【doc】粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在大肠杆菌中组成型表达及分离纯化

【doc】粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在大肠杆菌中组成型达及分离纯化 粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在大肠杆菌中 组成型表达及分离纯化 20卷5期 2004年9月 生物工程 ChineseJournalofBiotechnology V01.20No.5 September2004 粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在大肠杆菌中组成型表达及分离纯化 杨志建蔡谨孙健袁中一 (中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所,上海200031) (浙江大学化学工程与生物工程系,杭州310027) (中国科学院大连化学物理研究所,大连116023) 摘要将粪产碱杆菌青霉素G酰化酶基因构建重组表达质粒pKKFPGA,pKKFPGA再转化宿主菌DH5a,所得重组 菌不需诱导便能高效表达青霉素G酰化酶,表达量达2590u/L,比野生型粪产碱杆菌表达量高432倍,其菌体比活力 达300(u/L)/A6oo.菌体破碎后的上清液经DEAE—SepharoseCL6B 离子交换层析和Butyl—Sephar0seCL4B疏水层析, 即可得纯度提高20倍,比活为68.6u/mg的青霉素G酰化酶,两步纯化的总收率达9l%.Westem印迹表明5% 的原前体青霉素酰化酶在胞内形成了包涵体,说明其成熟的限速步骤在胞内的运输阶段. 关键词青霉素G酰化酶,粪产碱杆菌,表达,纯化 中图分类号Q78文献标识码A文章编号lOOO一3o61(2004)05—0736—05 青霉素G酰化酶(penicillinGacylase,E.C. 3.5.1.11,PGA)能催化青霉素G(PG)脱苯乙酰生成 6一氨基青霉烷酸(6-APA)和头孢霉素G(重排酸)脱 苯乙酰生成7一氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA). 6-APA和7-ADCA是半合成J3一内酰胺类抗生素的关 键中间体.近50年PGA酶法水解已取代传统的化 学裂解工艺.目前世界上工业生产6.APA和7-AD— CA的固定化青霉素G酰化酶主要来自大肠杆菌 (Escherichiacoli,Ec)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmega— terium,Bm). 细菌PGA家族成员分为革兰氏阴性菌和革兰 氏阳性菌.前者有大肠杆菌(Escherichiacoli,Ec), 嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌(Kluyveracitrophila,Kc),雷 氏普罗威登斯菌(Providenciarettgeri,Pr),粪产碱杆 菌(Alcaligeliesfaccalis,),无色杆菌木糖氧化属 (Achromobacterxylosoxidans,Ax)与假单胞菌属 (Pseudomonassp.,Ps)等.后者为巨大芽孢杆菌 (Bacillusmegaterium,Bm)与粘节杆菌(Arthrobacter uiscosus,Av).粪产碱杆菌(Af)PGA基因到1994 年才被克隆,同源性比较表明它处于PGA进化过 程一个独立分支.与其他来源的PGA比较,AfPGA 的酶学性质有如下特点:1.AfPGA对底物具有更高 亲和力,对青霉素G的Km值比EcPGA低,比BmP— GA低三个数量级.而其kcat值是所有PGA中最高 的,表现出高活性;2.AfPGA是PGA家族中唯一在 一 级结构中具有链内二硫键的成员,酶的热稳定性 和pH稳定性均很高;3.在手性分子识别能力上, AfPGA比EcPGA有更高选择性;4.AfPGA在有机 溶剂中表现出很高稳定性,在双水相,催化抗生素母 核氨基和苯乙酰胺缩合时,催化效率比EcPGA高一 个数量级’.