香烟基质中中药活性成分的分离分析

香烟基质中中药活性成分的分离 密级 分类号 学校代码 学号?? 鱼量垒 香烟基质中中药活性成分的分离分析 研究生姓名 刘璐 指导教师姓名、职称 陈波教授 业 专 学 科 分析化学 研 究 方 向 色谱与药物分析 湖南师范大学学位评定委员会办公室 二零一一年五月孙矾 四四四帆唧 摘要 为尽可能的降低香烟对人体的危害,常将一些中药活性成分加入 其中,以达到清咽抗炎的目的。因香烟基质极为复杂,对香烟中所添 加的中药成分进行质量控制分析则显得尤为困难。本以香烟中常 添加的岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素、罗汉果苷 等六种中草药成分为分子,建立了香烟基质中高效液相色谱 玎,高效毛细管电泳唧分离分析。 针对六种化合物的结构差异性,对其在分离中的保留特 性、峰形、分离度等进行了考察,优化并获得了最佳分离条件。为进 一步的提高分离分析性能,系统考察了其在毛细管电泳上的分离行 为。在优化后的条件下,所有物质的分离可在 内完成,其分 析通量远高于法;在此基础上,研究了纳米金修饰毛细管内壁 以调整电泳电渗流来改善分离的可能性。 论文主要工作如下: .建立了卷烟及其烟气中的岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、 五味子素、罗汉果苷含量的高效液相色谱分析法。该方法操作 简单,精密度好,准确度高,并成功应用于香烟中六种中药成分 的测定及其向烟气中的转移率评价。 :建立了同时测定黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素、罗汉果苷 的高效毛细管电泳分析方法。全分析时间小于 ,分析通。 量远高于法 .为进一步优化毛细管电泳分离性能,研究了纳米金的制备,并尝 试了纳米金修饰毛细管内壁来调整电泳分析过程中的电渗流,通 过其对黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素、罗汉果苷的分离, 初步证实了纳米金修饰毛细管对电泳分离有一定的改善作用。 关键词:高效液相色谱;高效毛细管电泳;纳米金;分离分析;制备 ’, . , .,,, , . , ,. , . , , .,. : . ,,, . , . . . ,,, . ,. . ,.. ,,,. :曲 ; ; ; ; 目 录 中文摘要?.. 英文摘要? 第一章绪论. .引言 .香烟中添加黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素、罗汉果苷 及岩白菜素的情况及其测定方法研究进展?. .金纳米粒子在毛细管电泳中的应用??. .论文选题的意义和主要内容??一 第二章法测定试制卷烟及烟气中六种中草药活性成分的转移 ;;.................................................?............. .............................................: 。’。‘.引言.实验部分?. .结果与讨论 .小结 第三章高效毛细管电泳法测定烟丝中岩白菜素,黄芩苷,甘草苷, 丹皮酚,五味子素,罗汉果苷的浓度??. .引言.实验部分?.. .结果与讨论?. .小结??第四章纳米金涂层毛细管制备及其对香烟中添加的中草药活性成分 分析的应用研究.. .引言?.. .实验部分? .结果与讨论 .小结结语??: 参考文献? 附录一:。 附录二:? 致谢??.香烟基质中中药活性成分的分离分析 第一章绪论 随着社会的发展与进步,人们对高品质生活的追求以及对健康的 关注程度正逐步提高,世界范围内的控烟运动也在迅速发展,降低卷 烟危害是烟草行业迎接吸烟与健康问题的挑战做出的积极举措,是烟 草行业生存与发展的内在要求。我国有丰富的中草药资源和广博的中 药理论,在将中草药用于吸烟保健及减少卷烟有害成分方面具有独特 优势,这种卷烟由于具有普通卷烟的吸食特性,又对某些疾病有一定 治疗作用而受到越来越多人的关注。添加了中草药添加剂的卷烟,在 燃吸过程中其中草药添加剂中某些成分会残留在烟气中,影响了测定 结果的准确性,因此准确测定中草药添加剂中的某些成分向烟气中转 化非常重要,其具体的测定方法还有待于科研工作者进一步的深入研 究与探索【。 ..卷烟烟气中的有害成分及其分析检测研究的必要性 尽管每盒香烟上都印着“吸烟有害健康的字样,尽管现在越来越 多的公共场所都禁止吸烟,尽管吸烟有害已经成为人们的共识,但是 还是有越来越多的人加入到吸烟的队伍中来。其中未成年人的比例正 在逐年增加‘。《国际烟草控制框架条约》对烟草成分进行了严格限 制,随着我国加入其中的同时,人们的生活水平、生活质量也在不断 提高,烟草行业发展的外部环境发生了深刻变化,消费者的环境安全硕学位 论文 以及对吸烟的安全性意识越来越强,因此,卷烟烟气中的有害成分的 分析检测成为了人们关注的焦点。 卷烟烟支主要由烟草、添加剂、卷烟纸、滤嘴等部分构成,其中 最重要的是烟草。当烟支在高温条件下燃烧或吸燃时,内部的化 学成分发生一系列的复杂变化,从而形成卷烟烟气。烟草在燃烧的过 程中由于温度和氧气的供应量不同,燃烧的机制不同,产生烟气的化 学成分也有所不同。烟气中有上千种化合物,大约只有/的化合物 是直接来自烟草,其余则是在燃烧过程中产生的化合物,这些成分严 重的影响着人们的健康‘。 卷烟烟气中含有两大类.亚硝胺:一是烟草特有亚硝胺,存在 于烟草和烟气粒相中,它们是非挥发性的;二是非烟草特有亚硝胺, 通常称之为“挥发性亚硝胺,存在于主流烟气的气相或半挥发相中, 到目前为止已经鉴定出种亚硝胺,其中.亚硝基降烟碱 、亚硝基新烟碱、一一甲基亚硝胺基一一.吡啶基.. 丁酮和亚硝基假木贼碱种亚硝胺研究的较为深入。 在烟气中鉴定出的挥发性亚硝胺除二甲基亚硝胺、亚硝基哌 啶,主要还有一亚硝基甲基乙基胺,.亚硝基 基胺,一亚硝基二丙基胺,.亚硝基吡咯烷 和吗啉?【刀。 在卷烟抽吸过程中产生的气体主要存在于烟气气相中,是一 种典型的对人体有害的物质。与血红蛋白的化学亲和力是氧气的 倍,而卷烟燃烧会产生大量的,这种气体吸入人体后会 香烟基质中中药活性成分的分离分析 立即与血红蛋白结合,生成一种稳定的碳氧血红蛋白物质。谢兰英【】 等人指出碳氧血红蛋白的形成,会使得血红蛋白输送氧的能力丧失, 以至于组织缺氧,造成组织低氧症,体内氧的供应减少导致血小板粘 滞性增加,分泌的肾上腺素增多,可诱发心律失常,最严重的情况是 猝死,当人体处于低氧血症时,会加快心肌缺氧,心绞痛发作的机会 也会增加,形成的碳氧血红蛋白会引起动脉内壁水肿,快速形成动脉 粥样硬化直接导致高血压等疾病。 卷烟烟气本身含有大量活性氧和活性氧诱导物自由基,测定 表明,一支烟所产生的烟雾约有”个自由基,其中气相中有烷氧基 .、烷过氧基.及烷基.等;焦油相中有半醌自由基和芳香 烃自由基等。它们进入体内后导致机体释放大量活性氧 ,包括超氧阴离子。和羟自由基等,可以 进入细胞甚至细胞核,导致氧化损伤和细胞死亡。线粒体是细 胞能量生成的重要细胞器,也是细胞调节氧化应激的中枢。卷烟烟气 中的有害物质可导致多种细胞的线粒体损伤损害细胞的正常结构和 功能【。 根据流行病学调查表明,吸烟可引起人类多种疾病,如肺癌、 支气管炎、肺气肿、口腔癌、膀胱癌等,尤其是对被动吸烟者也产生 有害影响。以上这些已经是烟草界普遍面临的问题‘。 ..中草药作为添加剂在卷烟中的应用 卷烟是一种特殊的商品,如何降低吸烟带来的危害,使烟民们最 大限度地减少对身体危害的同时又可享受吸烟乐趣,是烟草行业进行到肺泡 中从而进入血液。添加到烟嘴棒中的中草药在卷烟燃烧后产 香烟基质中中药活性成分的分离分析 生的大部分烟气会经过嘴棒,中草药添加剂能够部分捕获到烟气中的 自由基,燃烧过程中产生的有害物质能够被部分吸附包括物理吸附 和化学吸附,而中草药添加剂中的部分有效成分则通过主流烟气, 被带入人体的呼吸道,或者是沉积在呼吸道,或是吸入到肺泡中而进 入血液循环‘】。这两种添加方式都能使中草药中的部分有效成分进入 人体的呼吸系统,在人体内能起到积极作用,减少因吸烟引起的不适 或是危害。根据中医药理论,产生的烟气会直接到达胸肺并与体内的 病变细胞接触,或进入血液遍及全身,比直接服用药物,经消化道后 再被吸收的效果好一些,符合中医药理论。 刘永琼‘等所研究的阻天然降害卷烟添加剂简称添加 剂具有提高人的活性及免疫力、降焦、止咳祛痰和降高血压 等作用。