鳜血清免疫球蛋白的分离纯化及其亚单位分子量的测定

鳜血清免疫球蛋白的分离纯化及其亚单位 分子量的测定 第22卷第2期 1998年6月 水生生物 ACTAHYDR0BH)U)GCASrNICA V0l22.No2 hn.199S .韭安聂品 (中国科学院水生生物研究所.武汉430072) ISoLAT10N,PURIFICATIoNANDMoLECULARWEIGlit DETERM?NATIoNoFSERUMIMI【JNoGLoB?N FROMMANDARINFISH(SINIPERCACHUATSI)' ZhangYong'allandNjePin (1~tisuteof胁drobinlogy,theChineseAcademyofSciences,Whhan430072' 关键词丘痤韭珀,笾,堂王量苎 KeywordsImmunoglobulin,Purification,Molecularweight,Mandarinfish(Sinipercachua ~i) 免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)在脊椎动物体液免疫中起着十分重要的作用.近年来.鱼类的研 究已受到免疫学家的广泛关注.大多数硬骨鱼类只发现有一种,类似于哺乳动物的M,但不是五聚 体,而是由8条重链(H链)和8条轻链(L链)组成的四聚体.然而,M的结构在不同鱼类甚至同一种鱼 的不同部位(如血液,粘液和胆汁等)有所差异】. 对于鱼类整个免疫系统以及免疫应答规律等的基础研究,都有赖于高纯度的制备.引然而许多年 来鱼类k的分离纯化,还主要是采用饱和硫酸铵沉淀凝胶过滤和离子交换层析等技术】.通过这些 方法获得的IE,其活性纯度以及数量都是有限的,而且操作步骤较为烦琐本文报道丁通过特异性配体 亲和层析技术分离鳜[Sinipercachuatsi(Basilewsky)】血清,并对其H-L链分子量进行测定. 近年来,鳜作为名贵鱼类,在莪国淡水渔业中的重要性日益显着,但是在高密度养殖的条件下.鳜 流行病时有发生.因此,利用亲和纯化的鳜血清Ig.可以对其进行结构分析或作为抗原制备高特异性的 抗体.进而研究鳜的整个免疫系统及其免疫反应.建立针对各种病原的免疫诊断方法,实现鳜的健康养 殖 1材料与方法 1.1材科鱼饲养六尾鳜(平均体重400g,购自武汉市江夏区一渔场)饲养于两个250L的水族箱内,每 天投喂充足的活泥鳅(2%食盐水溶液体消毒).免疫前驯化10d.驯化及免疫期间水温保持在26? I?. 1.2血{膏制备基础免疫和14d后第一次加强免疫抗原剂量及免疫途径相同,即每尾鱼腹腔注射 ?车工作得到中国科学院,武汉市科学技术委员会晨光和淡水生志厦生物技术国家重点实验室的资助 1997-11'收到 2期张永安等:鳜血清免疫球蛋白的分离纯化及其亚单位分子量的测定 0.8mg山羊lgG(Sigma公司,溶于0.8rid0.6%NaCI中并用0.8mlSigma公司福氏完全佐剂乳化).第 29d,进一步加强免疫,每尾鱼礁腔注射0.8mg山羊IgG(溶于0.8mlO.6%NaCI中,不 加佐剂),7d后,从 尾静脉采血,室温下静置1h,待其凝固后置4'C冰箱中过夜.次日以4000~om离心10rain,收集上层血 清,一70?保存备用. 1.3免疫球蛋白纯化亲和层析过程使用Pharmacia公司的FPLC(快速蛋白液相色谱)系统.4ml山羊 IEG一琼脂糖悬液(Sigma公司)装入层析柱(10×0.5cm,BioRad公司)中,重力作用下逐步填充,形成床体 积2ml;80ml0.01mol/LPBS(pH7.2,含0.5moI/LNaCI)预洗,流速I.0mFmin;2ml鳜免疫血清与2ml PBS混匀,0.45m无菌针头滤器(Gelman公司)过滤,滤液上柱;80mlPBS洗涤;用10ml洗脱液 (0Imol/L甘氨酸一NaOH,pH11.0,含0.15mol/LNaC1)将鳜抗山羊IgG的抗体从层析柱上洗脱下来 并作为单一分部收集(层析柱用80mlPBS平衡备用);立即用1.2m10.ImoFLTrls-l-lO(pH7.2)中和;置 0.01molFLPB(prrr.2,不含NaCI)中4?透析24h,其问多次更换透析液叫;低温下样品于透析袋中吹风 浓缩;一70U保存. I.4分子量及纯度测定用Mini-Protea盯1MIICell(BioRad公司)进行不连续SDSPAGE,检测制备样 品中Ig的纯度及其HL链的分子量.电泳按Laemmli系统进行.浓缩胶浓度4%,分离胶12.5%.待 测样品与样品缓冲液(0,0625mol/L的Trls-HCl,pH6.8,含2%SDS,10%甘油,0.05%溴酚蓝)1:1混合; 加入2.5%(终浓度)2.巯基乙醇;沸水浴中5min,玲却至室温后上样200V恒压电泳40rain;0,25%考马 斯亮兰R-250溶液(40%甲醇一10%乙酸配成)固定并染色;7.5%乙酸溶液(含5%甲醇)脱色用于 SDS-PAGE的分子量蛋白(BioRad公司)为磷酸化酶b(974kD),牛血清白蛋白(66.2kD),卵清蛋白 (45.0kD1碳酸酐酶(3I.0kD),大豆胰蛋白酶抑制剂(2I.5kD)和溶菌酶(14.4kD). 