脓毒症治疗的新希望 干细胞疗法（可编辑）

脓毒症治疗的新希望 干细胞疗法（可编辑） 中南大学学报(医学版) 2013, 387 ////0>. ////. J Cent South Univ Med Sci 754 ?REVIEW? ?综 述? DOI:10.3969/j.issn.1672-7347.2013.07.017 ////. 脓毒症治疗的新希望:干细胞疗法 赵尚平,杨明施 中南大学湘雅三医院急危重症中心,长沙 410013 [摘要] 脓毒症 sepsis 是指由感染引起的全身炎症反应综合征,是临床危重患者的主要死亡原因之一。严重的 免疫系统功能紊乱是脓毒症患者的共同病理生理学改变。间充质干细胞(menchymal stem cells,MSCs 具有良好的免 疫调节作用,可增加抗炎因子 IL-10 水平、促进前列腺素 E PGE 、吲哚胺 2,3 双加氧酶 IDO 等细胞因子的分泌, 2 2 调节单核巨噬细胞、T 细胞、B 细胞、NK 细胞等免疫细胞的增殖、分化和功能,可能为脓毒症的治疗提供新的思路 与方法。 [ 关键词 ]间充质干细胞; 脓毒症;炎症因子;多器官功能障碍; 免疫调节 New treatment for sepsis: stem cell therapy ZHAO Shangping, YANG Mingshi Critical Medicine Center, Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410013, ChinaABSTRACT Sepsis is the systemic inflammatory response to infection and a major cause of mortality in critical patients. The severe disorder of immune system is the common pathophysiological changes in septic patients. Mesenchymal stem cells MSCs have shown great immunoloregulation properties in recent studies. It can increase the level of IL-10, an anti-inflammatory cytokine, promote the secretion of prostaglandin E PGE , indolamine 2,3-dioxygenase IDO, and regulate the 2 2 proliferation, differentiation and function of the immune cells such as mononuclear macrophage, t-lymphocytes, natural killer cells and so on. MSCs may provide new ideas for the treatment of sepsis. KEY WORDS mesenchymal stem cell; sepsis; inflammatory factor; multiple organ dysfunction; immune regulation Date of reception 收稿日期 :2012-07-29 Biography 作者简介 : 赵尚平,硕士研究生,主要从事间充质干细胞对脓毒 症全身炎症反应调节机制的研究。 Corresponding author 通信作者 :杨明施,Email: xyyms2004@163 Foundation item 基金项目 :湖南省科技计划项目2012FJ4313。This work was supported by Science and Technology Program from Hunan Science and Technology Burea, P. R. China 2012FJ4313.755 脓毒症治疗的新希望:干细胞疗法 赵尚平,等 脓毒症sepsis是指由感染引起的全身炎症反 作用的IL -10来 源于脓毒症小鼠,而非MSCs。进一 [7] 应综合征,是严重创烧、战伤、休克、感染、外 步的研究 发 现:MSCs能促进小鼠体内单核/巨噬 科大手术患者常见的并发症,进一步发展可导致 细胞分泌IL -10。 脓毒性休克、多器官功能障碍综合征 MODS,是 I L -10 可由 Th 2 细胞、部分调节性 T 细胞 临床危重患者的最主要死亡原因之一。