郭琳【】等从多种药食两用功能性植物中提取复方添加剂, 通过从毒理学的角度进行研究,同时进行感官评吸,结果表明复方 添加剂确实能达到降焦减害的目的。戴亚四等以.%的比例添加 一于卷烟滤嘴或烟丝中,从羊齿类天然植物中提取出多种酮、酚类及其 衍生物组合得到复合添加剂,结果其主流烟气中的多种稠环芳烃、自 由基和芳香胺等致癌物的含量显著降低,从而对烟气中烟草特有亚硝 胺也有一定的清除作用。刘宝法【等在研究我国目前烟草及卷烟焦油 致突变性的基础上,在烟丝中加入鞣酸添加剂,因具有抗氧化性,则 具有清除烟气中有害自由基的作用,可防止烟丝中致突变物质的前身 物质产生,如蛋白质等在吸烟过程中氧化分解为致突变物质的反应。 彭斌【 】等用%的酒精按重量比:萃取天然食品原料柠檬油或甜硕十学位论 文 橙油中水溶性的香味物质,与钾盐一起配成溶液,作为卷烟添加剂使 用到卷烟中,能有效降低主流烟气中一氧化碳含量,并能较好的维持 卷烟原有的风味。曹鲜会【等为了不使卷烟失去原有的风味,提高卷 烟的品质,用蔗糖酯复合添加剂替代糖料配方中常使用的蔗糖、丙二 醇、丙三醇、枣酊等。基本解决了用物理方法降低焦油等有害物质后 烟香不足及燃烧后烟香释放不均匀的问题,降低了配方成本。 在中草药中,许多植物都具有清除体内氧自由基的作用,如生地、 当归、酸枣仁、灵芝、雷公藤、肉桂、杜仲、枸杞、黄芩、肉苁蓉等 的粗提物。同时许多中草药的提纯物,比如五味子的多种成分、甘草 类黄酮、人参皂苷、芦丁等,均具有类似功能,此外,大蒜、绿茶、 大枣、陈皮、山楂等的水提取物都具有较强的抗氧化性【。 .香烟中添加黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素、罗汉果苷 及岩白菜素的情况及其测定方法研究进展 我国幅员辽阔,气候多样,大约有种药用植物。在诸多药 用植物中,对人类疾病或健康起到药用效果的成分则为中草药活性成 分,一般采用适当的溶剂及方法,从植物中的一部分或者全部为原料 提取加工而成。本文主要研究黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素、 罗汉果苷这六种中草药活性成分的分析化学测定方法。 ..黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素、罗汉果苷,岩白菜素 简介 黄芩苷,.,。化学结构式如图一所示。 香烟基质中中药活性成分的分离分析 图.黄芩苷化学结构式 甘草苷, .,。化学结构 式如图所示。 。一妣 丹皮酚,.,。为一甲氧基.羟基苯乙酮。 化学结构式如图.所示。 硌《. 图丹皮酚化学结构式 五味子素,.,。化学结构式如图. 所示。 图五味子素化学结构式 硕十学位论文 。化学结构式如 罗汉果苷,., 图.所示。 图.罗汉果苷化学结构式 岩白菜素,.,。化学结构式如图 所示。 ..高效液相色谱测定黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素、罗汉 果苷,岩白菜素的方法研究 高效液相色谱法 是在经典液相色谱法的基础上,采用全多孔微粒固定相,装填在小口 径、短不锈钢柱内,流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱,溶 质在固定相的传质,扩散速度大大加快,从而在短的分析时间内获得 高柱效和高分离能力。高效液相色谱法适用于分析高沸点不易挥发香烟基质 中中药活性成分的分离分析 的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的有机化合物;生物 活性物质和多种天然产物;合成的和天然的高分子化合物等。涉及石 油化工产品、食品、合成药物、生物化工产品及环境污染物等,约占 全部有机化合物的%。 近几十年来,有诸多科研工作者用高效液相色法对中草药活性成 分如黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素、罗汉果苷、岩白菜素进 . 行了研究。何瑞荣四等采用.法,以 , 柱为色谱柱,以甲醇..%磷酸体积比:为流动相, 测定了乙肝解毒胶囊中黄芩苷的含量。王明军‘等测定大卫颗粒中黄 芩苷的含量时采用了高效液相色谱法,色谱柱为. ,“,流动相为甲醇..