一株产黑褐色色素海洋放线菌的研究

一株产黑褐色色素海洋放线菌的研究 Vol ,3 0 ， No ,5 30 5 海 洋 环 境 科 学第 卷 第 期 2 0 1 1 1 0 年 月 MARINE ENVRONMENTAL SCENCEII October 2 0 11 一株产黑褐色色素海洋放线菌的研究 ，，李鹏苗增良王健鑫 ( 浙江海洋学院 海洋科学学院，浙江 舟山 316000) : ，，，摘 要从舟山群岛潮间带海域中分离到一批产色素的海洋放线菌用滤纸片法进行抑菌试验并对目标菌株进行鉴定然 ，，。B2，后对其所产色素进行粗提测色素的最大吸收波长研究理化因子对其影响结果表明筛选到产黑褐色色素的菌株 其 Vibrio parahaemolyticus Escherichia coli ，，456nm ， 对 和 具有较好的抑制作用色素初步研究结果显示在波长 处具有最大吸收值 ，。16S rDNA B2 ， 光照对色素稳定性影响较弱不耐高温和酸碱生理生化鉴定和 分子序列分析显示菌株 为链霉菌属的一种 Streptomyces sp, 28a-34-3 99, 8% 。B2 。 B2 ，系统进化树显示 与菌株 具有最好同源性相似性为 菌株 具有较好的研究价值关键: ; ; 16S rDNA; 词海洋放线菌色素链霉菌属 :Q331: A : 1007-6336( 2011) 05-0689-05中图分类号文献标识码文章编号 Research on a marine actinomycete producing blackbrown pigment - LI Peng，MIAO Zeng-liang，WANG Jian-xin( Marine Science , Technology College of Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316004，China) Abstract: Somem arine actinomycetes producing the pigment were isolated form the ZhoushaIns lands in the intertidal area, The screening target wass trained by the filter paper method andid entified，then extracted the igpment，measured the maximum absorption wavelength and researched effect ohny spical and chemical factors, A marine actinomycete strain B2 producing back-brown ipgment was isolated，and it has goodin hibitory effect onV ibrio parahaemolyticus and Escherichia coli, The preliminary research showetdh at the pigment had the maximum absorption value at 456 nm，and there was weak effecligt hotf on the pigment，neutral conditions and low temperature were good to its stabiity, 16S rDNA sequencesn aayses，physioogica and biochemica identification showed thes train lllll belong to Streptomyces sp, Phylogenetic tree displayed B2 had the besht omology with strain Streptomyces sp, 28a-34-3，and their simi- larity was9 9, 