金鱼草下胚轴不同部位切段形态发生能力的研究

金鱼草下胚轴不同部位切段形态发生能力的研究 Ξ 金鱼草下胚轴不同部位切段形态发生能力的研究 姜维梅 梁海曼 钟华鑫 ( )杭州大学生命科学学院 , 杭州 310012 ( ) 摘要 金鱼草 A ntirrhi num m ajus L . 下胚轴不同部位切段的形态发生能力有很大差异 。在外 源添加 BA , NAA 的情况下 , 金鱼草下胚轴近基部切段培养物的芽 、根发生明显高于其上各部 位切段 , 以近基部切段为外植体培养时 , 其形态发生能力以 BA 和 NAA 配合为好 , 最适剂量 为 BA 110mg/ L + NAA 0115mg/ L 。 关键词 金鱼草 , 胚轴切段 , 不定芽 , 根的发生 分类号 Q 945 Study on Morphogenetic Response in Hypocotyl Segments of Anti r r hi n um maj us J IANG Wei - Mei L IANG Hai - Man ZHONG Hua - Xin ( )College of Life Science , Hangzhou University , Hangzhou 310012 Abstract A ntirrhi num m ajus seedlings hypocotyls , 20 mm in length , cut into three segments , which were cultured on MS medium and MS medium added with BA and NAA. The results indicated that adventi2 tious buds and roots formation were higher in the basal hypocotyl segments than in the two upper hypocotyl segments. When the basal hypocotyl segments were cultured on the medium with different concentration of BA and NAA , the result was that the morphogenetic response was much better with BA and NAA supple2 mented. The most optimum concentration was BA 110mg/ L + NAA 0115mg/ L . Key words A ntirrhi num m ajus , Hypocotyl segments , Adventitious buds , Roots formation ( ) 金鱼草 A nti rrhi num m ajus L . 又名龙口花 、龙头花 , 是一种重要的观赏花卉植物 。 由于在金鱼草中存在大量的突变体 , 在植物发育分子生物学研究方面也是一个重要 。 () 目前已从金鱼草突变体中克隆了与花分化有关的多个基因 Luo et al , 1996。对于这些 基因需要有合适可靠的基因转化受体 。因此 , 无论从快繁或从建立良好受体系统角度 , 都 有需要准确细致地掌握金鱼草外植体再生植株的组织培养技术 。 一般来说 , 幼苗的下胚轴是常被用作研究植株再生能力比较好的外植体 。金鱼草组织 (培养试验也颇多以胚轴切段作为外植体 沈洁明等 , 1990 ; Harte et al , 1991 ; Holford et al () ) , 1992 ; 余迪求等 , 1996。Okubo 等 1991还首次过胚轴不同部位切段芽根再生能 系统的外源细胞分裂素和外源生长素最适浓度以及外源细胞分裂素和生长素相配合影响胚 轴不同部位切段芽 、根再生的试验 , 而这一点对于准确掌握金鱼草组培再生技术是必要 的 。因此 , 本文进一步进行金鱼草下胚轴不同部位切段的培养试验 , 以更好地确定金鱼草 下胚轴不同部位切段器官分化能力及与其内源激素水平间的关系 。 1 材料与方法 111 实验材料 金鱼草种子由英国 John Innes 研究所罗达博士赠送 。 