它来势凶 Tregs、单核细胞、巨噬细胞分泌,它不仅能抑制 猛、病情进展迅速、预后险恶,给临床救治工作 Th1细胞应答及合成细胞因子,抑制巨噬细胞的抗 带来极大困难。脓毒症致患者死亡的根本原因是 原提呈功能及细胞因子合成如IL-2,TNF?α,IL-12 [8-9] 由严重感染引起的全身非可控性炎症反应造成多 和IFN-γ,还能下调MHC-I的表达 。有研究显示 [10] 器官功能障碍。目前包括活化蛋白C在内的多种治 IL-10可以抑制中性粒细胞的滚动 和经内皮细胞迁 [11] 疗药物及手段,经过循证医学检验均提示无明显 移到组织中 。IL -10可以将中性粒细胞集中在循 疗效,脓毒症的治疗陷入举步维艰的境况,死亡 环系统中,利于血液中细菌的清除,同时也能减轻 [12] 率居高不下。随着干细胞研究的深入,De Miguel 中性粒细胞在组织中清除细菌时造成的氧化损伤 [1] 等 研究发现间充质干细胞menchymal stem cells, 图1。 MSCs除具有很强的自我更新能力及多向分化潜能 1.2 MSCs 释放 PGE 发挥抗炎作用 外,还可影响免疫细胞的增殖、分化和免疫分子 2 在炎性细胞因子TNF-α和IFN-γ诱导下MSCs可 分泌及功能,具有良好的免疫调节作用和强大的 分泌PGE , MSCs与刀豆蛋白A共同培养时也能分 抗炎特性,有可能让脓毒症患者的炎症与抗炎症 2 [13] 泌大量PGE 。PGE 对很多组织和免疫系统都有 系统重新恢复平衡,给脓毒症的治疗带来新的 2 2 影响,其中T细胞、树突状细胞D Cs和巨噬细胞 希望。 [14] 受PGE 的影响最为明显。研究 认为PGE 可通过 2 2 抑制细胞内钙的释放、p59蛋白质酪氨酸激酶的活 1 MSCs对脓毒症模型中各种细胞因子的调节 性而直接影响T淋巴细胞的增殖和分泌功能如IL - [2] 12,TNF-α等,从而进一步影响免疫系统功能图 研究 表明MSCs可通过细胞接触依赖机制和 2。PGE 刺激的EP2和EP4PGE 受体的亚型可以 非细胞接触依赖机制发挥免疫抑制作用。Nemeth 2 2 [3] 促进单核细胞衍生的DCs的成熟,EP2和EP4激活 等 认为 M S Cs可调节血液中炎症 /抗炎因子的水 [15] [16] 后可上调酵母多糖诱导产生IL -10 。Hata等 进 平,从而改善局部和全身炎症反应,提高脓毒症 一步研究发现EP2和EP4必须同时存在才可诱导产 小鼠的生存率。这不仅存在于脓毒症模型中,在 生IL -10,EP2或EP4缺乏均会影响到IL -10的产生, MSCs治疗大鼠急性重症胰腺炎的实验中也有同样 [4] 其机制尚不清楚。 的发现 。MSCs通过分泌各种生物活化因子改变 各种免疫细胞的分泌表型,下调微环境中炎症因 1.3 MSCs 诱导 IDO 的表达 子,引导MSCs归巢和迁移等调节免疫反应。MSCs IDO在MSCs改善脓毒症模型生存率的机制中 可分泌或促进免疫细胞分泌多种抗炎因子,其中 也起重要作用。在通常情况下,人类MSCs并不产 IL -10、前列腺素E PGE 和吲哚胺2,3双加氧酶 2 2 [5-6] 生IDO,但体外实验表明在特定条件诱导下MSCs IDO在脓毒症治疗中发挥了重要作用 。 [17] 表达 ID O增加 。 ID O是色氨酸分子中吡咯环氧 化裂解、沿犬尿氨酸途径分解代谢的限速酶,可 1.1 MSCs 增加抗炎因子 IL-10 水平 [3] 通过降解色氨酸抑制T细胞和NK细胞的增殖,促 Nemeth等 利用小鼠CLP脓毒症动物模型研 [18] [19] [20] 进免疫耐受 。研究表明IDO在Tregs 和DCs 究发现,在脓毒症小鼠模型建立后1 h注入MSCs可 的成熟中发挥重要作用。 T细胞对色氨酸的降解 明显提高小鼠24,48,72,96 h存活率,降低血浆 极其敏感,在缺乏色氨酸的条件下 T细胞停滞于 中TNF-α,IL -1,IFN-γ等促炎因子的水平,增加 G 中期。MSCs产生IDO1的可能机制是:LPS刺激 IL -10等抗炎因子的水平;但用IL -10基因缺陷的小 1 MSCs激活了依赖于蛋白激酶PKR的干扰素调节 鼠,预先注射IL -10抗体或IL -10抗体受体的小鼠重 因子 3I R F-3,诱导I FN-β的转录表达, I FN-β导 复上述试验时,MSCs的有利作用均消失了;提示 [5] 致STAT1磷酸化,最终启动IDO1的转录表达 图 IL -10在MSCs治疗脓毒症小鼠的作用机制中占有重 [21] 3。研究 表明给予色氨酸不能恢复 T细胞的增 要的作用。然而在使用IL -10基因敲除的MSCs治疗 殖,而色氨酸代谢产物犬尿氨酸阻滞剂却能逆转 脓毒症小鼠时,MSCs仍具有治疗作用,提示发挥756 , 2013, 387 ////. ////. 