8% ,T he s train B2 had goovda lue for research, Key words: marine actinomycetes; pigment; 16S rDNA; Streptomyces sp, ,4, Mycale plumos 、、萍从海洋羽毛山海绵 中筛选到产十一烷海洋活性物质由于其环保高效无毒害等一系列优 Saccharopolyspora sp, ， ，，基灵菌红素的海洋放线菌糖多孢菌 点逐渐成为研究的热门如具有新颖结构的海洋抗生 ,5, ,1,; 、，并对其进行了提取及抗肿瘤性的研究侯竹美等从胶 细菌素等不仅在水产品养殖业中具有很好的利用 素,2,，，、( Strepto- 前景并且在对抗人类疾病方面如抗肿瘤抗病毒等 州湾海域中筛选到一株产蓝色素的海洋链霉菌 mycesp ,s ) ，( Pseudomonas areugi- 。研究发现其对绿脓杆菌也提供了很好的治疗前景天然色素与人工合成色素相 、、、nosa) 、( Crytococcal meningitis) 。 比具有无毒安全性高色泽自然鲜艳营养价值高和药 隐球菌有较强的抑菌活性,6,Pseudo- ，李厚金等从大亚湾中筛选到产红色素海洋细菌 理功能等优越性目前天然色素的来源主要依靠从植物 ,7, ，。monas sp, ; Pseudo- 中获取因此受地域与环境的影响比较大随着环保意 温露等从南海中筛选到海洋细菌 monas sp, ，; 、，该菌株产生蓝色素具有抗肿瘤的作用谷志静 识健康意识的加强人工合成的色素逐步不为人所接 ,8,，，x。R受海洋微生物产色素丰富且色素的生产不受空间环境 等筛选到一株产类胡萝卜素的海洋光合细菌 本文 ,3, B2 、，，通过对产黑褐色色素菌株 抑菌活性研究分类地位确 等限制具有很好的开发利用前景如曾春民等从大亚 Pseudomonas，( Pro- ，湾分离到细菌 能产生化合物灵菌红素定及色素的基本性质研究希望能为进一步开发有价值 。dgosn) ，; 的海洋微生物天然色素提供参考 iii该色素可作为天然色素或抗菌素来开发李雪 :2010-07-13，:2010-10-25收稿日期修订日期 :( 20061133) ; ( 06226) ; ，基金项目浙江省教育厅项目舟山市科技局计划项目校级课题动物肠道菌群降解几种类黄酮物质的研 ( X05LQ02)究 :( 1980-)， ，，，，E-mail: lpqp3818081@ 163, com作者简介李 鹏男浙江舟山人实验师硕士 :，，E-mail: 664041120@ qq, com通讯作者王健鑫高级实验师 。况进行观察将筛选得到的目标菌株进行常规项目的生 1 材料与方法，。理生化实验观察结果 1, 2, 6 16S rDNA 分子鉴定 1, 1 材 料DNA 用细 菌 基 因 组 提取试剂盒提取目标菌株的 1, 1, 1 实验材料 DNA PCR bp ，1 500 PCR 后进行 扩增纯化后收集 左右的 、、、分别在浙江舟山的三江码头鸭蛋山码头东极岛 ，( ) 。产物交给宝生物大连有限公司进行测序 、、。朱家尖东港等地的潮间带采集海水海泥 1, 2, 7 进化树的绘制 1, 1, 2试 剂 Blast 利用 对得到的序列在数据库中进行相似序列 DNA ( TIANamp Bacteria细菌 基 因 组 提 取 试 剂 盒 ，( 97% 的搜索获得与目标菌株相似性较高的菌株以上相 DNA Kit) ( ) ; 由天根生化科技北京有限公司提供常规化 ) ，，。似性对同源性较好的序列进行比对绘制系统进化树 DNA Marker TaKaRa ; 学试剂 购自 公司其余均购于国药 1, 2, 8 色素的提取。集团 ,11,色素提取方法借鉴苏龙等对产红色素菌的提取方 ，B2 1 法将菌株 活化后接种于液体高氏 号海水培养基 1, 1, 3培养基 ，50 mL /250 mL 25? ，中按 摇瓶量 进行培养色素产生后 1 。培养基采用改良海水高氏 号固体培养基，4 500 r / min 10 min ， 取出离心 收集上清液即为色素溶液1, 2 方 法 ，，先用乙醇处理后用四氯化碳进行萃取褐色层用旋转蒸 1, 2, 1 菌种分离 ，。