%磷酸:。池玉梅】等以乙腈 .%冰醋酸为流动相,采用 色谱柱,梯度洗脱法研究了 同时测定通塞脉微丸中绿原酸、阿魏酸及甘草苷含量的方法。张文娟 等用固相萃取.高效液相色谱.法测定甘草中甘草苷和.. 甘草酸含量。吕士杰【】等采用 ,肛色谱柱,以甲醇.水:为流动相法测定了芩 丹颗粒中黄芩苷和丹皮酚含量。郑林等讨论了. . ×. , , 色谱柱、 色 ×. 谱柱和 , 色谱柱这三种 色谱柱的分离效果,发现均能达到很好的分离。徐良梅‘】等用 超临界萃取法提取北五味子有效成分,采用高效液相色谱法测定了北 五味子提取物中的五味子甲素的含量。丁佐【刀等采用 硕十学何论文 × 色谱柱. , ,建立了同时测定北五味子中五味子 ×. 甲素,五味子乙素含量的方法。周兢】等采用 ,肛色谱柱,以乙腈.水为流动相进行梯度洗脱,建立法 测定不同产地、不同栽培品系的罗汉果药材中罗汉果苷和 .氧化 罗汉果苷。张建华【等建立了高效液相色法测定罗汉果浓缩汁中的 罗汉果苷含量,为衡量罗汉果浓缩汁质量提供了一个有效手段。 ..毛细管电泳方法及应用中的研究 毛细管电泳 ,是利用液体介质中的带 电粒子在电场的作用下迁移速度不同而进行分离的方法。毛细管电泳 以简捷的技术提供了较高的可靠性,样品不需要特殊处理;试剂消耗 量极少,极大的降低购买和处理的费用;纳升级进样量可使有限的样 品得以被充分利用;柱上检测快速准确定量,高度自动化;分离机理 的单一性和可选择性使分析方法的快速开发成为可能。它在药物的手 性拆分,中药的分离,片断筛分、定性、定量或分类以及蛋白 质分离分析中显示了极强的能力。 / 李伟东‘等采用分离电压 、检测波长为 和 的法测定了通塞脉微丸中甘草苷、甘草素和阿魏酸的含量,发 现在 内得到很好的分离。赵新峰‘】等用胶束试剂 。测定波长为 的胶束电动毛细管法测定了丹皮及六味地黄 丸中丹皮酚的含量,重现性较好。王俊梅【等运用非接触式高频电导 检测法,采用三乙醇胺.缓冲液为电泳介质的毛细管电泳法 测定了半枝莲药材及灯盏花素片中野黄芩苷含量。宋粉云【等采用毛香烟基 质中中药活性成分的分离分析 细管电泳法建立了同时测定银黄胶囊和银黄颗粒中的黄芩苷和绿原 酸含量方法。潘细贵【等采用分离电压为 的高效毛细管电泳法 测定了消炎抗菌胶囊中黄芩苷的含量。宁婷‘等采用胶束电动色谱法 同时测定了北五味子中五味子甲、乙素的含量。 .金纳米粒子在毛细管电泳中的应用 新型纳米材料在毛细管电泳中的应用越来越广泛,有金属纳米 粒子、纳米纤维、纳米线、纳米膜等。而运用最多的是金纳米粒子纳 米金。纳米金是指尺寸为.? 的超细粒子,具有突出 的表面效应、小尺寸效应和量子尺寸效应。由于纳米金的合成简单, 水相中稳定性好,粒径均一;其表面功能化修饰方便,可以通过与 ,和基团共价组装在基质表面,使得纳米金可以与诸多化 【】 合物结合作为涂层材料应用在毛细管电泳中。年, 等根据纳米金通过正十二烷基硫醇与衍生在毛细管内壁的.氨基丙 基三甲氧基硅烷或者.巯丙基三甲氧基硅烷反应 而固定,以反相色谱模式分离硫脲、苯甲酮、联苯以及拟除虫菊酯杀 刀等使用氟化氢铵刻蚀毛细管,固载了金纳 虫剂。年, 米粒子,使得内壁表面积增大,固载量增加,增大样品与涂覆固定相 之间的相互作用。年, ‘等通过简单的静电和疏水作用将 十八胺修饰的纳米金直接稳定固载在管壁内表面。 】等 先用聚二烯丙基二甲基氯化铵涂敷毛细管内壁构成阳离子 】等使用 层,之后带负电的纳米金凭借静电作用被固定。硕十学位论文 .技术构建多层金纳米结构分离杀虫剂和类固醇药物等 物质,其中毛细管内壁预先经过硅烷化处理,纳米金表面也自组装了 在逐层沉积过程充当多层膜连接臂的硫醇。 等在年 制备了使用柠檬酸和巯基丙酸离子稳定的两种金纳米材料,添加到电 泳介质,研究了芳香酸和芳香碱同分异构体的分离选择性,并且提高 了柱效。 .论文选题的意义和主要内容 随着人类生活水平的提高,健康成为人类生活的目标,而吸 烟有害健康则己成为共识,针对如何降低烟草中有害成分对人类身体 的危害,科技工作者做了大量工作。例如,香烟中的降焦减害,香烟 烟丝中的中草药活性成分添加剂,香烟滤嘴的配料改进等工作。而其 中的中草药活性成分添加剂则有望成为保健香烟中的一个主要研究 方向。所以对该系列添加剂的分析也显得尤为重要。