中南大学学报 医学版 [2] 混合淋巴细胞反应中MSCs的免疫抑制作用 。这 提示IDO诱导免疫抑制可能依赖于色氨酸降解下游 [22] 代谢产物 。 图3MSCs对脓毒症模型中IDO1的调节作用。 Figure 3Effect of MSCs on regulation of IDO1 in sepsis animal. 2 MSCs对脓毒症模型中各种免疫细胞的调节 图1MSCs对脓毒症模型中IL-10的调节作用。 Figure 1Effect of MSCs on regulation of IL-10 in sepsis animal. MSC与各种免疫细胞作用后,除分泌大量可 溶性细胞因子调节炎症反应外, MSCs还能通过抑 制各种免疫细胞亚群的特异性和非特异性免疫来调 [23] 节机体的免疫功能,表现出多向免疫调节活性 。 这些免疫细胞包括不同的效应器细胞 [ 如自然杀 [24-25] + 伤细胞NK] 、CD8 细胞毒性T细胞CTL、 [26-27] [28] Tregs 和特殊类型T细胞NKT细胞和γδ细胞 和 [29] [30] 潜在的抗原提呈细胞APC如B细胞 ,DCs 和巨 [31] 噬细胞 。 2.1 单核 / 巨噬细胞 [32] Krasnodembsk aya等 研究显示予以MSCs治 疗后,脓毒症小鼠血清中各种促炎/抗炎因子的水 平未发现明显的变化,但小鼠的生存率却较对照 组明显提高,显然MSCs并非完全通过调节抗炎/促 炎反应发挥疗效的;还发现MSCs治疗组小鼠血液 中铜绿假单胞菌的菌落数明显减少,且从MSCs治 疗组小鼠血液中提取的单核细胞具有更强的吞噬 能力。此外,治疗组小鼠血清中的C5a水平明显升 高,这可能与巨噬细胞表面 CD11b受体表达上调 有关。以上结果提示脓毒症小鼠注射MSCs后生存 率提高是由于MSCs增强了机体吞噬细菌的能力。 图2MSCs对脓毒症模型中PGE 的调节作用。 [3] 2 Nemeth等 的研究同样发现注入MSCs的脓毒症小 Figure 2Effect of MSCs on regulation of PGE in sepsis animal. 2 鼠血浆中单核-巨噬细胞的水平升高,但给小鼠服 用一种含有氯屈磷酸二钠的脂质体其作用主要是 消除体内单核细胞和巨噬细胞后发现注入MSCs的 有利作用消失了;提示MSCs提高脓毒症小鼠的生 存率有赖于单核/巨噬细胞的存在;并认为单核-巨757 脓毒症治疗的新希望:干细胞疗法 赵尚平,等 [37] 噬细胞升高后主要是通过分泌抗炎因子IL -10发挥 的分泌 ,但IFN-γ在启动MSCs的免疫抑制中具 抗炎作用。 有不可替代的作用,敲除 I F N- γ R 基因的大鼠的 BMSCs或给予IFN-γ阻断剂均不能抑制T细胞的增 [38] 2.2 T 细胞和 Tregs 殖 。 + + [26,39-40] 体外试验显示MSCs能够抑制有丝分裂原、同 MSCs可诱导T细胞向CD4 CD25 Tregs 、 + [26] 种异体抗原、LPS等诱导的T细胞增殖。MSCs抑制 CD8 Tregs转化和增殖 ,还可维持Tregs表面Fox3 [4 1] T细胞免疫反应的一个重要特点是不受MHC限制, 的表达,下调 Tr e g s表面 C D127表达 ,进而抑 无论是来自供体、受体还是第三者的MSCs都能诱 制免疫反应。 Treg s是具有免疫调节功能的 T细胞 [26] [31-33] [34] + + 导这种效应 ,且呈剂量依赖性 。研究 发现 群体,尤其是CD4 CD25 Tregs具有免疫无能和免 MSCs可下调细胞周期素D2的表达,上调p27Kip1 疫抑制功能, 在诱导外周免疫耐受中发挥重要作 [42-43] 的表达,将T细胞阻滞在G /G 细胞周期阶段,外 用。研究 发现:影响 M S Cs诱导 Tr e g s生成的 0 1 + 源性给予细胞周期素D2可逆转MSCs对T细胞的抑 因 素包 括 M S Cs 与 C D 4 T 的 相互 作用 、 细胞 因子 制作用,提示MSCs是通过抑制T细胞的增殖发挥 PGE 、TGF-β和骨蛋白2。 2 [44-46] 免疫抑制作用图4。 另外还有研究 发现MSCs组成性表达人白 M S Cs 可通过调节各种细胞因子的水平进而 蛋白抗原GHL A-G和共刺激分子B7-H4,这些分 影响 T细胞的功能。 M S C s抑制效应 T细胞分泌促 子的表达会抑制T细胞活化、增殖和/或T细胞介导 炎因子 TNF - γ, TFN - α和抗炎因子 I L -4, ID O, 的细胞毒性作用。