总之,AfPGA会在半合成抗生素工业 中有很好的应用前景. 我们将AfPGA克隆到含trc启动子的表达载 体,构建了表达质粒pKKFPGA,并在大肠杆菌宿主 中表达,所得重组菌无需诱导即可高表达AfPGA. 1材料和 1.1材料 1.1.1菌种与质粒:大肠杆菌DH5a(遗传特征为 supE44,A/acU169(80/acZ~xM15),hsdR17,re— cA1,endA1,gyrA96,thi-1,relA1),为本室保存. pKKCAI1[53,pKK235衍生质粒,含有lacz核糖体结 合位点,trc启动子与rrnB转录终止子,不含lacI 等位基因,无需IPTG诱导即可在不含lacI的宿主 收稿日期:2004一叭一l7,修回日期:2004—04.05. *通讯作 者.Tel:86.21—54921243;Fax:86—21—54921011;E—mail:zyyLlan@sib s.ac.cn 5期杨志建等:粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在大肠杆菌中组成型表达及分离纯化737 菌中表达.pSU2718,亚克隆质粒.质粒均由本所王 恩多研究员惠赠. 1.1.2酶和其他试剂:核酸工具酶购自TaKaRa公 司,DEAE.SeharoseCL6B和Butyl—SeoharoseCL4B 购自Pharmacia公司,其他试剂均为国产或进口分析 纯试剂,PCR引物由赛百盛公司合成. 1.1.3培养基:(a)LB培养基:蛋白胨lOg,酵母膏 5g,NaC1lOg,补水至IL,调pH7.0.(b)发酵培养基 (FM):蛋白胨lOg,酵母膏5g,Mgso?7H2OIg, KH2PO42g,K2HPO!’3H2O5g,Na2HPO4’12H2O7g, (NHJ)2SO,I.2g,NH4C10.2g,NaC10.Ig,补水至IL. 1.2方法 1.2.1表达质粒pKKFPGA的构建:引物I(5一 GCATCCATGGTGAAAGGGCTGGTrCGT一3)引入NcoI 酶切位点,与引物2(5’-ccggatccctaaggctgaggctgaatc一3) 通过PCR方法从载体pETAPGA上扩增得到AfPGA 基因克隆到经SmaI线性化质粒pSU2718,得到质 粒pSUFPGA.pSUFPGA以NcoI,Hind11I消化,将获 得的AfPGA基因连接到NcoI,Hind?消化的载体 pKKCAII中,得到重组表达质粒pKKFPGA.重组质 粒中,AfPGA基因依靠trc启动子,自身表达元件以 及rmB转录终止子而表达,然后依靠信号肽引导 AfPGA分泌到周质空间.重组质粒转化表达菌 DH5a得菌株DH5a/pKKFPGA. 1.2.2重组菌DH5a/pKKFPGA组成型表达AfPGA: DH5a/pKKFPGA接种至3mLLB液体培养基中, 37cI=,250r/min过夜培养.以I:100接种量接种到 50mL发酵培养基.28oC,250r/rain振荡培养至A 为2.5左右. 1.2.3完整细胞酰化酶活力的测定:采用NIPAB方 法.菌体离心,重悬于50mmol/L磷酸缓冲液pH7.5, 取10/~L重悬液,加入500/~L50mmol/L磷酸缓冲液 pH7.5,37cI=保温.再加入ImL37cI=预热的ImL 0.9mg/mL6-硝基一3.苯乙酰氨基苯甲酸(NIPAB)溶 液.反应4min,加入ImL95%乙醇终止反应.反应 液在室温以6000×g离心2min,取上清测定405nm 吸光度.空白为不加酶反应液.酶活力定义:在上 述反应条件下,1min水解1tLmol的NIPAB所需青霉 素酰化酶为1u.酶的菌体比活力定义为每升每A 菌体所具有的酶活力单位. 1.2.4AfPGA的分离纯化:菌体重悬于50mmol/L磷 酸缓冲液,冰浴中超声破碎菌体(BransOnSonifier 450,50%间隔,50%输出),离心(12O00r/min 15min),上清即为MPGA粗酶液.粗酶液引入磷酸 缓冲液(50mmol/L,pH7.8)预平衡DEAE—SepharoseCL 6B柱,上柱后用平衡缓冲液洗至基线稳定.Aff~A 不被吸附而流出.流出液边搅拌边加固体 (NIL)so,至Imol/L后,加入50mmol/L磷酸缓冲液 pH7.8一Imol/L(NH4)2SO,预平衡Buty1.SepharoseCL4B 柱,分步洗脱,在(NH4)sO浓度为0的磷酸缓冲液 洗脱获得AfPGA. 