p38MAPK信号通路在小胶质细胞激活介导多巴胺能神经元变性中的作用研究

p38MAPK信号通路在小胶质细胞激活介导多巴胺能神经元变性中的作用研究 p38MAPK信号通路在小胶质细胞激活介导 多巴胺能神经元变性中的作用研究 脑与神经疾病杂志2006年第l4卷第2期 p38MAPK信号通路在小胶质细胞激活介导 多巴胺能神经元变性中的作用研究 黎钢马嵘孙圣刚童萼塘 lO5 摘要目的:研究p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)在脂多精(I,PS)诱导小胶质细胞激活介导多巴胺(DA) 能神经元变性中的作用.方法:脑立体定位注射IPs于大鼠脑质,Westernblot印记法检测不问时间点(0,0.5h,1h, 6h,12h)黑质p38磷酸化水平.酪氨酸择化酶(Tyrosinehydroxylase,TH)免疫组纵化学染色观察蛋白激酶(MAPK)特 异性抑制剂SB203580预处理后IPs对I)A能神经元变性的影响.结果:黑质注射IPs后,Westernblot结果显示 p38MAPK总体蛋白水平在各组均存在达,尢显着性差异(PL>0.05),而其磷酸化Pp38MAPK却发生了明显变化. 正常对照组和PBS注射侧几乎无Pp38的表达,IPs注射后30rain,p-p38即有少量的表达门h表达量增加;6h表达量达 高峰;12h后表达量逐渐下降.与PBS对照11『!【l相比.IPS注人黑质导致TH阳性细胞数下降至38;SB203580预处理 可以显着增加rH+细胞数达63%(P<0.05).结论:p38MAPK信号通路参与rIPs诱导小胶质细胞激活介导DA 能神经元变性.可通过阻断信号通路来减轻IPs诱导DA能神经元变性,为PD治疗提供新的思路. 关键词脂多糖多巴胺能神经元小胶质细胞丝裂原激活蛋白激酶SB203580 中图分类号:R338文献标识码:A文章编号:100635lx(2006)02—01O5一O3 Roleofp38mitogen-activatedproteinkinaseinactivatedmieroglia-mediated thedegenerationofdopaminergicneurons ,,Gang,MaRong.SUNShenggang.TONGE—tank. DepartmentofNeurology.XieheHospital.TongjiMedicalCollege.HuazhongUniversity ofScienceandTechnology,Wuhan430022.china Objective:Tostudytheroleofp38mltogen— activatedproteinkinase(p38MAPK)ontiledegenerationofdopaminergic neuronsinducedbyintranigralinjectionofIipop()lysaccharidc(I.PS).Methods:I.PSwasstereotaxicallyinjectedintosub— stantianigra(SN).1]38phosphorylationlevelsatdifferentsurvivaltimes(0,0.5h,1h,6h,12h)weredeterminedbyWest ern— blot.TheeffectofIPSonthesubstantianigralDAneuronsafterspecificinhibitorSB203580pretreatmentwasob servedbyusing(l'yrosinehydroxylase.TH)imnmnohistochernicalstaining.Results!Westernblotanalysisrevealedthat therewasnosignificantdifferenceofTotalp38MAPKinallgroups.I.evelofpl1()sphorylationofp38MAPK(p-p38)was alittleupregulatedintheipsilateralSNasearlyas30minafterI.PSandincreasedat1h.Itreachedtilemaximallevelat6h andreturnedtOthebasallevelat12h.ComparedwithPBScontrolside.THpositiveneuronsintheSNdecreasedby 68,Tt{一 positiveneuronsintheSNpreconditionedbyspecificinhibitorSB203580increasedsignificantly.Conclusions: p38MAPKplaysanimportantroleintheactivationofmicrogliabyLPSandinhibitionofthesignaltransductlonpathway