给予HL A-G或B7-H4抗体可显著 [23,35-36] TG F - β ,这些免疫抑制因子可进一步抑制 逆转MSCs对T细胞增殖的抑制作用,提示这两种 T细胞的活化和功能。虽然 M S C s强烈抑制 I F N - γ 分子在MSCs的免疫抑制中发挥重要作用。 细胞周期素 D2 表达? p27Kip1 表达? G 0 间期 图4MSCs对脓毒症模型中T细胞的调节作用。 Figure 4Effect of MSCs on regulation of T cell in sepsis animal. [29] γ 2.3 B 细胞 I F N- 诱导 BMSCs产生的 ID O有关。实验 证实 [6] 在大鼠的实验中,MSCs在 CD40L抗体、IL-4 BMSCs产生的可溶性因子可以抑制 B 细胞增殖, [47] 或有丝分裂原 激活后可抑制 B 细胞增殖。 而采用培养BMSCs的上清液与B细胞共同培养时, [18] Krampera等 用人BMSCs进行的体外实验发现, 对B细胞的增殖并无影响,说明释放抑制因子需要 γ B M S C s 可 以 抑 制 由 抗 免 疫 球 蛋 白 抗 体 、 可 溶 性 来自B细胞的旁分泌信号。MSCs可阻断IFN- 诱导 CD40 配体和细胞因子活化的B细胞的增殖能力。 下已经活化的 B细胞的增殖,抑制抗体的产生。 尽管这些现象的机制尚未完全阐明,但这可能与 它对抗体分泌的抑制作用呈现出剂量依赖性的特 细胞周期素 D2758 , 2013, 387 ////. ////. 中南大学学报 医学版 [18,42] 点,且与B细胞活化的状态有关 。此外,MSCs 节中发挥重要作用。近年来,MSCs对DCs的作用 通过抑制趋化因子的分泌影响免疫反应中B细胞的 也引起了人们的关注。MSCs可下调DCs中共同刺 [29] 迁移 。 激分子CD40,CD80,CD83和CD86的表达,在体 + + 外条件下抑制CD14 单核细胞、CD34 前体细胞向 [30] 2.4 NK 细胞 DCs的分化 。目前还没有充分的证据证明MSCs [24] MSCs可以抑制NK细胞的增殖、减少IFN-γ的 是通过何种机制 抑制 D Cs的成熟,但研究 提示 [6] 分泌,影响其表面细胞分子的表达 。MSCs可抑 PGE 可能通过改变表面分子CD80,D60,CD83的 2 制IL -2激活的NK细胞增殖,这可能主要与可溶性 表达和产生IL -12而对成熟早期的D Cs产生影响。 免疫抑制因子TGF-β,sHL A-G,PGE 和细胞之间 正常情况下,成熟DCs高度表达MHC -II,可将抗 2 [23,48] 的直接作用有关 。 NK细胞的效应器功能 如 原肽-MHC-II类分子复合物提呈给初始T细胞。但 NK细胞对病毒感染细胞的细胞毒性作用 也能被 在MSCs的作用下,DCs分泌IL-12和IFN-α减少,IL-1β [27,30] MSCs所抑制,并伴随有IFN-γ分泌减少,这主要与 和IL -10增多, MHC-II抗原的表达水平降低 。 [24] MSCs分泌的PGE ,IDO下调NK细胞活化受体有关 MSCs抑制DC MHC-II的表达将降低其抗原提呈功 2 图5。尽管有研究报道MSCs不能抑制刚刚分离出 能图6。 [32] [18] 来的NK细胞的溶解作用 ,但Krampera等 研究 脓毒症小鼠模型注入MSCs后,各种免疫细胞 发现在 M S Cs作用下 NK细胞的毒性作用减弱,且 的增殖、活化、分泌都受到了影响,MSCs对机体 MSCs对HL A-I阳性NK细胞的抑制作用较HL A-I阴 免疫系统构成的调节作用并非单一的作用于炎症 [48] 性NK细胞明显 。 反应的某个环节,这一特点正是其它免疫调节剂 : BMSCs和淋巴细胞以 1 1 混合时,可抑制细 所望尘莫及的。 [26] 胞毒性T细胞CTL和NK细胞的细胞毒性功能 。 + 说明 BM SCs在非常高的浓度时,才能下调CD 8 T 细胞和NK细胞扩增,而这种高浓度的BMSCs在体 内实验中根本无法使用。关于NK细胞和MSCs相互 [25] 作用的研究 还发现,不仅MSCs抑制NK细胞的增 殖,活化的NK细胞对MSCs也具有杀伤作用。 图6MSCs对脓毒症模型中树突状细胞的调节作用。 Figure 6Effect of MSCs on regulation of DCs in sepsis animal. 图5MSCs对脓毒症模型中NK细胞的调节作用。 Figure 5Effect of MSCs on regulation of NK cells in sepsis animal3 展望 2.5 DCs 脓毒症模型输注 M SCs可提高生存率。 