eb病毒转化b淋巴母细胞在汉滩病毒ctl表位研究中的应用

eb病毒转化b淋巴母细胞在汉滩病毒ctl位研究中的应用 EB病毒转化B淋巴母细胞在汉滩病毒CTL表位研究中的应用 作者:王美亮, 张全华, 王九平, 李永明, 马樱, 金伯泉 【摘要】 目的: 建立EB病毒转化B淋巴母细胞系,BLCL,, 作为抗原提呈细胞(APC) 提呈抗原肽, 刺激短期培养的特异性T细胞活化并分泌IFN, 从而应用于T细胞表位鉴定中。方法: 用B958细胞培养上清中的EB病毒转化肾综合征出血热,HFRS,患者PBMC, 建立HFRS患者的BLCL, 以自身BLCL为APC, 加载抗原肽后, 刺激短期培养的G9L特异的HFRS患者CD8+ T细胞系, 应用ELISPOT测定CD8+ T细胞受到抗原肽刺激后产生IFN 结果: 加载过抗原肽G9L或V15R的BLCL可刺激G9L特异的CD8+ T细胞活化并产生IFN, 而与G9L无同源序列的I15P则不能刺激G9L特异的CD8+ T细胞活化。结论: BLCL可作为非专职APC有效地将抗原肽提呈给特异性T细胞。 【关键词】 B淋巴母细胞; EB病毒转化; 抗原提呈细胞; CTL表位 ,Abstract, AIM: To establish EpsteinBarr virus (EBV) transformed B lymphoblastic cell lines (BLCL) to present peptides as antigenpresenting cells (APC) and stimulate shortcultured T cells secreting IFN, by which the T cell epitopes are identified. METHODS: PBMCs from patients with hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) were transformed using EBV from supernatant of B958 cells. ELISPOT assay was then employed to evaluate the IFN production of short cultured G9Lspecific CD8+ T cells stimulated with peptide pulsed autologous BLCL cells. RESULTS: BLCL pulsed with G9L or G9Lnested V15R can stimulate G9Lspecific CD8+ T cells producing IFN, but not BLCL pulsed with non homologous I15P. CONCLUSION: BLCL can efficiently and specifically present peptides to peptidespecific T cells as nonprofessional APC. ,Keywords,B lymphoblastic cell line; EpsteinBarr virustransformed; Antigenpresenting cell; CTL epitope 抗原提呈细胞,APC,是一群能够摄取、 加工、 处理抗原, 并 将抗原肽提呈给抗原特异性T细胞的细胞。APC包括树突状细胞、 单 核噬细胞和B细胞等。其中, 树突状细胞具有很强的抗原提呈能 力, 可在体内和体外刺激初始T细胞活化。但由于采集患者的外周血 比较困难, 而树突状细胞的分离培养则需要不断地采集血液, 在实 际应用中有局限性。鉴于B细胞受到EB病毒感染后, 具有克隆扩增的特点, 可建立永生化的BLCL。BLCL在经过EB病毒的转化后, 依然保持了B细胞的分化状态和免疫表型,1,。对其进行HLA基因分型后, 即可源源不断地应用于后续的研究中。本研究中建立了肾综合征出血热 (HFRS) 患者的B淋巴母细胞系, 并以此作为APC, 提呈抗原肽给自身的CD8+ T细胞, 应用ELISPOT测定了活化T细胞产生的细胞因子。 