发仪蒸发浓缩得到粗制品 1 样品处理后用改良的高氏 号海水琼脂培养基进行 ，、、1, 2, 9 最大吸收波长的测定分离培养根据菌落的颜色大小形状等挑取单菌落进 ，B2 将浓缩色素液进行适当稀释后以未接种菌株 的 ，。行划线分离得到纯种并选取产色素的菌株进行筛选 ，340 nm: 620 nm ，液体培养基为空白对照在 范围用紫外 1, 2, 2 菌种的筛选,9, ，。可见分光光度计进行扫描确定最大吸收波长 ，采用滤纸片法对目标菌株进行筛选以金黄色葡 1, 2, 10 各种理化因子的影响( Staphylococcus aureus) 1, 128、( Escherichi- 萄球菌大肠杆菌 5 mL ，pH 1、3、5、7、9、11， 取 稀释色素液调节 分别为 a coli) 1, 1100、( Candida albicans) 2, 538、白假丝酵母黑曲 1 : 2 h，; 10 mL 处理 在最大吸收波长处测试吸收值将 稀 ( Aspergillus niger ) 3, 314、( Bacillus 霉苏云金芽孢杆菌 ，释色素液置于培养皿中以一定功率的自然光强度对其 thuringiensis) 1, 788、( Vibrio parahaemolyticus)副溶血弧菌 ，1、3、5、7、10 d，; 进行照射处理分别照射 测其吸光值取 1, 1616、( Bacillus mucitaginosus) 1, 910 胶质芽孢杆菌作为 10 mL 40、60、80、100、120? :4 3 稀释色素液分别在 处理 ，指示菌指示菌均购于中国普通微生物菌种保藏中心 h，。测吸光值 ( CGMCC)， 。测抑菌圈 1, 2, 3菌株的形态观察 ，筛选到的菌株进行平板划线并转接试管斜面进行 ,9,2结果与分析，。保种菌丝形态观察采用插片法 1, 2, 42, 1不同培养基的生长情况 分离纯化结果 11 ，共分离到产色素的海洋放线菌菌株 株具体情况 将筛选得到的目标菌株分别在几种常见培养基中进1 。，如表 所示产色素放线菌多来源于潮间带海泥中颜 ，。行培养观察菌株的生长情况 ，色常见褐色与红色在放线菌培养过程中菌落颜色常发 1, 2, 5 生理生化实验 。生变化 ，采用不同的糖作为碳源对目标菌株的碳源利用情 1 表 产水溶性色素的放线菌菌株 Tab, 1 Slime water-soluble pigment of actinomyces 菌株编号菌落颜色菌落特征来源色素颜色 b7，边缘规则，难以挑取白色菌落较大海泥粉红色b9 ，，菌落中心突起难以挑取 海泥 粉红色 后白色 白色B2 菌落呈粉末状 白色粉末，海泥 深褐色 期黑色 白色X5 状 白色粉末状菌落 海泥 淡黄色 后期灰色 白色 A16 海泥 淡褐色 ，白色 白色后期，，菌落为白色菌落有突起有皱褶 C3 海泥 浅褐色 ，灰黑 白色后期，菌落为白色粉末菌落有突起 菌X4 海泥 淡黄色 ，灰色 白色后期，落中间出现浅绿色菌落有突起 A6 海泥 褐色 ，灰黑 灰白后期培养后期出现黑色粉末状菌落 菌a7 海泥 淡紫色 ，灰黑 白色后期，落培养初期白色中间突起 菌落m1 海水 黑褐色 浅灰色 白色粉末状 A9 海泥 玫瑰红 ( )2 ，7 ，B2 2, 2筛选结果抑菌试验如表 所示有 种菌株产抑菌活性物质其中菌株 对 ，。将产各种色素的菌株进行抑菌试验抑菌试验结果 大肠杆菌和副溶血弧菌具有较好的抑制作用 2 表 纸片法得到的抗菌活性物质生产菌的抗菌谱 Tab, 2 Antimicrobial spectrums of screenentibdi oatics producing bacteria 指示菌 菌株编号 2, 5383, 3141, 9101, 7881, 16161, 11001, 128 b7))))+))+ b9 ) ) ) ) + + ) ) X5 ) ) ) ) ) ) ) B2 ) ) ) ) + + + + + ) A16 ) ) ) ) + + ) ) C3 ) ) ) ) ) ) ) X4 ) ) ) ) ) + ) A6 ) ) ) ) ) + + ) a7 ) ) ) ) ) ) ) m1 ) ) ) ) ) ) + + A9 ) ) ) ) ) 说明: + : 抑菌圈直径 , 10 mm; + + : 抑菌圈直径在 10 : 15 mm; + + + : : 抑菌圈直径在 15 : 20 mm; + + + + : 表示抑菌圈直径 , 20 mm; -: 。