mayconsequentlybeaneffectiveapproachtodecreasethedegenerationofDAneuronsbyI.PSforthetreatmentofPD. KeywordsIipopolysaccharideI)opaminergicneuronsMierogliaMitogen— activatedproteinkinaseSB203580 小胶质细胞的激活是脑内神经炎症反应的主要表 现,其激活可以促发黑质中多巴胺(DA)能神经元变 性].Wang等利用小胶质细胞系BV一2细胞,发现脂 多糖(LPS)通过激活p38MAPK途径导致小胶质细胞 活化,使用p38MAPK抑制剂SB202190或SB203580 可以抑制LPS激活小胶质细胞后释放的细胞毒性因 子如TNF—a,iNOS表达及NO的产生,对DA能神经 本文为国家自然科学基金资助(30500574) 作者单位:430022华中科技大学同济医学院附属协和医院神经 科(黎钢,孙圣刚,童萼塘);华中科技大学同济医e-院药理学系(马嵘) 元具有保护作用[2].目前有关p38MAPK与小胶质 细胞激活的关系以及抑制p38MAPK信号通路能否保 护DA能神经元的研究,国内外少见报道.为此本实验 采用免疫激活剂IPs注入黑质建立PD模型,应用免疫 印记法观察不同时间点黑质p38磷酸化水平变化情况 以及观察使用MAPK特异性抑制剂SB203580预处理 后LPS对DA能神经元变性的影响.了解其是否具神 经保护作用,以期为PD的治疗提供理论依据. 和方法 1O6 1.动物分组健康雌性(Sprague-Dawley),SD 大鼠35只,由同济医学院实验动物中心提供,体重 180—200g,随机分为不同时间点(0,0.5h,1h,6h, 12h)组观察p38磷酸化水平变化;SB20358O预处理 组:LPS立体定向注射前30min,给予SB203580灌胃 lOmg/kg,术后立即再次给予灌胃10mg/kg.另设生 理盐水对照组,每组5只. 2.黑质LPS立体定向注射SD大鼠用10水 合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉.将大鼠头部俯卧 位固定于立体定位仪上,门齿低于耳杆2.3mm.根 据脑立体定位图谱,选择黑质致密部(SNpc,坐标:前 囟后4.8mm,中缝旁开1.7mm,硬膜下7.8mm)用 微量注射器向左侧注射5/,1LPS(I.PSg/u1),给药速 度为1ul/min,对侧黑质注射5/,1PBS作为对照,给药 完毕l0rain后缓慢退针.缝合皮肤,再肌注青霉素 (100000IU).正常对照组不予任何处理. 3.p38MAPK免疫印迹法(Westernblot) 在0(正常对照)和黑质注射I.PS后0.5h,lh,6h, 12h,每个时问点各取5只大鼠,快速断头取脑,在冰 盘上分离出中脑黑质组织.抽提总蛋白质,用Bio Rad方法测定蛋白质浓度.取40fig/道总蛋白进行 SDS—PAGE蛋白电泳(250v电泳3h.然后转移电流 为250mA,转移时间为2.5h);将蛋白质从SDS— PAGE凝胶转移至硝酸纤维素膜上,整个电转移在转 移缓冲液(39mm'ol/L甘氨酸,48mmol/ITris碱,0. O4SDS,20甲醇)中进行.然后进行免疫印迹显 色,0.1TBS洗膜5min,3次;5脱脂奶粉于室温下 振荡封闭2h;取出硝酸纤维素膜,加人适当稀释的一 抗抗p38抗体(1:1000),抗Pp38(1:1000,4?过夜. 然后用0.19/6TBS缓冲液(Tris50mmol/I,100mmol/ INaC1pH7.5)冲洗5min,3次;滴加辣根过氧化物 酶标记的二抗工作液(羊抗兔IgG,1:500,用封闭液稀 释)37C孵育l小时,0.19/6TBS缓冲洗5min,3次; ECI充分显色后用清水终止反应.最后在暗室中进 行化学发光法显影;高敏感胶片摄片.实验对照均以 图lp38MAPK表达的动态变化 ————————————————]i 2 脑与神经疾病杂志2006年第14卷第2期 水代替一抗,其余操作相同. 4.TH免疫组织化学染色 7d后SB203580组和盐水对照组大鼠在深度麻醉 后穿心灌注.经升主动脉相继灌注冰盐水150ml,4% 多聚甲醛(4C)400ml.取中脑,置于49,5多聚甲醛后 固定3,411,后人4C2O蔗糖至标本沉底.恒冷切片 机将中脑组织块行冠状连续冰冻切片,片厚3Om. 采用SP法进行免疫组织化学染色(冰冻切片漂浮 法).免疫组织化学染色步骤:0.3双氧水5, 10min,灭活内源性酶,正常羊血清封闭1h.加一抗 TH单克隆抗体(1:1000).于4?冰箱中孵育24h,加 SP/HRP,DAB显色,显色满意后,终止显色,脱水,透 明,中性树脂封片.显微镜下观察. 5.图像分析经HPIAS-1000型全自动医学彩色 图像分析系统对各组动物黑质区进行分析.在 17185.5ffm.