极谱分析法在涎磷蛋白和氧化石墨烯电化学检测中的应用

极谱法在涎磷蛋白和氧化石墨烯电化学检测中的应用 极谱分析法在涎磷蛋白和氧化石墨烯 电化学检测中的应用 学位完成日期 指导教师签字 答辩委贻成员粹主盔鱼 邋 里錾盏 李坳极谱分析法在涎磷蛋白和氧化石墨烯电化学检测中的应用 摘要 本文描述了以辣根过氧化物酶为标记酶的一种高灵敏的电化学酶联免 疫分析法测定人牙本质涎磷蛋白的新方法。分别以,’,,’.四甲基联苯胺 、邻联甲苯胺、邻苯二胺、邻联茴香胺作为酶催化反应的 底物,用线性扫描二阶导数极谱法检测酶催化产物,在滴汞电极上产生一个 灵敏 的线性扫描二阶导数极谱还原峰,将该方法与生物素的双抗体夹心法相偶 联,应用于的检测。牙本质涎磷蛋白是正畸牙根吸收程度的重要标 志物。本论文构建了一种检测微量人牙本质涎磷蛋白的电化学酶联免疫分析 新方 法。 羧基氧化石墨烯.具有模拟酶的性质,在双氧水存在下能催化氧化 底物,,,一四甲基联苯胺,从而得到了蓝色的产物,线性扫描二阶导数极 谱法检测酶催化产物,产物有一个灵敏的还原峰。羧基氧化石墨烯. 对,,,一四甲基联苯胺的催化能力要高于生物酶辣根过氧化物酶, 羧基氧化石墨烯?像辣根过氧化物酶一样催化过程属于乒乓机 制。将该方法应用测定鲜牛奶中的含量,得到了满意的结果。 关键词:电化学酶联免疫分析法牙本质涎磷蛋白辣根过氧化物酶羧基功能化 氧化石墨烯 ?’,, . ,.,?,?, , . . . .? ? ,,..? . .?叼瓜: ? ,, , 目 录 第一章文献综述 .电化学酶联免疫分析? ..伏安酶联免疫分析法?.. ..安培酶联免疫分析法?. ..电化学酶免疫传感器?. .过氧化物酶及其底物体系..过氧化物酶??. ..辣根过氧化物酶催化原理??. ..过氧化物酶催化的常见底物?.. .伏安酶联免疫分析法在临床上的应用??. ..乙型肝炎病毒抗原抗体的测定. ..人血清铁蛋白的测定?. ..人血清甲胎蛋白的测定. ..人血清甲状腺的测定?. ..人血清和的测定??一 ..人血清类风湿因子抗体的测定. .牙本质涎磷蛋白的研究意义及现有检测方法 ..研究意义??..:? ..牙本质涎磷蛋白检测方法的研究进展 .氧化石墨烯?. ..氧化石墨的发展历史? ..氧化石墨烯的合成..羧基功能化的氧化石墨烯的研究.本论文的基本思路 和目的?.. 参考文献 第二章,’,,’一四甲基联苯胺电化学酶联免疫分析体系 测定人牙本质涎磷蛋白的研究? .实验部分??一 ..仪器 ..材料..实验方法.结果和讨论?. .. ?.催化体系的线性扫描二阶导数极谱曲线? .. 酶催化产物的电化学行为 ..偶合反应条件? ..测定条件 ..测定的工作曲线. ..电化学检测?一 .本章小结??一 参考文献 第三章邻联甲苯胺一电化学酶联免疫分析体系测定入牙本 质涎磷蛋白的研究 .实验部分??. ..仪器..材料? ..实验方法 .结果和讨论?. .. .一催化体系的线性扫描二阶导数极谱曲线?.. .. 酶催化产物的电化学行为 ..偶合反应条件? ..测定条件 ..测定的工作曲线. ..电化学检测.本章小结参考文献 第四章一种检测微量人牙本质涎磷蛋白的电化学酶联免疫分析新方 法的研究? .实验部分??.. ..仪器??.. ..材料?. ..实验方法 .结果和讨论?. ...线性扫描二阶导数极谱曲线.. ..偶合反应条件的优化?..测定条件的选择 ..测定的工作曲线、精密度和检测限?一 .. 的电化学检测?.. 本章小结??.. 参考文献 第五章邻联茴香胺.电化学酶联免疫分析体系测定人牙本 质涎磷蛋白的研究 .实验部分??一 ..仪器? ..材料?一 ..实验方法 .结果和讨论?. .. ?一催化体系的线性扫描二阶导数极谱曲线? .. 酶催化产物的电化学行为 ..偶合反应条件? ..测定条件的选择 ..测定的工作曲线一 ..电化学检测.本章小结??. 参考文献?: 第六章羧基功能化氧化石墨烯作为模拟酶催化底物,’,,’.四甲基 联苯胺电化学测定和的研究??.. .实验部分??一 ..仪器? ..材料?. ..氧化石墨烯的制备..石墨烯的羧基化 ..电化学检测.结果和讨论?一 ..羧基功能化氧化石墨烯的表征 ..催化反应的光谱和电化学研究 ..条件优化 ..定量测定一 ..新鲜牛奶中的测定??. .本章小结??. 参考文献 结 论致 谢? 攻读学位期间已发表和待发表的相关学术论文题录? 声明??一 青岛科技大学研究生学位论文 第一章文献综述 弟一早义瓠琢迎 .电化学酶联免疫分析 免疫通常所指免除疫病传染病及抵抗多种疾病的发生。