M SCs DCs通过促进抗原特异性T细胞活化、激活非 对体内多种细胞因子及免疫细胞均有调节作用,但 特异性免疫细胞,在免疫反应的启动、维持和调759 脓毒症治疗的新希望:干细胞疗法 赵尚平,等 1998, 1615: 2099-2105关于生存率提高的原因不同学者的研究 结果不全 10. Bonder CS, Norman MU, Macrae T, et al. P-selectin can support both 一致。免疫功能紊乱是很多严重疾病最后共同的 Th1 and Th2 lymphocyte rolling in the intestinal microvasculature[J]病理生理过程,我们期望能找到一种安全、高 效、 Am J Pathol, 2005, 1676: 1647-1660智能的免疫调节剂使紊 乱的免疫系统恢复正常,而 11. Ajuebor MN, Das AM, Virag L, et al. Role of resident peritoneal MSCs可能正是这样一种调节剂。MSCs表现出低免 macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil 疫原性,异体应用无排斥反应,为它的广泛应用提 migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop 供了可能性,同时它具有多向分化潜能,具有组织 involving endogenous IL-10[ J]. J Immunol, 1999, 1623: 1685-1691修复和调节作用。从理论上而言它是一个万能的修 12. Nussler AK, Wittel UA, Nussler NC, et al. Leukocytes, the Janus cells 复者,但目前对MSCs的认识仅仅是冰山一角,在 in inflammatory disease[J]. Langenbecks Arch Surg, 1999, 3842: MSCs的远期疗效、注射MSCs的剂量、时机、安全 222-232性等问题上均缺少相关数据。因此,在MSCs应用 13. Hegyi B, Kudlik G, Monostori E, et al. Activated T-cells and pro- 的安全问题上应提高警惕。 inflammatory cytokines differentially regulate prostaglandin E2 secretion by mesenchymal stem cells[ J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 4192: 215-220参考文献 14. Yanez R, Oviedo A, Aldea M, et al. Prostaglandin E2 plays a key role in 1. De Miguel MP, Fuentes-Julian S, Blazquez-Martinez A, et al. the immunosuppressive properties of adipose and bone marrow tissue- Immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells: advances and derived mesenchymal stromal cells[J]. Exp Cell Res, 2010, 31619: applications[ J]. Curr Mol Med, 2012, 125: 574-591. 3109-31232. Ryan JM, Barry F, Murphy JM, et al. Interferon-gamma does not 15. Shinomiya S, Naraba H, Ueno A, et al. Regulation of TNFalpha break, but promotes the immunosuppressive capacity of adult human and interleukin-10 production by prostaglandins I2 and E2: mesenchymal stem cells[ J]. Clin Exp Immunol, 2007, 1492: 353-363. studies with prostaglandin receptor-deficient mice and prostaglandin 3. 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