框下对TH阳性信号进行扫描,计 算两侧TH免疫反应阳性细胞的数量,平均光密度. 每组选用3张切片.Westernbloting蛋白带测定光 密度(OD)值.各项数值均以均值土标准差(夏土s)表 刁 6.统计学处理 各项数值均以均值士标准差(土s)表示,采用 SPSS11.0软件进行分析,左右侧黑质比较采用配对t 检验.组间比较student—newman-keutst检验. 结果 1.p38MAPK表达变化规律 Westerblot结果显示p38MAPK总体蛋白水平 各组均存在表达,但无统计学差异(P>o.05),而其激 活态磷酸化(phosphorylation)p-p38却发生了明显变 化.正常对照组和PBS注射侧几乎无p-p38的表达, LPS注射后30min,p-p38即有少量的表达;lh表达量 增加;6h达高峰;12h后逐渐下降(图1,2).可见其表 达先于小胶质细胞的激活[1.蛋白条带OD值测定 结果见图2.组问比较有显着性差异(P<20.01). 500 删400 昌300 0 0PBS0.51612 P<0.01与照组fif:常与P踮侧)比较 图2LPS诱导黑质Pp38表达变化 脑与神经疾病杂志2006年第14卷第2期 2.p38MAPK抑制剂SB203580对大鼠黑质TH 染色结果的影响 与对照侧相比,7d时,LPS组,黑质致密部TH阳 性细胞缺失62.生理盐水治疗组对此元明显改善, SB203580预处理可以部分保护DA能变性,TH阳性 细胞数亦明显增多,达63(P<0.05). 讨论 PD是老年期常见的中枢神经系统变性疾病,其 主要病理特征为黑质致密部DA能神经元变性坏死, 并伴有胞浆内Lewy小体的出现.黑质DA能神经元 的大量死亡使纹状体DA含量明显下降,严重影响了 运动的控制功能,从而出现了运动失衡症状.在过去 的几十年内,人们一直在研究其发病机制.PD患者 尸检结果发现,黑质致密部均存在有激活的小胶质细 胞引,在MPTP1,6()HDA模型和Rotenone"模 型中均发现黑质致密部存在大量激活的小胶质细胞, 且小胶质细胞的激活先于DA能神经元变性这一类似 的现象,Kim等_q在体研究发现中脑神经元tL~.t他脑 区如:海马,皮层对炎性介导的神经变性过程更加敏 感,这种对神经毒性的敏感很大程度上是由于黑质致 密部比其他脑区小胶质细胞密度增高所致.这些证据 均提示小胶质细胞激活介导的炎症反应与PD关系密 切. LPS是一种以氨基甙为组成单位的磷脂,构成革 兰氏阴性杆菌细胞壁成分,是一种小胶质细胞的强激 活剂,但对神经元无明显的毒性作用.我们以往的研 究采用脑立体定位注射LPS人大鼠脑黑质,发现小胶 质细胞激活在24h达高峰,明显先于后DA能神经 元变性,提示小胶质细胞激活的时相较DA能神经元 变性为早,表明小胶质细胞激活在DA能神经元变性 中起重要的作用[1oI.但小胶质细胞激活的具体机制 不明,Jehon等胡体外研究表明它与小胶质细胞上的 IPs结合蛋白(LPS—bindingprotein,LBP)结合,然后 结合细胞表面CD14,启动胞内信号传递链,引起核转 录因子NF—KB核转位及p38MAPK活化等,激活小胶 质细胞.Wang等利用小胶质细胞系BV一2,发现 LPS可以通过激活p38MAPK途径导致小胶质细胞 活化,Jehon等使用p38MAPK抑制剂SB202l9O或 SB203580可以抑制LPS激活小胶质细胞后释放的细 胞毒性因子如TNF—Q,iNOS表达及NO的产生,对 DA能神经元具有保护作用口.提示p38MAPK信 号通路可能是小胶质细胞激活的重要途径. 丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)是连接细胞膜表 107 面受体与决定性基因表达之间的重要信号调节酶之 一 ,p38MAPK是MAPK家族的重要成员,对炎症反 应起重要的调控作用.蛋白质磷酸化是快速传递细胞 内信号的重要途径,也是快速调节细胞对外界反应的 基础P38MAPK是通过非磷酸化转化为磷酸化状态 而促进下游底物的磷酸化来快速实现信号传递的.多 项证据显示p38MAPK信号途径是小胶质细胞激活 的共同通路,然而大多数实验为体外实验儿.本 研究结果表明LPS注射后30rain,p-p38即有少量的 表达,p38MAPK表达则在LPS注射后6h达高峰,明 显先于小胶质细胞激活的出现(6h后),提示其有可能 介导LPS诱导的小胶质细胞激活,为了进一步证实抑 制p38MAPK途径可能影响小胶质细胞激活介导的 炎性反应导致DA能神经元的损伤,我们采用 SB2O3580预处理,观察了其对LPS诱导DA能神经 元变性的影响.SB203580是一种吡啶咪唑类抑制剂, 可特异性抑制p38MAPK的活性或阻止其发挥作用, 结果发现其能部分的保护DA能神经元.近来Choi 等_1将凝血酶(thrombin)注入黑质亦观察到 p38MAPK在thrombin注入黑质后30min即开始表 达,而且通过共聚焦显微镜证实p38定位于小胶质细 胞,抑制p38MAPK可以保护thrombin诱导的iN0S 和COX-2mRNA的表达,部分保护DA能神经元.