112 材料处理与培养 种子用 70 %酒精浸泡 2 min , 用含 10 %次氯酸钠的 015 %SDS 灭菌 5 min , 再用无菌水 冲洗 4,5 次后 , 接种在 MS 基本培养基 + 3 %蔗糖 + 018 %琼脂的固体培养基上 。培养温度 20 ?1 ?, 每天光照 14 h , 光照强度 1 600 lx , 以准备无菌苗 。 (( )将萌发 15,20 d 的无菌苗 苗高约 20 mm 的下胚轴切成上 、中 、下三段 图 1 , 每 () ) 段长约 5,7 mm作为外植体 , 分别接种到附加有不同浓度植物激素 NAA , BA的培养 基上进行分化培养 。温度 25 ?1 ?, 连续光照 , 光强 2 500 lx 。 所有试验均在培养后 14 d 、40 d 分别统计其不定 芽与不定根的发生率 , 每一处理取 20 个切段 。本文 实验重复 2 次 , 实验结果基本一致 , 中所列数字为 两次实验的平均值 。 2 结果与分析 211 下胚轴不同部位切段的培养反应性 金鱼草下胚轴不同部位的培养反应有很大差异 () 表 1。 接种 在 不 附 加 任 何 激 素 的 MS 基 本 培 养 基 上 () 3 %蔗糖 + 018 %琼脂, 培养 10 d 可以看到在下胚轴 ( 图 1 金鱼草下胚轴不同部位切段示意图 参 )考 Okubo et al , 1991 的上 、中 、下三部位的切段的两端切口处有少量绿色 Fig11 Schematic drawing of A. majus hypocotyl 愈伤组织产生 。上中部切段看不到不定芽的发生 , 而 ( different sections reference to Okubo et 下部 切 段 的 一 端 可 见 有 不 定 芽 发 生 , 发 生 频 率 为 )al , 1991 45 % 。第 14 d 后 , 上中部切段仍无不定芽发生 , 而 下部切段上的不定芽已开始伸长 , 叶片开始展开 , 不定芽发生频率已高达 70 % 。生长 40 d 后 , 上中部切段均已褐化死亡 , 而下部切段则已抽枝 , 并在枝的基部形成不定根 , 成为 再生苗 , 但苗比较细弱 , 叶片颜色偏黄绿 。表明金鱼草幼苗的胚轴只有下部切段具有形态 发生能力 。 在附加 NAA 011 mg/ L 的培养基上 , 下胚轴上 、中 、下切段切口处均有愈伤组织发生 。 其中上中部切段的愈伤组织较大 , 而下部切段的愈伤组织较小 。生长 10 d 后 , 上部切段 其发根率为 8015 % , 根呈白色纤毛状 , 无不定芽发生 。中部切段发根率为 85 % , 根较粗 , 横向长出 , 也无不定芽发生 。下部切段根的发生率为 9415 % , 根细长 , 与上中部切段不 同的是下部切段已开始有芽的分化 , 分化频率为 4815 % 。生长 40 d 后 , 上部切段 100 %形 成根 , 有少量芽分化 , 仅 15 %成枝 , 枝弱 , 矮小 ; 中部切段 100 %形成根 , 分化枝的频率 也仅为 15 % , 枝矮小 ; 下部切段 100 %形成根 , 8715 %能形成枝 , 幼枝叶色较绿 , 苗高 , 但长势稍弱 。NAA 添加后的胚轴上 、中段不定枝发生率虽然还不高 , 但联系到不定根发 生率的大辐度上升可以认为上 、中部切段在无激素培养下不能形成不定根和不定枝的原因 之一是由于内源生长素含量不足 。 在附加 BA 110 mg/ L 的培养基上 , 下胚轴不同部位切段的表现也有很大区别 。外植体 切口处均形成愈伤组织 , 但每一切段通常可见一端愈伤组织较大 , 呈绿色 , 另一端愈伤组 织则较小 。培养 10 d 左右 , 在愈伤组织与未愈伤化的外植体交界处以及切段中部产生一 些不定芽 , 不定芽的发生在胚轴上 、中 、下不同部位的区别如下 : 上部切段不定芽发生频 率为 515 % , 中部切段为 1814 % , 下部切段为 7615 % , 可以看出在添加 BA 时下部切段不 定芽发生频率仍显著较高 。培养 40 d 后 , 上部切段上已分化的芽没能进一步发育 , 培养 物也无根的分化 , 愈伤组织则褐化死亡 。中部切段已分化的芽在进一步发育过程中 , 有的 死亡 , 有的不发育 , 导致芽的分化率降至 1318 % , 有根的分化但仅达到 515 % , 其余愈伤 组织也 褐 化 死 亡 。下 部 切 段 再 生 枝 的 频 率 为 7315 % , 比 14d 时 的 不 定 芽 的 分 化 率 () 7615 %略低 , 说明随着培养时间的延长 , 个别早期已分化的芽没能进一步发育 , 甚至 死亡 。