苯酚硫酸法测总糖.doc

苯酚硫酸法测总糖.doc 苯酚-硫酸法 苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖～并迅速脱水生成糖醛衍生物～然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 [试剂] 6%苯酚: 先配置80%苯酚:80g苯酚,分析纯重蒸馏试剂,加20g水使之溶解～可置冰箱中避光长期储存。 再配置6%苯酚:取75ul的80%苯酚于烧杯中～加入960ul水,每次测定均需现配,～测定的时候就用6%的苯酚来测: 浓硫酸 [操作] 1(制作曲线:准确称取标准葡聚糖,或葡萄糖,20mg于500ml容量瓶中～加水至刻度～分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml～然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却～室温放置20分钟以后于490nm测光密度～以2.0ml水按同样显色操作为空白～横坐标为多糖微克数～纵坐标为光密度值～得标准曲线。 2(样品含量测定: 吸取2.0ml样品～然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置30分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。 可能有以下问题需要注意: 1。苯酚是否重蒸、其溶液浓度、是否现配现用 2。加入硫酸后是否加热、显色时间的确定 3。阁下所选波长:这个最为重要～因为已糖及其甲基化衍生物在490nm下有最大吸收峰～而戊糖、糠醛酸及其甲基化衍生物在480nm下有最大吸收峰。如果阁下的多糖样品不是单一品而是数种混合,纯化也难一达到100%纯,～则波长一定要扫描过再做 4。加浓硫酸前要摇匀～加之后也要摇匀。 苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖～并迅速脱水生成糖醛衍生物～然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 原理 多糖在硫酸的作用下先水解成单糖～并迅速脱水生成糖醛衍生物～然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 试剂 1( 浓硫酸:分析纯～95.5% 2( 80%苯酚:80克苯酚,分析纯重蒸馏试剂,加20克水使之溶解～可置冰箱中避光长期储存。 3( 6%苯酚:临用前以80%苯酚配制。,每次测定均需现配, 4( 标准葡聚糖,Dextran,瑞典Pharmacia,,或分析纯葡萄糖。 5( 15%三氯乙酸,15%TCA,:15克TCA加85克水使之溶解～可置冰箱中长期储存。 6( 5%三氯乙酸,5%TCA,:25克TCA加475克水使之溶解～可置冰箱中长期储存。 7( 6mol/L 氢氧化钠:120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。 8( 6mol/L 盐酸 操作 1(制作标准曲线:准确称取标准葡聚糖,或葡萄糖,20mg于500ml容量瓶中～加水至刻度～分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml～然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却～室温放置20分钟以后于490nm测光密度～以2.0ml水按同样显色操作为空白～横坐标为多糖微克数～纵坐标为光密度值～得标准曲线。 2(样品含量测定: ?取样品1克,湿样,加1ml 15%TCA溶液研磨～再加少许5,TCA溶液研磨～倒上清液于10毫升离心管中～再加少许5,TCA溶液研磨～倒上清液～重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意:总的溶液不要超出10毫升。,既不要超出离心管的容量,。 ?离心～转速3000转/分钟～共三次。第一次15分钟～取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。,测肝胰腺样品时～每次取上清液时应过滤。因为其脂肪含量大容易夹带残渣。, ?水浴～在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀～在96?水浴锅中水浴2小时。 ?定容取样。水浴后～用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的样品液～以蒸馏补至2.0ml～然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。 注意 ,1,此法简单、快速、灵敏、重复性好～对每种糖仅制作一条标准曲线～颜色持久。 ,2,制作标准线宜用相应的标准多糖～如用葡萄糖～应以校正系数0.9校正μg数。 ,3,对杂多糖～分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。 ,4,测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1——0.3 之间。比如:小于0.1之下可以考虑取样品时取2克～仍取0.2ml样品液～ 如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。