十九世 纪后半期,病原茵的发现,从抗感染免疫研究开始了科学免疫学时期,经历一 百年时间,免疫学才发展成为一门独立的学科,揭示了免疫系统及免疫细胞的 存在,揭示了免疫细胞的免疫应答过程及其生物功能;阐明了免疫防卫及免疫 病理作用;认识经免疫应答及免疫耐受的两种不同效应,免疫系统执行协调统 一的生理功能等等免疫学的基本问题。免疫分析是利用抗体与抗原的特异性结 合作用来选择性识别和测定可以做为抗体或抗原的待测物。抗原.抗体反应的特 异性和专一性决定了免疫反应具有很高的选择性。根据是否在分析体系中引入 探针系统,免疫分析可分为两大类:传统免疫分析法又称非标记免疫分析法 和标记免疫分析法。 在传统免疫分析中酶已经被广泛应用,由于酶具有催化作用,所以放大了 检测信号,提高了酶免疫传感器的灵敏度,又因为酶没有放射性,并且已经得 到了商品化,此类传感器得到了广泛得应用。酶免疫传感器是免疫传感器里 的 标记型免疫传感器,免疫传感器按照是否使用标记物可以分为非标记型免疫 传 感器和标记型免疫传感器。酶联免疫法吸附分析法依据酶催化反应产 物的理化性质可以分为化学发光分析法、电化学分析法、荧光分析法、分 光光度法等。其中分光光度法作为最为常用的检测方法,此方法判断免疫 反应是根据底物颜色的变化,样品中相应的抗原或抗体的量与颜色变化的 深浅成正比,由于酶标仪自动化程度较高,所以采用酶标仪对结果定量分 析。法研究的比较成熟,应用最为广泛,在很多杂志和文献中有详细介 、 绍【.】。此法最早由、和 时建立。 酶联免疫吸附分析法已经成为最为成功的酶免疫测定方法,在 孔酶标记板中加入标记抗原或者抗体,连续在酶标板上温育样品,酶标记的 抗体或者抗原和酶催化的底物,在反应中的每一步都有洗涤过程,除去了未 反 应物质和干扰物质,然后用吸光光度法和荧光法测定标准微量滴定板中每个 孔 的样品。法适用与少量样品的检测,这个方法可以减少样品的采样时间。 免疫反应中用酶标记物同抗原抗体复合物相结合,由于酶具有催化放大的 作用,所以此方法具有了高的敏感性和特异性,所以检测的灵敏度得到了极谱分析法在涎磷蛋白和氧化石墨烯电化学检测中的应用 很大的提高,例如以碱性磷酸酶为标记酶法测定兔、结合球 蛋白、胰岛素、癌坯抗原【,】。 在过去几十年的医学实验里,免疫分析已经成为一种标准的技术,目前已 经开始应用在环境检测‘ 】和食品质量控制【的领域。但由于显色光度法的 灵敏度较低,所以,不断地研究和开发高灵敏度、高选择性的临床化学测 定新方法仍然是临床化学的重要工作。近年来,电化学免疫分析法 ,作为新的研究方法,由于成功的将免疫反 应的高选择性和电化学测定的高灵敏度相结合越来越受到人们的重视【】。 年由和首次用极谱法测定了偶氮标记的抗原【。生物酶、电化 学活性物质和纳米粒子【】是三类电化学免疫分析的标记物。作为标记物必须具 备以下条件,首先具有酶的高活性并在短时间内将大量底物分子转化为产物, 其次在不降低活性的条件下容易与抗体或抗原结合,再次在检测过程中和保存 条件下稳定,最后生成的产物具有电化学活性。 电化学免疫分析中具有比较高的灵敏检测方法是伏安法和极谱法,其中线 性扫描伏安法、微分脉冲极谱、阳极溶出伏安法是经常用到 的检测技术。在电化学免疫分析中,通常直接测定通过酶标记抗原或抗体的催 化产物的信号,或者测定抗原抗体上的电活性物质如偶氮硝基、、、 、、等来达到检测目的。 ..伏安酶联免疫分析法 将酶联免疫分析法与伏安法相结合形成一种新的分析方法为伏安酶联免疫 分析法,它具备了免疫反应的特异性和伏安法的高灵敏度和高准确性,从而具 有高的灵敏度、宽检测限范围和低检测限。在免疫体系中,由于酶具有催化作 用,使产物产生了一种电活性物质,然后用伏安法对产物进行检测表征,最后 得到还原反应产物的电流.电压曲线。它具备了伏安法的高灵敏度和高准确性, 所以在伏安曲线中能显现出电活性物质微小的变化,所以为了得知整个免疫体 系的反应情况,就可以通过观察电流一电压信号的变化情况,从而推断出酶的催 化能力。 在伏安分析法中,通常在工作电极上施加电位,此电位有一定的规律变化, 如果电活性物质存在于溶液中,那么在电极表面上电活性物质就会发生氧化 或 还原反应,并产生电流,通过对电流大小的检测来判断电活性物质的还原程度。 目前常用到的伏安技术有线性扫描伏安法,微分脉冲极谱法,阳极 溶出伏安法等。伏安分析法遵循法拉第定律,它反映了电极上氧化还原反 应的速率。其中传质速率和电子转移速率控制该反应速率。当电极上发生电化青岛科技大学研究生学位论文 学反应时,所产生的法拉第电流由上面两个因素中较慢的一步所决定。 伏安酶联免疫分析法具有高的灵敏度,宽的检测范围和低检测限,而且仪 器简单,操作方便,且不大容易受生物样品中常遇到的混浊、黄疸、溶血、酯 尿等的干扰,因为具备以上优点,在对少量样品的分析得到了十分广泛的应用, 国内外都有对伏安酶联免疫分析法检测各种抗原、抗体、激素、药物和微生物 的文献报道.。 ..安培酶联免疫分析法 电化学分析技术中另一种常用的酶联免疫分析法是安培法,又称为控制电 位安培检测法。它是在某个确定电位上,被测物质可以发生氧化、还原反应, 将工作电极的电位控制在这个电位上,当检测含有该物质的样品时,将产生一 个可以检测的电流从而测定出样品中该物质的浓度。在恒定的电位下测定待测 物质的氧化还原电流是最简单、最常用的模式,它可以避免双层充电和表面 瞬 变效应,因而信噪比高,可以达到很低的测定下限。为了达到检测低浓度样品 的要求,可以使用示差脉冲安培法、三脉冲安培法、反向脉冲安培法,或是采 用双电极或多电极检测模式,它们只需根据需要改变电位的各种参数。安培 法 可以进行测定具有电活性的物质,如苯酚类、硫醇类、硝基化合物、亚胺类、 吩噻嗪类有机物,可以根据所测定的化合物的电化学性质选择相应的测定电 位。 ..电化学酶免疫传感器 免疫传感器的概念由等】在年提出,它是电化学免疫分 析中的一个重要分支。免疫传感器是以免疫反应为基础,根据免疫反应中 是否使用标记物又可分为非标记型免疫传感器和标记免疫传感器。酶免疫 传感器是以酶为标记物的标记型免疫传感器。由于酶具有催化作用,可以 对信号进行放大,因此酶免疫传感器具有较高的灵敏度,而且酶不具有放 射性,且已经商品化,所以此类传感器应用十分广泛。它分别将传感技术 的高灵敏度和免疫反应的特异性结合起来,因此,免疫传感器是用来监测 抗原一抗体反应的生物传感器】。根据其换能器的不同被划分为四类:电 化学免疫传感器、 质 量检测免疫传感器、热量检测免疫传感器和光学免疫传感器。 电化学酶免疫传感器早在年由等【】提出作为临床检测装 置。它结合了的高效特异性和电化学检测的操作简单等优点。电 化学酶联免疫传感器是将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机 结合而发展起来的一种融合性技术。它的原理是借助酶的免疫分析的高效极 谱分析法在涎磷蛋白和氧化石墨烯电化学检测中的应用 特异性和催化放大作用,通过化学方法或者是生物方法将酶与抗体或抗原 结合起来,形成酶标记物或通过免疫学的方法将酶与抗酶体结合起来,形 成免疫复合物,这些酶标记物或免疫复合物仍保持其免疫活性。然后它与 相应的抗原或抗体反应,形成酶标记的或含酶的免疫复合物。再利用结合 在免疫复合物上的酶遇到相应底物的催化作用,使底物发生水解、氧化或 还原反应,或形成共价键结合点,通过电化学分析方法进行定性、定量测 定。电化学酶免疫传感器已经应用在食品安全监测【、环境监测 等。 .过氧化物酶及其底物体系 ..过氧化物酶 ...在自然界中广泛存在,过氧化物酶的活 过氧化物酶, 性在植物、微生物和动物中已经被证实而且扮演着十分重要的角色。它在植 物 中起着木质化的作用【和在物理损坏或组织感染起防御机制的作用【】。由 于过氧化物酶有相当高的热稳定性和广泛的分布,在食品工业已经被广泛应 用 于适当蔬菜漂烫的标准【。大多数过氧化物酶是亚铁血红素蛋白,一般以 和原卟啉高铁血红素作为辅基,它们的分子量范围从到 不等,可以分为哺乳动物过氧化物酶、植物过氧化物酶和微生物过氧化酶。植 物过氧化物酶包含酵母细胞色素酶,植物抗坏血酸过氧化物酶,真菌过氧化物 酶和其它常用的过氧化物酶。然而哺乳动物过氧化物酶包括了髓过氧化物酶, 乳过氧化物酶,甲状腺过氧化物酶和前列腺素合成酶。过氧化物酶通常用 于过氧化物的分析,也可用于葡萄糖、半乳糖、氨基酸及其他能生成、测量 混合酶反应中的酶体系的偶合分析。辣根过氧化物酶 ,是临床检验试剂中的常用酶。该产品广泛应用于工业生产和物 质的分析检测。它能够在低浓度下催化特殊底物生成有色产物,因此可以用来 制备广泛应用于试验的共轭酶抗体。在聚合酶系统中,过氧化酶与其他 的酶类紧密结合在一起,分离出的氢过氧化物酶可用于多种化合物的分析检测。 辣根过氧化物酶能催化过氧化氢氧化还原性底物,生成有色的产物。 的纯度以/的比值即值来衡量,高纯度制剂的 ?.。其比值越小,说明其中含有杂蛋白越多。如.的酶样品中, 非酶蛋白的含量为%,在酶复活后酶的活性下降,而比值并不发生改变。 .、 质量的另一重要指标是酶的活性,以单位表示。通常以能在、 的时间内催化底物邻苯三酚产生红桔酚作为酶的一个活 青岛科技大学研究生学位论文 性单位。 目前还原过氧化物酶催化氧化的电子供体底物已经广泛应用于工业生产和 物质的分析检测中。由于过氧化物酶能在较低的浓度下催化氧化底物生成显色 产物,所以过氧化酶比较适合做检测中酶标记抗体】。过氧化物酶和其 它复合酶体系中的过氧化氢酶也被用于其它化合物的检测,例如检测血液中的 葡萄糖。