生根率为 5516 % , 长成的幼苗颜色较绿 , 长势稍弱 。与无激素及添加 NAA 的相比 , 添加 BA 后 , 上 、中部切段能形成芽 , 中部还能形成根 , 表明中部切段的内源细胞分裂素 也有所不足 。 在附加 BA 110 mg/ L + NAA 011mg/ L 的培养基上 , 金鱼草下胚轴上 、中 、下不同部位切段的不定芽发生明显好于单独供给 NAA 或 BA 的 。不论是哪一种切段 , 在切口处均有愈 伤组织发生 , 其中一端为较大的绿色愈伤组织 , 另一端为较小的黄白色愈伤组织 。培养 10 d 左右 , 在外植体的愈伤组织处以及外植体上部均产生出不定芽 。其中上部切段不定芽 发生频率为 35 % , 中部切段为 55 % , 下部切段的不定芽发生率则达 90 % , 并且再生芽的 叶片已经开始展开 。生长 40 d 后 , 上部切段发根率为 7718 % , 成枝率为 100 % , 幼枝叶色 绿 , 长势强 。中部切段发根率为 85 % , 成枝率为 100 % , 幼枝叶色绿 , 长势也强 。下部切 段发根率为 100 % , 成枝率 100 % , 幼苗叶色浓绿 , 长势也最强 。 以上结果表明 : a . BA 对下胚轴中 、上部切段形成不定芽有促进作用 。b. 随培养时 间的延长 , 添加 NAA 也有促进下胚轴切段不定芽发生的效果 。c . NAA 对 BA 促进不定芽 形成起增效作用 。d. 在外源供应生长素和细胞分裂素的条件下 , 金鱼草胚轴的上 、中 、 下部切段均具有形态发生能力 。但上 、中 、下部切段培养物的形态发生进程和不定枝 、不 定根的生长表现还是有区别的 。这提示沿着胚轴纵轴的生理差异不仅仅限于内源生长素和 细胞分裂素含量水平的差异 。 ( ) 表 1 金鱼草下胚轴不同部位切段的芽 枝与根的分化情况 ( ) Table 1 Differentiation of adventitious buds shootsand roots on different segments of A . majus hypocotyl ( ) ( )( )不定芽 枝发生 % 不定根发生 % 培养天数 培养基 ( ) ( ) ( ) Adventitious buds shootsformation %Adventitious roots formation % 上 中 下 上 中 下 ( )()Days cultured d Mediummg/ L upper middle lower upper middle lower MS - - 70 - - - 94 . 5 MS + NAA011 - - 48 . 5 80 . 5 8. 5 14 - MS + BA110 15 1814 76 . 5 - - 5- 35 55 90 - - MS + BA110 + NAA011 MS n n 60 n n 58. 7 MS + NAA011 15 15 87 . 5 100 100 100 40 MS + BA110 n n 13 . 8 73 . 5 5 . 5 55 . 6 MS + BA1 + NAA011 100 100 100 77 . 8 85 100 注 : - 表示没有形态发生 ; n 表示外植体死亡 Note : - denote no morphogenetic response ; n : denote explants necrosis 212 不同浓度的 BA 与 NAA 对金鱼草下胚轴近基切段器官发生的影响 为进一步了解 BA 和 NAA 促进金鱼草下胚轴近基部切段培养物器官发生的最适浓度而 进行了本实验 , 结果见表 2 。 ( ) 表 2 金鱼草下胚轴近基切段在不同浓度 BA 与 NAA 培养基上的芽 、根分化情况 培养 14d Table 2 Differentiation of adventitious buds and roots in the basal segments of A . majus on the medium supplemented ()with different concentration of BA and NAA. 14 days cultured 不定芽发生 芽数目/ 切段 苗高度 根发率 根数目/ 切段 根长 培养基 Adventitious buds No . of buds Height of Roots for No . of roots Length of ()Mediummg/ L ( ) () ( ) () formation %per section shoot mmmation %per Section root mm MS 70 2 . 