1.2.5Westernblot分析:1mL菌体破碎液离心,沉 淀部分溶于200/~L上样缓冲液,上清液以I:I比例 加入上样缓冲液,沸水浴5min.分别取15”L上清上 样液和5L沉淀部分上样液进行Westernblot分析, 一 抗为兔抗,二抗为碱性磷酸酶标羊抗兔]gG.操 作按文献[7]进行. 1.2.6蛋白浓度的测定:按Bradford法,以牛血清蛋 白为蛋白,操作见文献[7]. 2结果 2.1At1~A表达载体的构建与鉴定 引物I和2经PCR扩增得到含信号肽的AfPGA 基因片段,该片段连接到SmaI酶切的pSU2718得 pSUFPGA,pSUFPGA以NcoI,胁ndH1消化,将获得 的AfPGA基因连接到NcoI,Hind?消化的载体 pKKCAII中,获得表达质粒pKKFPGA(图I).NcoI 和Hind?双酶切和PCR扩增均能得到2500bp左右 的片段,大小与理论MPGA基因大小一致. 图1重组质粒pKKFPGA图谱 Fig.1PlasmidofpKKFPGA 2.2AflPGA的表达 理论上,低温培养有利于酶蛋白多肽链内二硫 键的形成及降低包涵体的形成,因而将菌株DH5td pKKFPGA在低温28cI=进行培养.实验中发现LB培 养基对表达不利,这可能由于LB培养基pH缓冲能 力差.以NaOH或HC1调节LB培养基成不同pH, 考察不同初始pH的LB培养基对重组菌表达的影 响,结果列于表l,当初始pH7.0,MPGA的表达量 最高.发酵培养基(FM)中,重组菌DH5a/pKKFPGA 生物工程20卷 在发酵过程中,pH基本维持7.5左右.在添加糊精 的发酵培养基中,AfPGA表达量可达2590u/L,比野 生型Alcaligenesfaecalis表达量高432倍. 表1不同培养基中AfPGA的表达量 Table1ComparisonofAfPGAproductionbetween differentculturemedium 2.3AfPGA的分离纯化 菌体超声破碎后,胞内核酸释放出来,pH降为 7.8,离心,上清即为粗酶液.粗酶液引入磷酸缓冲 液预平衡的DEAE.SepharoseCL6B柱,AfPGA由于不 被吸附而直接流出,大部分杂质则被吸附除去(如图 2).直接流出的蛋白峰为AfPGA活力峰.流出液 加入固体(NH4)s0至1mol/L后加入磷酸缓冲液. 1mol/L(NH4),S04预平衡的Buty1.SepharoseCL4B柱. AfPGA在Buty1.SepharoseCL4B上疏水吸附,当 (NH4)S04浓度降低时,它们之间的疏水作用减弱而 解吸.采用分步洗脱,在(NH4)s0浓度为0时收集 洗脱峰5,为AfPGA(图4). .1 人Ih{,_??,,,图2离子交换色谱纯化Att~A Fig.2IonexchangechromatographyforAtt~Apurification Peak1:AfPGA;Peak2:impurities 图3疏水层析色谱纯化Att~A Fig.3Hydrophobicinteractionchromatography forAtt~Apurification Peak1,Peak2.Peak3andPeak4:impurities;Peak5:AfPGA 经过这两步纯化,AfPGA得率为9l%,酶的纯化倍 数提高了20倍(表2),纯化的AA进行SDS. PAGE,考马斯亮蓝染色呈两条带,分别对应AA 的a和p亚基(图4),软件扫描显示其纯度大于 95%. 表2AfPGA的纯化 Table2PurificationofAfPGAfromtherecombinantDItSoJpKKFPGA 2.4Westernblot分析AfPGA的表达 刚产生的PGA是无活性的前体蛋白,包括信号 肽,a亚基,连接肽和p亚基,其成熟过程为原前体 PGA(preproPGA)肽链经信号肽引导,跨过细胞膜被 运输到周质空间.此过程中,信号肽被切除.随后, 前体PGA肽链(proPGA)自催化切割内部连结肽,形 成a亚基和B亚基正确折叠成有活性的PGA.在大 肠杆菌中过量表达PGA时易导致preproPGA和 proPGA分别在胞内和周质空间形成包涵体. 