由于过氧化物酶的氧化性质,在一些领域中已经代替了目前的化学氧 化技术。 ..辣根过氧化物酶催化原理 辣根过氧化物酶是在辣根中提取出的。辣根过氧化物酶可以通过双氧 水或者相关化合物催化氧化多种底物,它是电化学生物传感器中常见的金 属酶羽。辣根过氧化物的活性中心含有血红素,静态亚铁血红素离子的氧化态 是。在催化反应中由于过氧化氢提供电子受体形成了化合物 , 是高氧化态的催化中间体,包含一个含氧中心和一个 带正电荷的卟啉。其实低温下在 形成的过程中还测到另一个催化中间体 ,被看成是一混合物,但是它的存在非常短暂。在正常 情况下, 再经过两个等式就能回。第一个等式由一分子还原性底 和 物的加入,生成另一个含有含氧中心的催化中间体。 都是强氧化剂,氧化还原电势接近 。第二个等式也是有一分子还原 性底物参加,使还原成和另一个自由基【】。的酶催化循环 可以用下列简式表示:一? ?? 式中 和 称为化合物和化合物,为体系底物, 是一种还原剂,?为自由基中间产物。酶的两电子氧化之后随即发生两 电子还原,从而实现催化循环。总的反应可以表示为: ?在存在条件下 较为便宜,特异性强,活性较高,所以在酶免疫测定和免疫细胞 组织化学、抗肿瘤基食品工业、污水处理、合成高分子材料中得到了广泛 应用。在伏安酶联免疫分析中将过氧化氢在~定量被抗体或抗原标 记的的存在下催化氧化还原性底物,在得到的反应产物具有电活性, 并用免疫反应和伏安法检测反应产物。是免疫分析和伏安酶联免疫 中常用的标记酶,它能催化氧化某些有机化合物,其酶催化反应产极谱分析 法在涎磷蛋白和氧化石墨烯电化学检测中的应用 物可以在电极上发生还原反应,或者酶催化反应可以使有电活性的有机化 合物生成无电活性的产物,通过对反应产物的测定,进而可以伏安法测定 活性。 ..过氧化物酶催化的常见底物 辣根过氧化物酶催化活性高,易于标记且不易失活,特异性高,性质 稳定,所以在酶免疫分析中应用十分广泛。在酶联免疫反应常见的底物为 苯胺、苯酚类化合物,其中以,’,,’一四甲基联苯胺、邻苯二胺 、邻联甲苯胺、邻甲氧基苯酚等作为最为常见的底物。辣根过 氧化物酶在存在下催化氧化常见底物的反应方程见下表?。 表.底物分类 ?. 底物分类 底物种类 催化氧化反应方程 联苯胺类 联甲苯胺、邻联 底物 茴香胺、,’,,’一 ”爹《~邺:一爹《?唾: 四甲基联苯胺、 联苯胺 邻苯二胺、间苯 苯二胺类 二胺、对苯二胺 及其衍生物、 ,一二氯一二甲 》:?:取: 基对苯二胺、硫 酸对氨基、,一 二乙基苯胺 氨基酚类 邻氨基酚、间氨 基酚、对氨基酚 ?一’一心 .伏安酶联免疫分析法在临床上的应用 ..乙型肝炎病毒抗原抗体的测定【】 乙型肝炎是病毒性肝炎中危害性最大的肝炎。这是由于乙型肝炎病 毒感染机体后,除了会有急性表现外,还会有无症状带病毒者、慢性肝炎、肝 硬化、肝癌等。现在常用的放射免疫分析法和法等分析方法。但焦奎等 青岛科技大学研究生学位论文 人提出了新的检测方法,他们将.一和.作为两个伏 安酶联免疫分析体系,用电化学测定血清中乙型肝炎病毒多种抗原抗体。目前, 也有将金纳米材料和其它的材料结合起来形成复合材料,将复合材料沉积在电 极上再对检测。这些方法都取得了令人满意的结果。 ..人血清铁蛋白的测定 人血清铁蛋刍为一储存及利用铁的蛋白质,主要储存于网状肉皮 系统及骨链中。人铁蛋白微量存在于血清中,但血清铁蛋白浓度的水平及其变 化可以反映体内的铁储备,所以在缺铁性贫血及肝癌的检测中测定铁蛋白的含 量是项重要指标。目前、琼琼脂双扩散及问接血凝试验等方法在临床检 测中测定铁蛋白作为常用的方法。焦奎等人提出了伏安酶联免疫分析测定人血 清中铁蛋白的方法,分别以?一、?.、.一 作为伏安酶联免疫分析体系。该方法采用双抗体夹心免疫分析法用被抗原或抗 体标记的催化氧化底物生成了具有电化学活性的产物,再用线性扫 描二阶导数伏安法检测该产物。用此方法测定血清样品中的铁蛋白。结果证明 灵敏度高于经典的分光光度法。并且此方法与分光光度法进行 对照,二者相关性很好。 ..人血清甲胎蛋白的测定【】 胚胎中重要血清成份是甲胎蛋白。在肝癌细胞的早期诊断中得到 发现和应用。它作为一单一肽链已成为检查肝癌流行病学的重要手段,并且成 为肿瘤标志物。在现阶段中检损的最常用的方法是显色光度、琼脂 双扩散、电泳和间接血凝等方法。伏安酶联免疫分析法作为一种新的测定 的方法被焦奎等人提出。此方法采用双抗体夹心模式,分别以..、 ?一和..作为三个伏安酶联免疫分析体系。结果表明 此方法与传统的分光光度法相比较,具有高的灵敏度、宽的线性范围和 低的检测限。 ..人血清甲状腺的测定【?】 总甲状腺,即,,’,’.四碘原氨酸,简称,系由甲状颅泡细胞合成的一 种主要的甲状腺,与甲状腺球蛋白结合后储存于甲状颅泡腔内。