8 4 . 7 - - - BA0 . 1 75 3 . 0 7 . 3 - - - 84 . 2 3 . 4 7 . 8 - - - BA0 . 5 BA1 . 0 94 . 7 3 . 5 7 . 7 - - - 90 3 . 6 7 . 2 - - - BA1 . 5 NAA0. 05 50 2 . 7 2 . 5 90 2 . 3 6. 1 NAA0. 1 56 . 5 2 . 3 4 . 3 91 . 2 3 . 3 8. 9 73 . 6 2 . 5 4 . 2 100 3 . 7 9. 1 NAA0. 15 NAA0 . 2 45 2 . 4 3 . 4 90 2 . 4 9 . 2 注 : - 表示无形态发生 Note : - denote no morphogenetic response 由表 2 可以看出 : BA 促进不定芽发生的最适浓度为 110 mg/ L , 不仅提高了不定芽发 生的百分率 , 而且每个切段的成芽数和不定芽生长也明显有所促进 。NAA 在浓度为 0115 mg/ L 时 , 不定芽的发生与对照持平 , 同时根的发生也有良好表现 。这与表 1 培养 14 d 所 示的实验结果不同 , 看来是表 1 实验中 NAA 没有处于最适浓度所致 。适当提高 BA 的浓 () 度 , 可以增加不定芽的发生 , 但对不定根发生不利 表 2。在培养基中只添加少量 NAA , (可以既能促进外植体长根又不影响不定芽发生 , 但是不定芽的数目较少 , 长势也较弱 表 ) 2。因此要获得壮苗 , 还必须探讨细胞分裂素与生长素之间的适宜配比问题 。 根据表 1 、表 2 的实验结果 , 本文中附加 BA 110 mg/ L 和 NAA 011 mg/ L 培养基 , 既能 得到壮苗 , 同时稍迟又能从苗的基部发出根来 。因此 , 培养金鱼草胚轴切段再生植株时 , 以同时添加 BA 和 NAA 为好 , 适宜剂量为 BA 110 mg/ L , NAA 升高至 0115 mg/ L 可能会比 011 mg/ L 更好 。 3 讨论 本文表 1 培养 14 d 的实验结果表明 : 金鱼草下胚轴近基切段培养物在无激素培养条 () 件下有较高的不定芽发生率而无不定根的发生 。这一结果与 Okubo 等 1991的文章中近基切段不定芽发生率高是由于近基切段内源细胞分裂水平高而 IAA 水平低的判断相一致 。 添加 NAA 011 mg/ L 使不定芽发生明显下降 , 而 BA 110 mg/ L 和 NAA 011 mg/ L 的同时添加 又可进一步提高不定芽发生率的添加实验结果也可作为上述判断的旁证 。但是本文表 1 培 养 40 d 的结果显示 NAA 011 mg/ L 的 添 加 也 有 可 能 促 进 不 定 芽 的 发 生 。BA 110 mg/ L + NAA011 mg/ L 更使下胚轴基部切段的不定芽发生达 100 % 。表 2 中显示 BA 110 mg/ L 的添加可以明显促进不定芽发生而 NAA 0115 mg/ L 的添加又基本上不影响不定芽的发生和生 长 。这些结果提示 : 在探讨金鱼草下胚轴近基部切段不定芽发生率高的原因时 , 不能简单 归诸于内源细胞分裂素和生长素的含量水平 。在分析内源激素含量水平的基础上进行外源 添加的反馈试验将有助于对事物的认识更明确更深入 。 参 考 文 献 () 沈洁明 , 孙君亮 , 杨维东等 , 1990 . 金鱼草的组织培养. 植物生理学通讯 , 26 1: 51 () 余迪求 , 邓庆丽 , 沈亚楠等 , 1996 . 金鱼草下胚轴组织培养的研究. 园艺学报 , 23 1: 99,100 Harte C , Lennartz G , Schwenzer - Rodrigues N , 1991 . 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