,无抑菌现象 ，，，2, 3菌株形态观察突起呈现粉末状易挑取显微观察发现在菌丝末端有1 ，B2 ，，。如图 所示平板划线观察到菌株 菌落灰白色 螺旋现象且螺旋较为紧密 1 B2 图 海洋放线菌 的菌落及菌丝形态 Fig, 1 Marine actinomycetes B2’s colony and hyphal morphology 2, 42, 5不同培养基上的生长情况生理生化试验 B2 3 。4、5 ，B2 菌株 在不同培养基的生长情况如表 所示在 表 所示菌株 菌株 的生理生化试验结果如表 3 d ，B2 B2 ，、。培养 后菌株 在葡糖糖天冬培养基等三种培养基 可以产生淀粉酶使明胶液化还原硝酸盐在碳源利 ，，，B2 ，、、上未见生长在其余几种培养基中有生长但是长势较 用上菌株 不能利用鼠李糖可利用葡糖糖蔗糖木 。。糖等各种碳源 差 3 B2 3 d 表 菌株 在不同培养基上培养 的生长情况 2, 6分子鉴定Tab, 3 Strain B2 in different culture media on growth f3o rd 16S rDNA B2 分子鉴定结果显示菌株 的核苷酸长度 1376 bp，NCBI 为 将测序得到的核苷酸序列上传至 的 B2 培养基GenBank : GU263839。数据库获得登录号为 基内菌丝气生菌丝长势2, 7 系统进化树绘制 灰白 甘油天冬培养基白+Bast ，GenBank l利用 软件从 数据库中查找同源性较 葡萄糖天冬培养基 不生长 1 不生长 高氏 号培养基 ，16S rDNA ，高的菌株利用其 作为比对对象来构建系统 白 无机盐培养基 燕，2 。进化树系统进化树如图 所示系统进化树显示菌株 +灰白麦汁培养基 灰白 + + 灰 B2 Streptomyces sp, 28a-34-3 ，与菌株 同源性最好相似性为 灰 不 PDA 培养基+ 灰白 99, 8% ，B2 。说明菌株 是链霉菌属的一种 生长 ) 酵母粉 麦芽培养基 注: + 生长较差; + + 生长一般; + + + 生长良好。 4 B2 表 菌株 对不同碳源的利用情况 Tab, 4 B2 on utilization of different carbonso urces 碳源 菌株 葡萄糖蔗糖木糖甘露醇果糖肌醇阿拉伯糖鼠李糖无碳源 B2+++++++)) 5 B2 表 菌株 的生理生化试验结果 Tab, 5 Physiological and biochemical tests oBf 2 项目 菌株HS 黑色素明胶硝酸盐还原纤维素 牛奶胨化牛奶凝固淀粉水解 2 B2)++))))+ 16S rDNA B2 、2图 根据 序列构建的菌株 以及相关种属的的系统进化树 Fig, 2 NJ evolutionary tree based oonm cpleted sequence Bo2f 16S r DNA 3 ，B2 360 nm: 620 nm 如图 所示菌株 在 出现了两个 2, 8 光谱特性，456 nm 。波峰其中在波长为 时出现最大吸收值 2, 9 理化因子影响 2, 9, 1 pH 影响 ，pH 5 9 色素受酸碱性影响比较大当 小于 或者大于 ，，( pH = 7) 的时候吸光值明显降低在中性条件下的时候 。pH 6。比较稳定对色素稳定性的影响见表 2, 9, 2 光照影响 ，，色素受光照影响较弱在长时间光照下色素性质仍 3图 色素的吸收光谱。