在垂体促甲状 腺激素的刺激下,甲状腺球蛋白水解,释放.进入血液,其中大部分会与 甲状腺素结合球蛋白结合,游离仅占.%,是相当重要的,对于在 维持甲状腺激素的稳定和正常甲状腺机能方面。经血液进入组织,在靶细极谱分析法在涎磷蛋白和氧化石墨烯电化学检测中的应用 胞起生理作用。绝大多数情况下,测定血清总甲状腺素即可反映的浓度。 目前、琼脂双扩散及间接血凝试验等方法作为测定临床检测中的常用 方法。期中的特异性和敏感性较好,是目前较为流行的检测方法,但由 于该检测方法是采用传统的分光光度,从而影响了而该方法灵敏度的进一步提 高,而且易受到生物样品中常遇到的浑浊、黄疸、溶血和酯尿的干扰。伏安酶 联免疫分析法作为一种新的方法测定人血清中总甲状腺素被焦奎等人提出,他 们分别以.一、?和?一作为三种伏安酶 联免疫分析体系。结果显示伏安酶联免疫分析法灵敏度高于经典的分光 光度法。用所建立的方法对人血清样品进行测定,并与现行的分光光度 法进行对照,二者相关性很好。 ..人血清和的测定【】 陈洪渊等人用固体电极作为工作电极对催化反应体系进行检测,利用 催化氧化的反应,以金电极作为工作电极,示差脉冲伏安法检 .的乙酸缓冲溶液中检测该反应产物,在. 测酶催化反应产物,在 ./处有一个良好的还原峰,他们将该体系成功应用于人血清和 特异抗体的测定,结果显示出该方法的检测限要低于传统的光度法。 ..人血清类风湿因子抗体的测定【】 陈洪渊等人采用.一体系,固体金电极作为工作电极,酶催化 反应产物在.的磷酸盐.枸橼酸缓冲溶液中检测,在../ 处产生一个灵敏的示差脉冲伏安峰,将该体系与双抗体夹心法相偶合,检测人 血清类风湿因子抗体心,有实验结果得出,此方法的灵敏度比传统的光度 法高。 .牙本质涎磷蛋白的研究意义及现有检测方法 ..研究意义 正畸力加于牙体后,通过牙周膜的变化,牙骨质也会受到一定的影响,但 它不像牙槽骨那样活跃敏感牙骨质是一种相当独立的组织,不像骨组织,不涉 及钙平衡的代谢过程,牙骨质的最外层有未钙化层保护,称类牙骨质。形成牙 骨质的是成牙骨质细胞,它和破牙骨质细胞一样都来自牙周膜中未分化间叶细 胞尽管牙骨质比骨组织更耐吸收,但在压力一侧,随着牙齿受压,有减少其厚 度的倾向,若压力持续很长时间,即使有未钙化的组织保护,牙根也开始吸收。青岛科技大学研究生学位论文 牙根吸收是正畸治疗过程中常发生的不良后遗症【。大多数患者在正畸过程中 都会出现轻度牙根吸收,矫治结束后不会出现牙齿松动。但是少数患者会出现 严重的牙根吸收,牙齿会出现松动甚至脱落。一般牙根吸收可分为三类:表层 吸收、炎性吸收、替代性吸收【】。牙根吸收是典型的表层吸收。按吸收程度的 不同可以分为,轻度吸收,一般吸收和严重吸收。在临床上轻度吸收是不怎么 重要的,然而大多数人都会有牙根的轻度吸收,有些病人甚至失去了三分之一 的牙根。通过光根尖片诊断显示几乎每个病人的根尖都有损伤引。当臼齿 受到影响的时候就会感染切齿【。 正畸牙根吸收的生化诊断基于以下的机理设想:当牙齿受力的时候,牙根 受力部位附近的牙周膜细胞穿入未矿化的前牙本质中,引发一系列反应导致牙 根吸收的发生。牙根组织被特定的细胞分解和吸收,被分解的牙本质蛋白被释 放到龈沟液中,通过一定的生化手段检测出牙本质特异性蛋白的含量继而间接 诊断牙根吸收的严重程度。国内外已有学者在此领域进行研究。 龈沟液 ,是通过牙龈沟内上皮和结合上皮从 牙龈结缔组织渗入到龈沟内的液体,龈沟液的液体成分来源于血清,其他成 分则来源于附近牙周组织及细菌,包括抗体一补体系统成分、电解质、氨基酸、 免疫球蛋白等,具有抗菌和增强牙龈免疫的能力。在牙周组织病变或改建的 过 程中,龈沟液中的成分可能发生微量改变。从世纪年代以来,龈沟液分 析技术得到了迅速发展。目前已经被应用于诊断、监测、治疗各种牙周疾病’。 早期正畸治疗中牙根吸收的检测是在牙根炎性吸收的时候才可检测出来【 。 目 前使用光放射技术检测牙根吸收,结果证明病人在进行正畸治疗的时候,当 龈沟液中含有牙本质基质蛋白 ,和牙本质磷蛋白 ,时出现了牙根吸收【】。和牙本质涎蛋白 ,是非胶原性蛋白,它还涉及到牙本质的生物矿化。 蛋白首先在骨质中被发现。牙本质随着日常的牙根吸收在牙髓表面形成了 二级牙本质。因此,正畸牙根吸收是一个牙根组织牙骨质和牙本质破坏降解 和重建的过程。这些蛋白质只存在于牙根吸收中牙周韧带的部位。已经 在对照品和检测品中用免疫印迹的方法检测出来【。在牙本质中能检测到少 量 浓度的,所以它不能作为牙根吸收的标志。非胶原蛋白组成的牙骨质和 牙本质蛋白的降解和破坏产物从中释放出来,用免疫印迹法检测病人不 同程度的牙根吸收,在牙龈沟液中都检测出了,】,虽然这个方法不能提供 大量的信息,但是它证明了牙本质磷蛋 ,做为牙根吸收的检测标志。