陈旧骨骼的核DNA检验

陈旧骨骼的核DNA检验 中国法医学杂志1998年第l3卷第3期 上检出(DR7,15;DR53,DR51)与任某 (DR7,15;DR53,DR51)相同而与李 (DR11,16;DR51)不同的血迹. 案例31998年4月7日,唐某被控强奸 赵某,在赵的内裤上检出精子.经检验,精子 HLA-DRB基因座型为D1L2,11,9; DR51,DR52,DR53是一混台斑结果,与唐 (DR11,14;DR52)不同,从而排除了唐的 犯罪嫌疑,为案件处理提供了证据.ABO血 型及STR检验也证实了HLA的结果. 讨论 HLA区域位于人类第6号染色体短臂上, DR属于HLA?类抗原.分为A,B两条链. 近年来对B链的基因多态性研究较多.根据 赖淑萍等(1997)对西北汉族HLA-DRB基因 座基因频率调查表明,DRB基因座具有较高 的分辨率,能够为法医学鉴定提供科学的依 据但PCR.SSOP的方法,每一样本需用几 操作复杂,适用于大样本群体 十种探针杂交, 调查,不适合法医具体办案. PCR—SSP方法主要是根据HLA,DR抗原 的核苷酸序列不同设计出一系列特异引物,通 过PCR扩增得到各等位基因的型特异性片段. 借助常规的琼脂糖凝胶电泳.观察特异性产物 的电泳条带,直接进行DRB基因分型.该方 法具有三大特点:(1)24对引物可同时检测 该位点的多种基因型,分辨率高;(2)由于引 物是针对各等位基因的特异顺序设计的,因此 具有高度特异性;(3)每一反应体系对应一特 定的等位基因,判断结果简捷快速而准确. 本方法在法医学鉴定中具有广泛的应用前 景,但在检验过程中必须注意以下问题:(1) 由于反应试剂为冻干型,在操作过程中需彻底 溶解;(2)扩增试剂要充分混匀;(3)反应体 系仅有l0l,应防止蒸发;(4)结果判读时需 认真对照分子量品.排除非特异谱带. 参考文献 1.W出hPS.Chelex100?samediumforSimp[e ExtractionofDNAforPCR—BasedTypingfromForen— sicM8teria1.BioTechniques1991;10:506 2HiguehiR.Rapid.EfficientDNAExtractionfor PCRFromCellsOrBlood.In:Am口1ifications:AFo I'IlITIforPCRUsers(Mayl989),Perkin—Elmer, Norwalk.CT.Issue2. 3姜先华.等.DNA指纹图在法医学鉴定中应用的 研究(?)——应用Myo"DNA探针进行混台 斑中精液的个体认定.中国法医学杂志1990;6 (2):70 l'7一'陈旧骨骼的核.NA检验 司珐部目法鉴定杠学技术研究所(上海?.)李莉.阔庭林源 》,' 在发达国家,对无名尸骨进行个人识别 时,通常的方法是比较骨骼与死者生前的身体 特征或医疗记录l,但在发展中国家,由于 医疗记录往往不甚完备,这种方法较难以实 施.此外,如果对已埋葬数十年的尸骨进行鉴 定,则更需要依靠其他技术方法. 运用PCR技术进行DNA检验是解决这种 难题的途径之一.陈旧骨骼的DNA降解严 重,从中提取的核DNA一般小于1000bp, 为此,进行PCR分析时宜选择扩增片段较短 的基因位点.在本文中,作者报道了一种可靠 的用于陈旧骨骼DNA提取,扩增和基因分型 的方法. 障I毛I_~910t出iNA压转欢 材料和方法 一 样本 取长骨,椎骨作为实验检材,来源于已埋葬10 年以上的^遗骨 =,DNA扩增与分型试剂 金牌Taq酶和DNA扩增与分型试剂盘.购自美 国PE公司,可对下列5个基因位点进行扩增分型: LDLR(214hg);GYPA(190bp);I-II?,CK3(172bp); 137s8(151bp);Gc(138bp) 三,桉DNA提取 取长骨或椎骨,用试管刷在自来水中清洗干净, 晾干后用钢锯从中线锯开,用钢勺挖取骨质松0.2g. 