本文前两部分主 要是建立了两种针对香烟烟丝中添加的岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、 丹皮酚、五味子素、罗汉果苷这六种中草药活性成分新的测定方 法研究。首先,通过高效液相色谱法对这几种中草药活性成分的含量 进行了分离分析,对其中的色谱条件以及提取方法进行了分析讨论, 为香烟中这几种中草药活性成分的质量控制提供了进一步的依据;其 次,通过毛细管电泳法对岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味 子素、罗汉果苷这六种中草药活性成分进行了分离分析,对其中香烟基质中 中药活性成分的分离分析 的电泳条件以及电泳缓冲溶液的选择进行了分析讨论,为这六种中药 活性成分的多组分电泳分离分析提供了一定依据。 纳米材料越来越受科技工作者青睐,其中纳米金更是研究热 点,随着纳米金的研究越来越深入,它在毛细管电泳中的应用也会越 来越重要。本文在最后一部分针对将纳米金结合在毛细管电泳内壁作 为固定相做了相关研究,以期改善烟丝中岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、 丹皮酚、五味子素、罗汉果苷这六种中草药活性成分的分离分析。硕学位论 文 第二章法测定试制卷烟及烟气中六种中草药活性成 分的转移率 .引言 烟草属于茄科烟属,是一种重要的经济作物。烟草中含有 多种化学物质,燃烧后产生的烟气中更含多达种物质,其中有 大量对人体有害成分,女:尼古丁、焦油和烟碱等。吸食后会对人体 器官如心脏、肺等产生不良后果。为减少卷烟中有害成分对人体相关 损伤,烟草行业有部分企业尝试将一些对人体有益的中草药活性成分 加入卷烟中,女:广西中烟工业公司技术中心将罗汉果苷作为烟用添 加剂来增加卷烟香气量,降低烟气干燥感【。目前,香烟及其燃烧后 的烟气中成分的检验通常采用气相色谱法、高效液相色谱 法?】、高效液相色谱.质谱法.。其中高效 液相色谱法是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的,具有 分析速度快、分离效能高、自动化等特点,应用十分广泛。湖南 中烟工业有限责任公司在卷烟中中草药成分添加方面进行了大量探 索工作。其中,将试制卷烟该试制卷烟经过毒理学和临床实验证实 可以缓解吸烟所致呼吸道疾病中添加岩白菜素、黄芩苷、甘草苷等 具有镇咳祛痰、消炎降压功效的中草药活性成分。测定这六种成分在 烟丝向其燃烧烟气中的转移率,检验燃吸过程中这些中草药提取物的 有效成分是否转移到烟气中,提供添加草本中药提取物卷烟中的有效 香烟基质中中药活性成分的分离分析 成分向烟气中转移的证据,并能对此类特制香烟的功效进行初步评 估。当前的相关报道只对岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五 味子素和罗汉果苷中一种或者两种成份进行检测,尚未见卷 烟中此六种物质法同时检测的相关报道。 本文建立了试制卷烟及其主流烟气中这六种成分同时测定的 法。为对此类试制卷烟及其燃烧后的烟气中的中草药活性成分 的含量及转移率的测定及其功效初步评估提供了方法基础。 .实验部分 ..试剂与仪器 .高效液相色谱系统日本岛津;电子天平梅特勒. 托利多仪器上海有限公司;型超声波清洗器昆山市超声 仪器有限公司;离心机;型高速万能粉碎机北京市永光明 医疗仪器厂;.微型旋涡混合仪上海沪西分析仪器厂有限公 司。 甲醇、乙腈色谱纯美国天地公司;磷酸,分析纯湖南师范 大学试剂厂;岩白菜素品纯度% 中国药品生物制品 检定局提供;黄芩苷标准品纯度%中国药品生物制品检 定局提供:罗汉果苷标准品纯度%中国药品生物制品检定局;甘草苷标准品纯 度%;丹皮酚标准品纯度%中国硕十学位论文 药品生物制品检定局;五味子素标准品纯度%中国药品 生物制品检定局;添加中药成分的试制香烟与剑桥滤片湖南中烟 工业有限责任公司提供;水为双蒸馏水。 ..试验方法 ...色谱条件 ,流动相: 色谱柱: . :.%磷酸水:乙腈;梯度洗脱如表.所示,检测波长: /。 ,进样量:止,流速: 表.梯度洗脱表 ...