是非胶原蛋白的重要组成 成分,约占%。它是一种高度磷酸化的蛋白质,带有很强的负电荷,是目前极谱 分析法在涎磷蛋白和氧化石墨烯电化学检测中的应用 所发现的酸性最强的蛋白质,与的结合能力很强。尽管目前对它的功能还 不很清楚,但大多数学者认为可能在牙本质的形成,尤其是生物矿化过程 中起着重要的作用。 ..牙本质涎磷蛋白检测方法的研究进展 正畸治疗过程中出现了牙根吸收,如果能够及早诊断出牙根吸收,可以防 止患者牙齿松动加重或脱落。正畸牙根吸收是典型的表层吸收。牙根吸收的发 生及严重程度与许多因素相关。例如:错合畸形的类型、矫治方法的不同、矫 治力的大小、矫治时问的长短、牙齿的形态结构与位置、牙齿的状况根治与否、 性别、年龄、牙龄、遗传、内分泌因素等【。个体差异也被认为是出现不同程 度牙根吸收的不容忽视的因素【。动物实验显示,某些药物可以改变牙根吸收 的发生率【】。由此得出,对于牙根吸收的机理,口腔正畸临床医师及科研工作 者尚未明悉。所以很难有效的控制牙根吸收。无论研究牙根吸收进行的哪方面, 都要必须诊断牙根吸收。目前有以下几种方法检测牙根吸收见表一。 表牙根吸收的检测方法. 检测方法 检测原理 方法优缺点 影像学检测方法 沙海亮【】对曲面断 优点:能精确诊断牙根吸收,影像学方 法操 层、根尖片诊断牙根 作简便,影像直观清晰【】。 吸收精确性进行了 缺点:影像学方法诊断出的牙根吸收显著滞 系统研究。 后于实际牙根的不可逆病理性吸收【。另 外,由于影像学方法存在辐射损伤,不可能 使用该方法对牙根吸收的进展状况进行纵 向观察,总结牙根吸收的发生规律【。 无创性生化方法 通过检测龈沟液中 优点:、敏感性高、辐射损伤性小、可 牙本质蛋白含量变 以实现时时监控。使用生化诊断牙根吸收方 化间接诊断牙根吸 法不仅可以预测牙根吸收的易感人群,而且 还可以动态观察分析牙根吸收的规律性,同 收,主要使用酶联免 疫吸附检测法测定。 时可以评估正畸治疗的疗效等。 缺点:龈沟液样品量少,待测液中的有效成 分更是希罕,很难保证酶联板的均一性和透 光性,使用分光光度法限制了测定的精密度 和检测限,容易出现假阴性结果。青岛科技大学研究生学位论文 以上是目前诊断牙根吸收的主要方法,但这些方法都存在着一定的局限性, 而电化学法诊断牙根吸收与传统法相比是一种新方法。法 定量测定龈沟液中蛋白,方法原理简单,仪器价格便宜,可以目测得到结果, 并且仪器的自动化程度高,是一种成熟的检测手段。但是,由于龈沟液样品量 少,待测液中的有效成分更是稀少,很难保证酶联板的均一性和透光性,使用 分光光度法限制了测定的精密度和检测限,容易出现假阴性结果。 电化学法将酶联免疫吸附检测法同电化学分析相结合,它结合了免 疫分析的高特异性和电分析化学的高灵敏度。由于电化学法灵敏度高, 检测范围宽,非常适用于少量样品的分析,不易受生物样品中常遇到的浑浊、 黄疸、溶血、脂尿等干扰,且易于实现自动化和连续化,所以它才能快速、精 确、稳定测定龈沟液中牙根吸收特异性蛋白含量变化。目前,电化学法 已经用于人血清中甲胎蛋白、乙型肝炎抗体等抗原抗体、激素、药物和微生 物 的检测。但是尚无用此方法检测等牙根吸收特异性蛋白的报道。 本研究选择电化学法作为诊断正畸牙根吸收的新手段,如果成功使 用电化学法检测龈沟液中牙根吸收特异性蛋白,将会解决多年来牙根吸 收诊断方法的技术缺陷,大大提高正畸牙根吸收诊断方法的灵敏度、准确性, 使得真正揭示正畸牙根吸收发生规律性、探索正畸牙根吸收发生机制成为可 能, 最终实现对正畸牙根吸收的防治。 .氧化石墨烯 ..氧化石墨的发展历史 石墨烯是一种碳原子之间呈六角环形片状体,它被称为宇宙中最薄的材料 【】,由一层碳原子构成一个二维空间无限延伸的基面,是严格意义上的结 构材料。它被认为是富勒烯、碳纳米管、石墨的基本结构单元。图一是石墨 烯的结构示意图,它的形状类似蜂窝【,。 图?石墨烯示意图. 极谱分析法在涎磷蛋白和氧化石墨烯电化学检测中的应用 氧化石墨是当强氧化剂氧化石墨时,石墨层间就会有氧原子进入,氧原子 的进入会使层面内的二键断裂,并以,?,?等官能团的形式 与石墨片层中的碳原子结合,形成共价键型石墨层间化合物。通常,氧化石墨 由两种区域构成,一是未被氧化的芳香区,碳原子,二是氧化反应对晶格 破坏形成的脂肪六元环噩,碳原子,两者相对大小与氧化程度有关,然而, 由于氧化石墨的具体结构和组成随着合成方法和合成条件的变化而有很大差 异,因此氧化石墨结构的确定仍然是此领域研究的难点之一。氧化石墨 ,是由氧化石墨烯 ,片层排列而成的层 状结构组成,氧化石墨结构与石墨大体相同,它的物理、化学和电化学性能也非 常优异,其层状结构能够通过超声处理在水中或有机溶剂中完全剥离形成胶状 悬浮液,并且价格更加便宜,日益受到人们的关注?。