放入1,5mIEppendo~管中,加入9oO消化缓冲液 (10retoolTri一HCI.pl-17.5;10mmolEDTA.pH80; 100mmolNaCI).再依次褥加20%SDSl00m,20rag/ mlPK20及imo]D呵40.56?保温24h,然后按 Lee等丹绍的有机溶剂法抽提DNA. 四,PCR扩增爰基因分型 在25反应体系中加A金牌Taq酶0.5u,骨 DNA2ng及石蜡油1滴.于95?热启动9rain.然后 接下述条件进行PCR扩增:94?变性lmin,60'U退 火30s,72?延伸30s.循环35次.晟后于72?保温 7盯nn.PCR反应结柬后.用探针杂交法检测骨DNA 基因型[. 五,案例应用 1997年10月,受董姓兄妹委托,用上述方法对 一 根已埋菲近40年的^颈椎骨进行核DNA检验,以 判断是否为董先母之遗骨. 结果 .甩上述方法,对数十年的陈旧骨骼成功地 进行核DNA检验.案例鉴定,作者分别提取 骨骼DNA和董姓兄妹血液DNA,经PCR扩 增后检测了LDLR,GYPA,HBGG,I)7s8及 Gc共五个位点的基因型,结果如表所示.根 据盂蔼尔遗传规律,人群中每一个体的基因均 来源于其亲生父母双方,此案例中董姓兄妹的 基因都在所检骨骼中出现,故不排除所检骨骨芹 为董氏先母之遗骨. 附表;案例颈椎骨核DNA检谩4结果 样品来源LDLRGYPAI-II-~C-D7s8 陈旧骨骼ABAI3AI3ABAC 董姓兄AAAB13BABAA 董姓操AAABBBBBAA 讨论 1.对骨骼样本进行DNA检验存在许多围 难.由于受周围环境(如土壤)中核酸酶 和微生物的作用,陈旧骨骼DNA往往会发生 降解或受到污染,不易得到足够的DNA模 板.因此,RFLP法一般不适用于陈旧骨骼的 DNA分析,而PCR技术则可以获得令人满意 的结果. 2.作者曾取陈旧骨骼分别经脱钙和不脱 钙处理后用苯酚一氯仿抽提法,CHELEX抽提 法提取DNA.经比较分析,脱钙和CHELEX 抽提法DNA提取效率不如苯酚.氯仿法.本文 报道的方法不含脱钙处理步骤,抽提DNA用 的是苯酚一氯仿法,结果证实了Fisher等的 观点:不经脱钙处理,直接取骨松质进行消化 后苯酚一氯仿提取DNA的方法更可靠,有效 3.实验发现.金牌Taq酶可在陈旧骨骼 的检验中发挥重要作用.在陈旧骨骼的DNA 抽提物中经常含有还原糖的产物,且带有扩增 抑制物.据Hochmeister等报道l8,在PCR扩 增体系加入牛血清自蛋白(BSA)至终浓度 160.ug/ml可去除这些物质的干扰,但本文作 者却发现BSA的作用并不明显,而改用金牌 Taq酶(O2W10tAPCR反应混合梭)进行热 启动后扩增则可使PCR反应成功率提高 参考文献 1.PrJmoracD.etaI.Identification0f-,viii-v{ctimsfrom massgravesinCroatia.BosniaandHerzegovinabythe useoJstaudardlorenzomethodsandDNAtyping journa【ofForensicSciences,19q6;4l(5)89l 2.BolesTC.et.ForensicD?te~tJng0nskeletalre— mainsfromitlassgrave~:ApilotpectinGuatemala JoHI"natofForer~icSc圯nces1995;40'3)'349 3.LeeHC.eraIGeneticmarkersnhumanboneI 中国莹医学杂息1998年第l3卷第3期 deoxyrlbonuc[elcacid(DNA)analysis.Joumalof7 Forensicscie1lces1993:36:320 4.SmithBCeTalAsystematicapproachGothesam— piingofdentalDNA.JournatofForensicSciences 1993;38:11948 5.