标准品配制 单个标准储备液的配制:分别精密称取适量的岩白菜素、黄芩苷、 甘草苷、丹皮酚、五味子素和罗汉果苷标准品用甲醇溶解,振荡 ,于 容量瓶中定容,分别得到这六种标准物质溶液,其浓 度分别为 酌:, ./, 灿,/,/, 。。 、 混和标准溶液的配制:分别取各单标储备液岩白菜素. 、 黄芩苷. 、甘草苷. 、丹皮酚. 、五味子素. 香烟基质中中药活性成分的分离分析 罗汉果苷 于 容量瓶中,用甲醇定容至 。得到混标 中各活性物质的浓度分别为: /、、 ‖、 、卜/、/。 ..样品处理 取三根试制香烟,取烟丝粉碎后分别称重,将称重后的样品转移 到 的具塞锥形瓶,加入 %的甲醇水,常温下超声 提取 ,过滤,取滤液过. 的有机膜,备用。 取空白对照卷烟和加中药提取物的实验卷烟,在标准吸烟条件下 分别在吸烟机上吸烟收集粒相成分,每片剑桥滤片各收集支卷烟 的烟气。将剑桥滤片置于 的具塞锥形瓶中,加入%甲醇水 溶液 ,超声提取 ,冷却,离心,上清液转入 容量 瓶,用甲醇稀释至刻度,过. 有机滤膜后进液相色谱分析。 .结果与讨论 ..色谱条件以及提取方法优化 为了获得六种待测物最佳分离图谱,本实验对色谱条件进行了优 化。本实验考察了以下几种不同流动相对待测物分离度的影响:甲醇 .水.磷酸::., 甲醇.水.磷酸::.,乙腈.水 :,乙腈.水:,乙腈..%磷酸水:。实验 结果表明用以上流动性进行等度洗脱时,六种成分色谱峰分离效果都 不理想。其后考察了.%磷酸水.甲醇,.%磷酸水.乙腈的梯度洗 脱,发现以:.%磷酸水:乙腈为流动相进行梯度洗脱时各待 硕学何论文 测物能获得分离效果较好。由于甲醇的截止波长为 ,乙腈的 截止波长为 ,而罗汉果苷的最大吸收波长为 //,因此, 选用乙腈作为流动相组成,使得分离效果较好。各待测物在优化后的 色谱条件下的色谱图如图所示。 实验中选用甲醇.水为提取溶剂,同时考察了%甲醇,%甲 醇,%甲醇等不同比例甲醇对样品中待测成分的萃取效果,对提取 效果进行比较发现:%甲醇超声提取 提取率最好。 ..方法学考察 ...线性范围及检出限 分别取适量岩白菜素 /,黄芩苷 /,甘草苷 /,丹皮酚 /,五味子素 /,罗汉果苷 /的单标贮备溶液,用%甲醇稀释摇匀,得到一系列浓度的岩 白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素、罗汉果苷的标准 溶液。采用峰面积功对浓度?进行线性回归分析,得到其线性回归 方程,检出限由相应于倍仪器信噪比的浓度值计算,结果见表.。 表六种物质的回归方程及检出限 香烟基质中中药活性成分的分离分析 ...精密度 取所测六种标准物质的低、中、高三种浓度的标准溶液按照.. 方法分别进行前处理以及分析,平行测定次。六种物质日内、 日间精密度见表.,结果表明日内、日间精密度均满足 样品分析的要求。 表六种物质日内、日间精密度 ..加标回收率以及样品分析 取支已确定岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和 罗汉果苷含量的卷烟烟丝,均分为份支/份,在每份烟丝中 分别添加不同量的岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和 罗汉果苷标样,然后采用本方法分别测定其含量,并根据原含量、 加标量和测定量计算回收率,结果这六种物质在烟丝中的回收率分别 为.%,.%,%,.%,.%,.%。同样,在已确定 烟气滤膜中岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和罗汉果 硕十学何论文 苷含量的滤膜上添加一定量的岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮 酚、五味子素和罗汉果苷标样,采用本方法测定烟气滤膜中其回 收率。结果表明这六种活性成分在烟气滤膜中的回收率均在 %..%之间,说明新建方法准确可靠。 运用此方法对试制香烟,烟气滤膜图.中岩白菜素、黄芩 苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和罗汉果苷的含量进行测定。 . . . 矗. 锄. . . . ?.瞳?香烟基质中中药活性成分的分离分析 图 .混合标样及样品色谱图 混标色谱图;试制香烟;剑桥滤片 .