1 和方法 1.1 材料 HFRS患者35例为第四军医大学唐都医院2002/2004住院患者。HTNV特异性IgM抗体均为阳性。IFN ELISPOT试剂盒购自Mabtech公司; BCIP/NBT 购自Sigma公司; 96孔PVDF滤膜板,MAIPN45,购自Millipore公司; ELISPOT读数仪, 购自北京赛智公司; RPMI1640购自Sigma公司; 小牛血清,FCS,购自杭州四季青生物工程材料公司; EB病毒高产株B958由本室冻存; FITC羊抗鼠IgG为Sigma产品; PECD19及其同型对照购自BD公司; HLA DR mAb为ATCC产品。可刺激1例HFRS患者CD8+ T细胞产生IFN 9肽G9L,GPATNRDYL,、 15肽V15R,VSLLGGPATNRDYLR,和I15P,ITPGRYRTAVCGLYP,,将另文发表,, 购自西安联美生物公司, 经RPHPLC测定, 纯度在80%以上。 1.2 方法 1.2.1 EBV转化 用Ficoll分离HFRS患者外周血单个核细胞,PBMC,, 调整细胞密度为5×108/L, 加入等体积B958,EBV高产株,培养上清, 培养3，4周,2, 3,, 每周补加0.5 mL含200 mL/L FCS的RPMI1640培养液, 形态观察转化成功后, 用CD19和HLADR mAb染色鉴定其表型。 1.2.2 BLCL的表型鉴定 ?膜表面CD19的表达: 采用直接免疫荧光染色法。调整细胞密度为4×109/L, 取50 μL细胞悬液, 用正常羊血清封闭后, 加入PECD19, 对照组加入PEIgG1, 4?孵育30 min, 洗涤、 固定后, 流式细胞术,FCM,分析。?膜表面HLADR的表达: 采用间接免疫荧光染色法。2×105 BLCL细胞经封闭后, 加入HLADR mAb, 对照组加入抗SED mAb, 4?孵育30 min, 洗涤后加入FITC标记羊抗鼠IgG, 4?孵育30 min, 洗涤, 固定, FCM分析。 1.2.3 抗原肽G9L特异性T细胞系的建立 用免疫磁珠分离HFRS患者PBMC中的CD8+ T细胞。取部份CD8+ T细胞, 用PECD8 mAb或同型对照染色30 min后, FCM分析其纯度, 保证使其细胞纯度达到95%以上。CD8PBMC与抗原肽G9L (终浓度为10 μmol/L) 孵育过夜, 照射,30Gy,后, 加入磁珠分离的CD8+ T细胞, 第2天加 入rhIL2 (终浓度为 5×104 U/L), 每3 d半量换液1次, 10 d后以加载过抗原肽的自身BLCL为APC, 用ELISPOT检测其抗原特异性,4,。 1.2.4 ELISPOT 在 4 mg/L鼠抗人IFN mAb (1D1K)包被过的96孔PVDF滤膜板中, 加入抗原肽,终浓度为 5 μmol/L,刺激过夜的BLCL,5×104 /孔,和CD8+ T细胞,2×104/孔,, 37?孵育14，18 h。洗涤后与生物素化鼠抗人IFN mAb (7B61Biotin), 37?孵育3 h, 洗板后再与ALP 育1 h, 用BCIP/NBT室温显色至斑点出现,4,。自来水冲洗, 晾干后, 用ELISPOT读数仪计数。 2 结果 2.1 EBV转化B淋巴母细胞的建立 转化3 d左右, 视野中可见个别细胞的胞体变大, 但也有一些细胞开始死亡。转化5，7 d左右, 视野中可见由少数几个细胞组成的小克隆。转化24 d左右, 视野中可见大小不等的细胞团, 细胞明显增大,图1,。转化最快者第3天可有小克隆, 18 d内即可建株。BLCL建立后, 用鼠抗人CD19 mAb和HLADR mAb染色表明, BLCL可高表达CD19和HLADR, 其为B细胞系(图2)。对35例患者的PBMC进行了EB病毒转化, 建立了BLCL细胞系。并提取基因组DNA, 委托公司对其HLA基因型 进行分型。 2.2 CD8+ T细胞的免疫荧光染色和FCM分析 FCM结果显示, 用Dynal磁珠分离的CD8+ T细胞的纯度均在95%以上,图3,, 分离得到的CD8+ T细胞占PBMC总数的7%，22%。 