氧化石墨烯的研究历 史可以往后追溯几十年,主要研究石墨烯的化学性能【,】,它为准二维层状结 构,层间含有大量的羟基和羧基活性基团。干燥的层间距约为.~. 要大于石墨层间距. ,因此有利于插层反应的进行【销】。在年英国 化学家通过研究石墨鳞片阐述了石墨的结构并研究制备出氧化石墨烯。 目前制备氧化石墨烯的方法有法【、法【】和法【】 和电化学氧化法【,蚓。目前,氧化石墨烯包括以下三个步骤:首先形成石墨层 间化合物;其次,石墨层间化合物的氧化;最后,所得到的氧化物的水解。在 该过程中,采用石墨层间化合物膨胀石墨,不仅有效地缩短了制备的 反应时间,而且在相同的反应条件下,还可以大大提高其氧化程度。 ,是石墨烯重要的派生物【】,氧化石墨 氧化石墨烯 烯在二维空间无限延伸的基面上连有羧基、羟基、羰基等的官能团。氧化石墨 烯较石墨和膨胀石墨有更多的极性官能团和更大的层间距,较粘土有更大的离 子交换能力,故金属离子、极性小分子甚至高聚物都很容易嵌入到氧化石墨层 间形成以氧化石墨作宿主的纳米复合材料。 图一为氧化石墨烯结构的示意图。从图上可以看出,环氧基团和羟基主 要位于氧化石墨片层的上方和下方,羧基则主要位于片层的边缘位置,而芳香 环、双键和环氧基团使得碳原子点阵近乎处于同一个平面,与羟基基团相 连接的碳原子有较轻微的四面体构型畸变,官能团分布在碳环的上下,形成了 不同密度的氧原子。青岛科技大学研究生学位论文 图氧化石墨的结构模型图 ? . 氧化石墨 ,是结晶性高的石墨强力氧化后加水分解得到 的化合物,它的结构与石墨大体相同。从世纪年代到年代,科学家们 开始研究氧化石墨的结构层面,提出了多种研究模型,如模型、 模型、?模型、?模型等如图一】。虽然 中、、的含量随着其氧化程度的不同而有所不同,但一般认为,的 理想结构组成为。然而,其层间的水一般很难脱去,因此人们还是很难 得出它的确切结构。最近多年来,研究人员在继续致力于对氧化石墨结构研 究的同时,也开始了对氧化石墨的应用研究【。】。 氧化石墨烯和石墨烯的关系,就像功能化的碳纳米管和碳纳米管一样。它 与的关系,就像是单片层的堆积。虽然它们各自都有自己独特 的特点,但是在很多方面上性质又完全一致。理论上认为表面无任何含氧功 能 团的石墨烯是完美的石墨烯,然而氧化石墨和氧化石墨烯表面含有大量功能 性 基团,如。、.、一.、.等,这些功能性基团赋予氧化石墨烯一些 新的特性,如分散性、亲水性、与聚合物的兼容性等。但由于功能基团的接 入, 使层面内的二键断裂,因而失了传导电子的能力。极谱分析法在涎磷蛋白和 氧化石墨烯电化学检测中的应用 图氧化石墨的结构模型 . ..氧化石墨烯的合成 目前我们制备氧化石墨烯的方法有电化学法、热膨胀剥离法、超声剥离法、 化学氧化法。其中化学氧化方法是常用来制备氧化石墨烯。化学氧化方法制 备 氧化石墨烯。自年的法后,又出现了法、 法。法合成的氧化石墨,首先将天然微粉石墨用发烟硝酸处理,当石墨 被硝酸氧化时硝酸离子就会侵入到石墨片层之间,然后再加入对其进行 进一步的氧化,最后将反应生成产物投入到大量蒸馏水中,对其进行过滤,并 洗涤至中性为止,最后进行干燥得到氧化石墨;法合成氧化石墨是 用浓硫酸和发烟硝酸混合酸对石墨进行处理,同样以为氧化剂; 法则是将石墨粉和无水硝酸钠一起加入到冰浴的浓硫酸中,强力搅拌下加入 ,并用体积分数%还原剩余的高锰酸钾和二氧化锰,过滤、洗涤. 真空干燥得到氧化石墨烯。石墨氧化过程如图一所示。 青岛科技大学研究生学位论文 图石墨的表面氧化示意图...羧基功能化的氧化石墨烯的研究 氧化石墨烯片及其氧化石墨的表面都带有大量的亲水性官能团,这些官能 团都具有良好的表面活性和润湿性能,因而对有机阳离子如长链烷基胺离子 等 离子易于吸附,所以保持电中性,它是一种良好的生物材料,而且它可以在纯 水和弱碱性溶液中分散,并形成一种稳定的胶状悬浮液。在某些有机溶剂中, 它也能够长期稳定的分散在其中。氧化石墨上环氧基的化学稳定性较高,我们 通过,等研究表明,氧化石墨是呈准二维平面片层结构,片层的褶皱 是由于与羟基基团连接的碳原子有些扭曲形成四面体结构而导致的。由于在栅 格上下连接的官能团可以形成不同负价氧原子含量的片层,因为这种负价氧原 子层的分布可以防止对碳原子的亲核进攻,所以氧化石墨上环氧基具有较高的 化学稳定性。 一通过制备采用不同基团改性的氧化石墨衍生物并对其表征,证实了 氧化石墨官能团化的可行性。等】先后使用阳离子表面活性剂和烷 基胺实现了对氧化石墨的插层,并采用氯硅烷类,乙氧基硅烷类对氧化石墨进 行甲硅烷基化处理,成功实现了丁基胺插层氧化石墨的甲硅烷基化。