岩白菜素,.甘草营,.罗汉果茁,.黄苓苷,.丹皮酚, 五味子素 由谱图可得,这六种活性成分中,甘草苷、黄芩苷、罗汉果苷 没有转移,岩白菜素、丹皮酚及五味子素从香烟烟丝向烟气中有所 转移,转移率分别为.%,.%,.%。这是因为岩白菜素,丹 皮酚,五味子素的化学性质比较稳定,在烟丝燃烧过程中转移到了烟 气中,可在抽烟过程中被人体吸入,为特制卷烟中有效添加成分。而 甘草苷、黄芩苷、罗汉果苷在香烟点燃过程中由于高温灼烧挥发 掉或者生成另外的物质,不能达到预期目的。 .小结 本文成功的建立了一种准确、快速的同时测定香烟及烟气中的多 组分高效液相色谱方法。在用于香烟以及烟气中此六种中草药活性成 分的转移率的测定中,结果可靠。 硕学位论文 第三章高效毛细管电泳法测定烟丝中岩白菜素,黄芩苷, 甘草苷,丹皮酚,五味子素,罗汉果苷的含量 .引言 中药 ,在中国有近五千年 的历史,而中药有效活性成分是其发挥药效的基础。中药有效成分的 分析有其特殊的复杂性,首先是中药品种繁多,不同品种间活性成分 含量相差悬殊;其次中药中的有效成分还受产地、栽培、环境和采收 季节等多种因素影响【。对于由多种中药组成的复方制剂,情况就更 为复杂。目前用于中草药活性成分分析的方法有薄层色谱法 ‘、气相色谱法‘、高效液相色谱法?‘等, 其中高效液相色谱法最常用。但用高效液相色谱法进行中药活性成分 分析时常遇到一些问题,一是分析时间长、分离效率低,即使采用梯 度洗脱的办法也难以使成分完全分离;二是色谱柱容易被污染,且污 染后难于清洗,使色谱柱的使用寿命缩短‘。近年来发展很快的高效 ‘”】 毛细管电泳曲 , 是一种高效分离分析技术,它具有高效每米理论塔板数在以上、 快速分析时间一般为几十秒至十几分钟、进样体积小一般为 级、溶剂消耗少和抗污染能力强等特点,不仅广泛用于生物大分子, 如核酸、多肽和蛋白质等的分析,在中药有效成分的分析方面也显示 出一定的优势【。等人用高效毛细管电泳法对中药香烟基质中中药活性成分 的分离分析 等人也对 活性成分甘草苷进行了分离分析研究。年, 甘草苷这种中药活性成分进行了毛细管电泳法研究。 】等人 则是用高效毛细管电泳法对黄芩苷进行了分离分析研究。 本文为了考察岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素、 罗汉果苷这几种中药活性成分的分离情况,建立了一种方便、快 速的高效毛细管电泳方法。 .实验部分 ..试剂与仪器 / ;熔融石英毛细管河北永年责任有限公司;电子天平 梅特勒.托利多仪器上海有限公司;型超声波清洗器昆 山市超声仪器有限公司;.微型旋涡混合仪上海沪西分析仪 器厂有限公司;一精密计上海精密科学仪器有限公司; 离心机;型高速万能粉碎机北京市永光明医疗仪器厂。 甲醇,色谱纯美国天地公司;硼砂?、硼酸 、氢氧化钠,分析纯湖南师范大学试剂厂;岩白菜素标 准品纯度%中国药品生物制品检定局提供:黄芩苷标准 品纯度%中国药品生物制品检定局提供;甘草苷标准品 纯度% ; 罗汉果苷标准品纯度%中国药品生物制品检定局;丹 皮酚标准品纯度%和五味子素标准品纯度%均由中硕学伉论文 国药品生物制品检定局提供;添加中药成分的试制香烟与剑桥滤片 湖南中烟工业有限责任公司提供;水为双蒸馏水。 ..试验方法 ...电泳条件: 熔融石英毛细管 ,紫外检 .“,有效长度: 测器,检测波长: ,电泳缓冲液:. /硼酸根缓冲液 , ,进样压力:. .,分离电压: ,进样时间: 毛细管温度:?,湿度:%。 毛细管柱在使用前需进行活化处理。依次用. 溶 液、水、运行缓冲液各冲洗约 ,样品分析间隔用运行缓冲液平 。 衡 ...缓冲溶液和标准品配制 缓冲溶液的配制:精密称取硼砂. 溶 解于 容量瓶中,得硼砂储备液. /;硼酸. 容量瓶中,得硼酸储备液. /。按照表?配 溶解于 制缓冲溶液作为电泳介质,每次实验前采用. 膜过滤。 表.缓冲溶液配制表 单标储备液的配制:分别精密称取适量的岩白菜素、甘草苷、 丹皮酚、五昧子素标准品用%甲醇水振荡溶解,黄芩苷和罗汉果苷 用纯水振荡溶解,于 容量瓶中定容,得到这六种待测标准物 香煳基质中中药活性成分的分离分析 质浓度分别为 /,/。,州,/, /, “/。 ,黄芩苷. 混标配制:分别取各单标储备液岩白菜素. 