将上清和沉淀部分进行Westernblot分析,分析 AfPGA是否过量表达形成包涵体.菌体破碎,上清 及沉淀部分加入上样缓冲液后(见1.2.5),上清样 品体积为2000FL,沉淀部分样品体积为200FL,分别 取15FL上清样品和5FL沉淀部分样品进行Western 5期畅志建等:粪产碱杆菌青霉素c酰化酶在大肠杆菌中组成型表达 受分离纯化 4Afi~.A的SDS-.PAGE电诛 Fig4SD~PAGEanMyslsofpurifiedAff’GA :~,tandsrd1IuI…IaJ1purifiedAfPGA :3subanil;…subunil blot分析.,按破碎后上清样品体积与沉淀部分样品 体积比计算,上清样品上样量为沉淀部分样品上样 量的30%【)=图6显示,苗体碎片内含有 包涵体,条带色度约为AfPGA条带色度的15%.按 上样量折合成全细胞破碎液,其色度为AfPGA条带 色度的5%,表明大部分原前体MPGA【prepmAIPGA) 已被运输到周质空间进行加工.上清中无包涵体威 分,说明周质空间所含有的前体AfPGA(pmMPGA) 全部正确加工折叠成有活性的AITGA.沉淀部分含 有包涵体.表明了AfPGA成熟的限速步骤在胞内的 运输阶段,这可能因为表达载体高拷贝复制子,强启 动子及强终止子导致胞内形成了过量的Afl~].AmR. NA,mRNA翻译成的preproAfPGA无法及时转运到周 质空间而导致在胞内积聚形成包涵体这预示着可 以通过改善信号肽的分泌能力或改善AfPGA的合 成流等方法进一步提高活性酶的表达量. 3讨论 AfPGA所具有的酶学性质预示其在水解青霉素 G与重排酸生产6-.MJA与7-ADCA+以及合成半合成 阿莫西林与半合成头孢霉素工业中良好的应用前 景周政等将AIPCA基因克隆到Det表达系统得 pETAPC-A,该基因在大肠杆茁】M109/DE3中表达需 IPTG诱导,其表达量为150u/L.Deak等将AfPGA 基因克隆到一高拷贝数,鼠李糖启动子,Ap抗性的 载体上,重组质粒转化大肠杆菌经鼠李糖的诱导, 围5We~terablot分析重组菌DHSa/pKKFPGA 的表达产物 Fig5Westernblotanalysisoftheproductofthe~sombinan! ptasmJdpKKFPGAex大 肠杆菌的高密度发酵可进一步提高MPGA的表达, 此研究正在进行中 本研究提供了简单快捷的纯化AIPGA的方法, 细胞破碎液的离心上清无需硫酸铵沉淀和透析,可 直接进行DEAE—SephamseCL6B离子交换层析 PGA在交换柱上不吸附.大部分杂质被吸附除去 拄上流出液加人固体硫酸铵达Imol/L后进行Butyl— SepharoseCL4B疏水柱层析经过这两步纯化,即 可得纯度大于95%的AfPGA,总收率为9I%. 文献[10.11]报道重组细胞内包涵体的形成会 遏制活性PGA的高表达..而包涵体的形成太多可 归因于表达载体含有过高拷贝复制子及强启动子+ 强终止子,导致蛋白过量表达周志雄等尝试 共表达6基因或degP基因,减少包涵体的形成, 提高了EePGA的表达量与其他种属PGA在大肠 杆菌中表达形成包涵体类似,菌株DH5n/pKKFPGA 表达AfPGA时.在胞内形成了包涵体,但其含量不 高,占总PGA的5%,表明大部分原前体AfPGA被运 输到周质空问进行正确加工这解释了AIPGA为 什/厶在菌株DHSa中获得了高表达.. REFERENCES(参考文献 ljOu蛆W.SmlnGaey~e,ageneencodingthesame帅da method(orthepnMuctionofthisem~=me:USpatent.56959781994- 4-15 2JSvedasVtD,,Lc’Kineticstudyt~,icU? 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Keywordspenicillinacylase,Alcaligenesfaecalis,expression,purification Received:01.17.2004 *Correspondingauthor.Tel:86-21-54921243;Fax:86-21-54921011;E-mail:~O’uan@sibs.ac.cn