旧保持稳定 Fig, 3 Spectrum carvep igomf ent 6 pH 表 不同 对色素稳定性的影响 Tab, 6 Effects odfi fferent pH on stability of priodigiosin pH对照1357911 OD 值0, 9150, 1220, 3400, 5580, 9200, 4010, 155 7 表 不同时间光照对色素稳定性的影响 Tab, 7 Effects odfi fferent sunshine times on stability of priodigiosin 时间 / d对照135710 OD 值0, 9080, 8970, 8650, 8560, 8550, 849 2, 9, 3 温度影响 80? ，，，。当温度超过 时色素的稳定性较差易于分解不耐高温 8 表 温度对色素稳定性的影响 Tab, 8 Effects odfi fferent temperature osnta bility of priodigiosin 温度 / ?对照406080100120 OD 值0, 9110, 8990, 7690, 4350, 2330, 102 5005-5011, 3 结 论,3, ，，，, Pseudomonas sp, 曾春民林国强沈鹤琴等大亚湾细菌 发 ,J,, ，1996，2: 5-7,酵产物化学成分研究中国海洋药物 ，在本次研究中从舟山海域潮间带筛选到的产色素 ,4, , ( metacyc oprodigiosin) l李雪萍十一烷基灵菌红素的提取分 B2，16S rDNA 菌株 根据生理生化鉴定并结合 分析结果显 ,D,, : ，2009,离及抗肿瘤活性研究青岛中国海洋大学 ，，，示该菌株属于链霉菌属的一种抑菌试验结果显示该 ,5, ，，，, 侯竹美王淑军赵方庆等胶州湾产蓝色素海洋链霉菌的 ，菌株对大肠杆菌及副溶血弧菌具有较好的抗性同时发 ,J,, ，2007，31( 5) :3 9-44，57,初步研究海洋科学 ，现该菌株具有产淀粉酶的能力本次试验结果发现菌株 ,6, ，，，, Pseudomonas 李厚金蔡创华周毅频等大亚湾海洋细菌 B2 ，具有产多种生物活性物质的能力不仅可以作为研究 sp, ,J,, ( ) ，2003，42 中的红色素中山大学学报自然科学版，、天然色素的生产菌进行开发并且也可以作为抗菌素淀 ( 3) :10 2-104, 。B2 456 粉酶的生产菌进行研究所产生的色素在波长为 ,7, ，，，, Pseudomonas sp, 温 露袁保红李厚金等南海海洋细菌 产 nm ，pH 处具有最大吸收值其稳定性受温度及 的影响较 ，，大可以用有机溶剂进行萃取且其色素的产生时间为培 ，生的一种抗肿瘤蓝色素,J,, 中山大学学报( 自然科学版)5 : 7 d ，，养后 左右色素产生时间较短所产黑褐色色素的 2005，44( 4:) 63-69, 。同类报道在国内并不多见 ,8, 谷志静，陈锡时，韩士杰，等, 海洋光合细菌 Rx 菌株的分离鉴 ,J,, ( 定与生物学特性研究西北农林科技大学学报自然科学 ) ，2004，32( 9) :4 7-52,版 ,9, ACAR J F, The disc susceptibility test,A,, Antibiotics in labora- :参考文献tory medicine,C,, London:W i- iams and Wikins，1980, lll,1, ，，，, B5 邵彦坡方丽萍魏少鹏等海洋放线菌 菌株发酵液抗菌 ,10, ，，，, ,M,, : 沈 萍范秀容李广武等微生物学实验北京高等 ,J,, ，2007，16 ( 3 ) : 248-251，谱及稳定性研究西北农业学报 ，1999,教育出版社 256, ,11, ，，，, 苏 龙刘洪海吴弦华等一株高产红色素菌的筛选及其 ,2, MNCER T J，JENSEN P R，FENCAL W，et a, Widespread and IIl,J,, ，2007，12: 36-色素的提取和理化性质研究食品科技 persistent populations of a major new marine actinomycere taxon 38, in ocean sdeiments,J,, Appl EnvironMicrobo，2002，68 ( 10 ) : ll