儿,罗汉果 ,甘草苷. ,丹皮酚. ,五味子素. 苷 于 容量瓶中,用纯水定容至 。混标中各活性物 质的浓度分别为: /, /,/,/, ,“/。 .结果与讨论 ..缓冲溶液的值以及离子强度的选择 缓冲溶液的值大小以及浓度高低直接影响着岩白菜素、黄芩 苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素、罗汉果苷这几种中药活性成分 的电泳分离效果,其影响待测组分在电迁移过程中的存在形式以及迁 移时间。实验中分别考察了. /的硼酸缓冲液为、.、 时,对岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素、罗汉 果苷的分离影响。如图.所示,时,各活性物质保留时间 均过长,黄芩苷未被检测到;.时,五味子素、丹皮酚以及甘草 苷未有效分离,罗汉果苷和岩白菜素未有效分离,但是黄芩苷响应最 佳;硼酸缓冲液为.时,这几种中药活性成分的分离效果较好, 响应都比较好。硕十学位论文 . 图一.缓冲液值对六种中药活性成分分离的影响 .五味子素,.丹皮酚,.甘草苷,.罗汉果苷,.岩白菜素,.黄芩苷香烟基质中中 药活性成分的分离分析 ..线性范围与检出限 分别取适量岩白菜素 /,甘草苷 /,丹皮酚 /,五味子素 /,黄芩苷 /,罗汉果苷/单标贮备溶液,用纯水稀释摇匀,得一系 列浓度的岩白 菜素、黄芩苷,甘草苷,丹皮酚,五味子素,罗汉果苷标准溶液。 采用峰面积对浓度?进行线性回归分析,得到其线性回归方程, 结果见表.. 表.六种物质的回归方程 ..精密度 取六种物质低、中、高三种浓度的标准溶液按照..实验方法 分别进行前处理以及分析,平行测定次。六种物质日内、日间 精密度见表.分别都小于.%和.%,表明日内、日 间精密度均满足样品分析的要求。 硕十学位论文 ..加标回收率与样品分析 取支已确定岩白菜素、黄芩苷、甘草苷和罗汉果苷含量的 卷烟烟丝,分为份,支/份,在每份烟丝中分别添加不同量的岩白 菜素、黄芩苷、甘草昔和罗汉果苷标样,然后采用本方法分别测 定其含量,并根据原含量、加标量和测定量计算回收率,结果这四种 物质在烟丝中的回收率分别为.%,%,.%,.%。说明 新建方法准确可靠。 运用此方法对试制香烟中岩白菜素、黄芩苷、甘草苷和罗汉果苷 的含量进行测定。香烟基质中中药活性成分的分离分析 图.混合标样及香烟样品电泳谱图 混标;香烟样品. .五味子素,.丹皮酚,.罗汉果苷,.岩白菜素,.甘草苷,.黄芩苷 由谱图可得,这六种中草药活性成分中,除五味子素与丹皮酚 未能有效分离外,罗汉果苷、岩白菜素、甘草苷、黄芩苷均可得到 有效分离,从而得出,相对于对于这六种活性成分普通裸毛细管柱不 能达到预期分离目的。硕十学位论文 .小结 本实验成功的建立了一种准确、快速地同时测定岩白菜素,黄芩 苷,甘草苷,丹皮酚,五味子素,罗汉果苷多组分高效毛细管电泳 方法。并用于香烟中此六种中草药活性成分的测定,结果较为满意。香烟基 质中中药活性成分的分离分析 第四章纳米金涂层毛细管制备及其对香烟中添加的中草药 活性成分分析的应用研究 .引言 纳米金作为纳米材料的一个方面,已经成为纳米科学中的一个重 要的研究发展方向,近年来已在许多科学领域引起了广泛的重视,成 为众多科学研究的热点。纳米金具有良好的生物相容性,由于它不会 破坏生物体内酶和蛋白质的活性,可用在生物标记和蛋白质浓度的测 定【。目前有关纳米金制备方法已经有很多报道,主要有物理方法和 化学方法【。对于物理制备法,其构想为由大到小,即所谓的自上 而下.的方式,将大块材料利用物理的如粉碎或研磨等方法, 伎物体的尺寸达到纳米尺度;而对于化学制备法,其构想为由小到大, 即所谓的自下而上.的方式,采用的前体物为分子,这些分 子通过化学反应如还原而生成原子,这些原子通过可控聚集成具有纳 米尺寸的粒子【。化学方法又分为溶胶法、晶种生长法、相转移法和 模板法,其中溶胶制备法应用最为广泛。张念椿‘等人通过结合 柠檬酸钠和硼氢化钠还原法制备了金壳包覆二氧化硅纳米复合粒子, 用、..、来进行表征和研究。谢娟【硎等人合成 制备了负载型金催化剂,运用傅立叶变换红外光谱.、射线能 谱、透射电子显微镜、射线光电子能谱以及原子 吸收光谱等对样品进行了表征。罗明灯【等人以羟乙基纤维素