李小明,李生斌.直接同步扩增5种基因位点.法 医学杂志1996;12(2):65 6HagellbergE,eta1.Identificationoftheskeletalre— mainsofamLtrdervi~EmbyDNAanalysisNature 1991:352:427 HsherLD,etalExtraction,evaluation,andam— plilicationofDNAfi'omdecalc4fiedandundecalcified UnitedStatescivi1warboneJournalofForertsicScl ePeeSI993;38:60 HochmeisterMN,eta【_Confirmationoftheldentify ofhumanskeletalremainsungmuttiplexPCRampli fi~tionandtypingkits.J.urnalofForertsicSci曲.罄 1995;40(4):701 (1997.12收稿) 1一r7.娩于{生百哺耳关合;, 应用耻骨联合X线片判别经产生育 缺岭市公安局刑警支队技术大队(112000) 沈阳市刑事科学研究所(1i@002) 中国医科大学第S-临床医院(沈阳110003) 在检验鉴定无名女性尸体时,应判别死者 的经产生育与否.对于新鲜的尸体一般不难, 但遇到杀人碎尸,杀人焚尸,高度腐败的尸体 尚是个难题.为解决这一问题,国外的人类学 家Angel(1969),Suchry(1979)和国内法医 学者张忠尧(1985.1995),程从根(1995) 等均做了大量的工作.他们对女性生育可能在 骨骼上留下痕迹,而对耻骨进行了观察研究. 有人认为耻骨背侧的凹痕或沟是生育的证 据_1J..但又被某些学者否定.除此之外. 目前尚未查到鉴定碎尸,焚尸及高度腐败尸体 经产生育的证据. 为此,本文作者对国人东北地区20,60 岁200人女性活体拍摄了耻骨x线片,对耻 骨联台间距进行了测量,通过线性判别分析取 得了有实际意义的函数值和临界值.可判别是 否有正常生育,其准确率为80%以上.这不 仅对法医个体识别鉴定有实际应用价值.而且 对活体鉴定也有实际意义. *铁岭县第一^民医院(112000) 樊庆祥王玉兰77,} 孙雅坤陈维军王鹏 堂忠盏安志军高阳 徐葆茔张伟 材料和方法 研究样本按摄X线片同一条件,摄取了东北地区 20--60岁女性括体骨盆正位x线照片.生育者100 ^.未生育者50^,剖腹产者50^.经观察,剖喧 产者在投有胎儿出生时.耻骨联合分离的过程,与未 生育者相似.设生育者为总体I,未生育者和剖腹产 者为总体?.测量了200^耻骨联合上端,中部,下 端的间距(mm).测量前在观片灯上用细铅笔沿耻骨 的背侧缘描划两条线,然后在上,下端角度明显处各 翊一条横连线,最后在上,下两条横连线之间(耻骨 联合中部)划一条横连线.应用日本产自动显示数值 的游标卡尺(精确度0.Olmm),测量上,中,下三条 横连线之长度,即得出每个耻骨联合上,中,下三个 测点间距的测量值.将三个测点间距作为3个自变量 X.,,X3,求其因变量Y(x).使用北京大学概率 统计系软件,应用线性判别分析程序(张清武, 1993),将全部测量的原始数据输入计算机.经统计 分析,取得了线性判别函数和临界值.应用时,将每 个耻骨3个测量值代入判别函数,所得的Y(X)值 太于临界值Y(c),为总体I,即正常生育者;小于 临界值为总体?,为未生育或剖腹产者. 169