亦 支持我们的实验结果. 总之,本研究结果提示p38MAPK信号通路在 I.PS诱导小胶质细胞激活介导DA能神经元变性中有 重要的作用,SB203580能够减少DA能神经元变性, 寻找能够抑制小胶质细胞激活的药物以调节炎症反应 介导的DA能神经元损伤将是PD研究的热点. 参考文献 1孙圣刚,黎钢.童萼塘等.帕金森病与炎性反应关系研究进展.中华 神经科杂志,2003.36;401,4? 2WangMJ.I.inWW,ChenHI.eta1.Silymarinprotectsdopamin ergicneuronsagainst1ip0p01ysaccharidinducedneurotoxicitybyin— hibitingmierogliaactivation.EurJNeurosci.2002,16:2103,2112 3JeohnGH,CooperCI,Wi】sonB,etal,p38MAPkinaseisin— volvedinLipopolysaccharide—induceddopaminergieneuronalcell deathinratmeseneephalicneuron—gliacultures.Ann.N.Y.Acad. Sci,2002,962:332,346 4ShibataH,KasukiH,NishiwakiM,eta1.Iip0po1ysaccharidn— dueeddopaminergiccelldeathinratmidbrainslicecultures:roleof induciblenitricoxidesynthaseandprotectionbyindomethacin.J Neurochem.2003,86:1201,1212 (下转第104页) 104 损害神经功能双重作用.通常情况下II一1B具有神经 营养和神经保护作用,可促进脑损伤后星形胶质细胞 增生及NGF和CNTF的表达,另有人指出II一1B 在海马和皮质水平的增高可能与学习和记忆有关. 在睡眠研究中,中枢或外周给予II一lB能引起动物典 型NREM脑电图同步化.低剂量的IL1B可促进 睡眠;但高剂量的II一1B则对睡眠有抑制作用.本实 验中TSD6h大鼠海马II一1J3明显增高,分析其原因, 可能与睡眠剥夺导致II一lJ3应激性增高,以促使睡眠, 起着神经保护作用,提高神经功能.反之,睡眠剥夺 3d后持续增高,则抑制睡眠,损伤神经元,降低神经功 能.然而,大鼠睡眠剥夺后通过何种途径激活II一1B 使之过表达,激活1I1J3上调后如何发挥其效应以及 NREM在学习,记忆方面的作用等问题有待于进一步 研究. 此外,II一lB是内源性细胞生长因子,IL一1J3及其 产物诱导NF—kB的活性,转而NFkB又增强II一1B的 转录",因此,有人"认为1I1J3可能在睡眠/剥夺中 起到神经递质的作用.由此可见,1L一1B与NF—kB之 间关系密切,而阐明它们之间的关系有助于进一步了 解睡眠调节的机制. 参考文献 1TakaoT.i'raeeyDE,MirchellM,eta1.1nterleukin一1reeeptorsin moues1)rain:characterjzati0nandneur0naIl0caIzati0n.Endocrinolo一 脑与神经疾病杂志2006年第14卷第2期 gY?I990;127:3070 2RonnbaekI.HanssonE.Onthepotentialroleofglutamatetrans— portinmentalfatigue.JNeuroinflammation.2004Nov4;1(1):22 3XiZhongShen.MarcelW.I,Koo,(:hi—HinCho,Sleepdeprivation increasetheexpressionofinducibleheatshockprotein7Oinratgas— tricmucosa.J(astroentero1.2001;7(4):496,499 4ManfridiA,BrambillaD.BianchiS.eta1.Interleukin一1betaen- hancesnonrapideyemovementsleepwhenmicroinjectedintothe dorsalraphenucleusandinhibitsserotonergicneuronsinvitro.Eur JNeurosei.2003Sep;18;104i,9 5Taishi,一P;Chen,一Z;Obal,F.eta1.Sleep—associatedchangesinin— terleukin1betamRNAinthebrain.JInterferon—Cytokine—Res. 1998Sep;18:793,8 6GuanZ,FangJ.ChangesofII一lbetaI.evelInducedbyTotalSleep