2结果与讨论 2.1免疫球蛋白的分离纯化 免疫亲和层析技术用于鱼类的分离纯化国外仅有几倒报道..此技术是运用抗原抗体结合 芑 8 《 昏 图1鳜免疫血清的FPLC图谱 流动相:1.PBS,2免疫血清+PBS,3甘氮酸一 NaOH检测波长:280rim流速:10ral,rnin 柱:Ecoao-CUlalll Fig1FPLCehromaU::grapb.ofmandarinfish immunese[1lnl mobilephase:1PBS,2Serum4-PBS, 3.Gaydne-NaOH:280nm flowrate:10ral,nfirtcolunln:Ecotto-Co]unto 2 图2鳜免疫血清及纯化免疫球蛋白的 SDSPAGE(126)图谱 1.血清,2.免疫球蛋白,3.分子量标准蛋白(kD) Pig2SDS—PAGE(125%1ofimmtm~se九血and purlfiedimmuaoglobulinfrommanfish 1.Serum,2Immunoglobulin, 3StandardproteiafkD1 194水生生物22卷 的特性从免疫鱼血清中选择性地分离抗原的特异性抗体以山羊IgG-琼脂糖(特异性配体山羊G与基 质琼脂糖通过共价键结台)为固相载体装^层析柱中.将鳜(抗山羊IgG)的免疫血清通过该柱.这时样 品中对配体有亲和力的Ig以次级键吸附到固相载体上,而其它无亲和力的物质则穿过基质流出层析柱 并形成第一个层析峰用起始缓冲液充分洗涤(直到紫外检测吸光值为零)以确保杂质完全去除然后 用碱性洗脱液将k从固相载体上洗脱下来并形成第二个层析峰.亲和层析洗脱曲线如图l所示.图中 第一个层析峰A—B既宽又高,第二个层析峰e—D别较为细小,二者没有重叠,表明样品液中杂蛋白与 Ig已完全分开,预示后者在其分部收集液中具有较高的纯度.收集含Ig的分部并用中和液平衡,这样可 消除碱性洗脱液对变性的潜在影响在PB中充分透析脱盐并使纯化的1g回复正常的生理状态 2.2分子量及纯度鉴定 在2_巯基乙醇作用下,鳜血清lg分子中共价二硫键被还原,多聚体的lg被拆解为H,L链亚单位. 在此条件下通过SDS-PAGE,电诛图谱如图2所示.图上仅见分子量约为72kD和29kD的两条蛋白带, 分别代表Ig的H链和L链.表明通过此法获得的鳜血清Ig纯度较高.这代表了国内首次分离得到纯度 较高的鱼类血清抗体及其HL链分子量的测定值.如果鳜Ig也象大多数硬骨鱼类IgM那样在自然状态 下为四聚体,则其分子量理论值应为808kD.这与文献[1】报道的硬骨鱼M的分子量范围(H链60— 81kD,L链20--30kD,完整分子610---900kD]一致但尚需进一步研究以证实鳜血清 中的Ig为四聚体的 M. 鳜免疫血清电泳图谱(图2)上,与经过亲和层析纯化的血清Ig的H,L链对应部分蛋 白带较宽.表明 该免疫血清蛋白中抗体的含量较高,也证明作者采用的刺激鳜产生抗体的方法是 成功的,其抗体产生的 规律有待进一步研究. 参考文献 [I]WilsonMWan-GWFishIr毗nun.ob山 imandthegenesthatencodethemAnnualReviewof Diseases.1992.2:201—221 [2】SmithS九 Affinitypurificationofserm[mmunoglobulinfromfish,TechniquesinFishImmunologyeds Stolenetal125一l30NewJerseySOSPublications.1992 [3】江育林,李燕,于平.草鱼免座应答的初步研究.水生生物,199115:32l一326 【4】陈昌福等.草鱼体表和肠牯液中Ig的初步升析,鱼病学研究论文集填二辑), 北京:海洋出版杜,1995,2l一25 【5]Est~vezJ.LeimSanma~nMUbeimFMIsolationandpartialcharacterizationofturbot (&.ophthalmusmaainms)immunoglobulins.ComparativeBiochenn'stryiology.I993,105A:275—281 【6】LaemmliUK_Cleavageofstractur~prominsduring 【Ileassemblyofheadofb~tefiophageL.,Pvhture I970.227:680—85 【7】 SmithSA,eta1.Isolafiothpurification,andmolecular-weightdetem'dnationofscrim1immunoglobtdinfrom OreochromisattfeRsJournalof啪AnimalHealth,1993,5:2卜'35 【8】 HungHw,LoCFtTsengCCKouG14_Humora]immunel"esponscofJapaneseeel,Anguitta japonicaTemminck&Schlege1.toPteistophoraanguittarumHoshinz,1951(~crospor a)JournalofFish Diseases,1996,19:243--250