此外, 等采用一系列苯基和烷基异氰酸醋对氧化石墨进行表面改性处 理,然后经超声处理后,在极性非质子溶剂中形成了能在数周内保持稳 定的胶状分散体系。而等【在等的工作基础上,利用带有双官 能团的,一二异氰酸甲苯对氧化石墨的锚定作用,成功合成了同时具备亲水和 亲油特性的两性氧化石墨烯。 氧化石墨烯的结构与石墨烯大体相同,只是在六角环形片状碳原子上连有 羧基、羟基、羰基、环氧基等官能团【一】。由于这些大量亲水性官能团附着在氧 化石墨烯片表面,因此具有一定的表面活性和润湿性能,所以它要比石墨烯在 水中的分散性好,并且聚合物的兼容性能也有所提高。为了发挥氧化石墨烯的 优良性质,如提高它的溶解性及在集体中的分散性等,必须对其进行有效的功极谱分析法在涎磷蛋白和氧化石墨烯电化学检测中的应用 能化【?卯。羧基改性的氧化石墨烯在功能化氧化石墨烯的制备中占有重要的地 位。羧基化氧化石墨烯用氯乙酸与氧化石墨烯在碱溶液中反应,以活化氧化石 墨烯表面的环氧基与羧基,使其转变成为羧基,从而制得羧基功能化的氧化石 墨烯【】。 羧基功能化氧化石墨烯?具有模拟酶的性质,在双氧水存在下能 催化氧化底物,,,一四甲基联苯胺,从而得到了蓝色的反应物,催化过 程如图.所示。动力学研究证明.比辣根过氧化物酶有更强的 催化活性.具有低价格、易获得、稳定的生物降解力和稳定性。由于 .具有这些优点,所以它应用在环境监测和药品诊断上【。 图. ?催化氧化的反应图 . ?? .本论文的基本思路和目的 正畸牙根吸收是正畸治疗的主要并发症,对牙根吸收的早期诊断、早期预 防是目前的研究热点。常规的影像学方法诊断方法对牙根吸收的诊断显著滞后 于实际牙根的不可逆病理性吸收,而且存在辐射损伤。也有的方法检测 龈沟液中牙本质蛋白含量变化间接诊断牙根吸收的报道,但是由于龈沟液样品 量少,待测液中的有效成分含量低,酶联板存在均一性和透光性的问题,限制 了光度测定的精密度和检测限,容易出现假阴性结果。电化学酶联免疫 分析法具有灵敏度高,检测范围宽,非常适用于少量样品的分析等优点,其原 理是将酶联免疫吸附检测同酶催化产物的电化学检测相结合,某些酶催化底物 反应产生的产物具有电活性,可以使用多种电分析化学方法进行测定。其卓越 优势使得快速、精确、稳定测定龈沟液中牙根吸收特异性蛋白含量变化成为可 能,为正畸牙根吸收的诊断开辟了一条更为有效、新颖的研究思路。 本论文建立多种伏安酶联免疫分析法对牙本质涎磷蛋白定量检测的 分析体系,以伏安分析为主要手段,结合酶免疫分析的基本方法,以辣根过氧 青岛科技大学研究生学位论文 化物酶为标记物,构建多个催化反应的体系,并应用于酶标记 抗原抗体的检测,并分别应用于实际生物样品中的定性定量检测,为牙根 吸收提供诊断依据,明确伏安酶联免疫分析法精确诊断正畸牙根吸收的可行 性 和必要性。 由于?具有低价格、易获得、稳定的生物降解力和稳定性、模拟 酶的性质,所以本论文建立了以羧基功能化氧化石墨烯.来替代辣根 过氧化物酶;来催化氧化, ,,’一四甲基联苯胺。将此方法应用在 新鲜牛奶中的检测并与其它的电化学传感器检测:的方法进 行了比较,为性能开发与应用拓展奠定了基础。极谱分析法在涎磷蛋白和氧 化石墨烯电化学检测中的应用 参考文献.., .., .,., ? 【】 ,..,,: ., ., 【 .,., ? ,.., ,: .., .., .., 【】 .., ? .., ,:.., .., ..,.,? 【】 ? , , ,.. .,,: 【】 ., .., .,?? ,. .,,: .., 【】 .., ..,., ?? : ,. .,, 】 ., ., .,? ..,?,...,,: 【】 ., .., ..,., ,...,,:【】 ., .., .., ., .., , : ....,, .., 【】 ,..,,,: ., 【 .., ..,.,? , , ,: 青岛科技大学研究生学位论文 【】 .., ., .,,.., , .. 【】 ., ., .., , .,,:~ 【】 .., .., ..,.., , ....,,:【】 .., ., ., .., .., / ,. : .., ,【 .., ., ., 】一一 ? ,,, : ., 【】 .., ..,一 ?, ,:~ 【 ., .,】 ., .., 叶? ? /?? :,..,, 】 ., ., .,., ? :? ,,, 【】范瑾瑾,愈纯山,电化学免疫传感器测定?反应.国外医学临床生物化学与 检 验学分册,,: 【 】 ..,..,,.., ,: ., .. 【】 ., ? : ., , 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