DeprivationinDifferentBrainRegions.SIEEP,Vol26,Abstract Supplement,2003 7WuVW,NishiyamaN,SchwnrtzJP.Aculturemodelofreactiveas— trocyles;ineraesednervegrowthfactorsynthwsisandrecxpression ofeytokineresp0nsivenessrJ].JNeurochem.1998;71:749~756 8HerxIM,RivestS.YongVW,Centralnervoussystem—iniriatedjinflam— mationandneur0tr0phicfaclor[J~.Immunol,2000,165:2232~9 9PoussetF,Cytokinesandthehrain.EurCytokineNetw.1993;4; 0 10Takahashi.一S;Kapas,'I;Fang,J;eta1.Somnogenicrelationships betweentumornecrosisfactorandinterleukin1.AmJPhysio1. 1999Apr;276:l132,4O llBartfai.一,I:Schuhzberg.一M.Cytokinesinneuronalcelltypes.Neu— rochero—Int.1993May;22:435,44 (2005—11—30收稿) (上接第107页) 5MirzaBH,ThomesnHP,Moos—1.Theabsenceofreactiveastrocy一 1osisisindicativeofauniqueinflammatoryprocessinParkinson's disease.Netlroscience,20()(),951425,432 5WuDC,JacksonV,VilaM,eta1.Blockadeofmicrogliaactivation isneuroproteetiveintheMPTPrn,ousemodelofParkinsondisease. JNeurosei,2002,22:176,177l 7HeY,AppelS,andLeW.Minocyclineinbibilsmieroglialacliva tionandprotectsnigralcellsafter6-hydroxydopamineinjectioninto IllOUsestriatutT1.BrainRes,200l,909:187,l93 8Sheerl'B,BetarbetR,KimJH,eta1.Selectivemicrogliaactivation inlheratrolenonemodelofIarkinson'sdisease.NeurosciIet1. 2003,341:87,9O 9KimWG.MohneyRP,WilsonB.eta1.RegionaldifferenceinSUN eeptibility1oIip()p0lyaccharid.inducedneurotoxieityintherat brain!roleofmicroglia.JNeuorsei.2000,20:6309,6316 lo黎钢,孙圣刚,董大翠等.小胶质细胞在脂多糖诱导黑质多巴胺能 神经元变性中的作用研究中国组织化学和细胞化学杂志.2003, 12(3):250,254 11BhatNR.ZhangP.LeeJC,eta1.Extracellularsignal—regulated— kinaseandp38subgroupsofmitogen?-activatedproteinkinasesregu— lateinduciblenitricoxidesynlhaseandtumornecrosisfactorgeneex— pressioninendotoxin—stimulatedprimaryglialcultures.JNeurosci, 1998,l8:1533,1641 12l'ikkaT.FiebichBI.GoldsteinsG,eta1.Minocycline,atetracyr dinederivative,isneur0protectiveagainstexcit0t0xicitybyinhibi— ringaclivationandproliferationofrnieroglia.JNeurosci.2001,21: 2580,2588 l3ChoiSH.JoeEH.KimSU,eta1.Thrombin—inducedmicrogliaac— tivationproductsdegenerationofnigraldopaminergicneuronsinvivo . JNeurosci,2003.23:5877,5886 (2005一l2—7收稿)