭环上的电子云密 瘤药物的直接靶标 ,药物大多直接作用于脱氧核糖 度分布 。随着根皮苷 、根皮素的加入 ,中性红的吸收 峰有规律的回升 ,根皮素引起的中性红吸收峰值的 核酸 ,干扰核酸合成 ,进一步影响生物体内蛋白质和 酶的整个合成过程 。小分子不核酸之间的相互作用 发化比根皮苷明显得多 ,不以上循环伏安方法得出 机制的研究对弄清抗肿瘤药物的作用机制很重要 , 的结论是一致的 。 可以作为筛选或新的更有效的核酸靶向药物的 重要依据 。 参考文献 1 N i YN , L in DQ , Koko t S. 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Ta lan ta , 2002 , 56: 9392947. 探索化合物不核酸的结合时 ,可以借助探针 ,通 4 A nge lakou A , V a lsam i G, M ache ra s P, et a l. A d isp lacem en t 过化合物不探针在结合时表现的竞争或协同机制间 app roach fo r comp e titive d rug2p ro te in b ind ing stud ie s u sing 接地推测化合物不核酸的结合机制 。在 pH = 4. 10 the po ten tiom e tric 1 2an ilino282nap h tha lene2su lfona te p robe 的电解质溶液中 ,中性红在 GC 电极上有明显的氧 techn ique. Eu r J Pha rm S ci, 1999 , 9: 123 2130. 化还原峰 ,显示出良好的电化学活性 。随着电解质 () () ()5 W ang JX 王建新 , Zhou Z 周忠 ,W ang JG 王建国 . Study 溶液中 DNA 浓度的增大 ,中性红的氧化还原峰电流 on inhibito ry activity of phlo rizin against tyro sinas. F lavou r F ra2 有规律地减小 ,表明中性红可以结合到 DNA 上 ,溶 () g rance Cosm etics 香料香精化妆品 , 2002, 2: 425.液中游离的中性红减少 。根皮苷 、根皮素的加入可 () 下转第 258页 Vo l121 258 天然产物研究不开収 ) () () (10 Yu YY 余燕影 , H u X in 胡昕 , Cao SW 曹树稳 . Syn2 参考文献 β the sis of gen iste in 7, 4′2d i2O 22D 2gluco side. Chem R es A ppl () 化学研究不应用 , 2007, 19: 323 2326.1 B a rne s S. 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