2.3 抗原肽特异性T细胞系的短期培养 在细胞因子存在的情况下, 免疫磁珠分离的CD8+ T细胞与加载了抗原肽的APC共同培养。6 d后可见反应孔内大部分细胞已死亡, 而部分细胞则发生了克隆扩增, 即为抗原肽特异的CD8+ T细胞系。第10天即可进行抗原特异性测定。 图1 EB病毒转化第10天(A)和第24天(B) 的B淋巴母细胞系,略, Fig 1 EBV transformed BLCL at 10 d (A) and 24 d (B) after EBV transformation (×200) 图2 BLCL上HLADR和CD19的表达,略, Fig 2 The expression of HLADR and CD19 molecules on BLCL 图3 磁珠分离的CD8+ T细胞的FCM分析,略, Fig 3 FCM analysis of CD8+ T cells isolated using Dynabeads 2.4 BLCL提呈抗原肽的特异性 ELISPOT试验显示G9L和包含有G9L序列的15肽V15R可被BLCL有效提呈给9肽G9L特异的CD8+ T细胞, 并使之活化产生IFN, 而与G9L序列无同源性的I15P则不能被提呈给非特异的CD8+ T细胞,图4,。 图4 BLCL可提呈抗原肽并刺激特异性CD8+ T细胞产生IFN Fig 4 BLCL can present peptides and stimulate the peptidespecific CD8+ T cells producing IFN 3 讨论 B细胞通过其B细胞受体,BCR,结合抗原决定簇, 经受体介导的内吞作用, 摄取并加工抗原, 将抗原肽MHC分子复合物, 表达在B细胞表面, 提呈给特异性T细胞。B细胞经EB病毒转化而建 立的BLCL保持了B细胞提呈抗原的能力, 可作为APC应用于T细胞免疫应答的研究中。尤其是在T细胞表位的鉴定工作中, 需要通过对一系列HLA等位基因部分相配的APC提呈抗原肽的能力进行比较, 才能最终确定该表位的HLA限制性, 用HLA基因型已知的BLCL作为APC, 就具有显而易见的可操作性。为此, 我们建立了35株BLCL, 并对其进行了HLA基因分型。这些BLCL不仅可应用于HTNV特异的CTL表位的鉴定中, 还可以在其他病毒甚至肿瘤的T细胞免疫应答研究中作为APC提呈抗原肽并刺激T细胞产生特异性反应。在建立BLCL的过程中, 我们还发现经冻存复苏的PBMC, 其EB病毒转化的成功率明显地高于新鲜分离的PBMC。 在T细胞免疫应答的研究中, 应用有限稀释法建立T细胞克隆是一个常用的方法。在有限稀释法中, 特异性T细胞的检出取决于其在外周血中的频率、 体外扩增的潜力以及溶解靶细胞的能力等, 因此应用有限稀释法不能检出所有的T细胞克隆。除此之外, T细胞克隆的建立还是一个耗时费力工作量非常大的过程。T细胞要经抗原肽2次甚至3次刺激后获得, 实验周期长。我们应用免疫磁珠分离PBMC中的CD8+ T细胞, 在抗原肽和细胞因子的作用下, 7，14 d即可获得抗原特异的CD8+ T细胞系。且由于该方法不同于往常常用的方法, 仅经1次抗原肽的刺激而成, 可避免产生再次应答的非特异性。 鉴于BLCL能够提呈抗原肽的特点, 在早期的T细胞功能研 究中, BLCL常常作为靶细胞应用于51Cr杀伤试验,5,。随着胞 内细胞因子染色技术在T细胞功能研究中的兴起, BLCL又被作为 APC, 刺激抗原肽特异的T细胞分泌胞内细胞因子,6,。近年来, ELISPOT作为一种能够在单个细胞水平上测定T细胞功能的实验技术, 被广泛地应用于T细胞研究领域。但在用BLCL作为APC提呈抗原 肽时, ELISPOT的高本底一直是一个非常关键的问题。在实验中需适 当地控制BLCL的细胞数, 并尽可能保证细胞处于对数生长期。在 建立短期培养的CD8+ T细胞系时, 保证磁珠分离CD8+ T细胞的纯度 在95%以上, 也可有效地降低ELISPOT的本底。 【参考文献】 ,1, Ring CJ. 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