为了正常的体验网站,请在浏览器设置里面开启Javascript功能!

转染HCN4基因的犬骨髓间充质干细胞同种异体移植对传导阻滞心脏电生理变化影响

2017-09-18 37页 doc 72KB 29阅读

用户头像

is_083599

暂无简介

举报
转染HCN4基因的犬骨髓间充质干细胞同种异体移植对传导阻滞心脏电生理变化影响转染HCN4基因的犬骨髓间充质干细胞同种异体移植对传导阻滞心脏电生理变化影响 转染HCN4基因的犬骨髓间充质干细胞同种异体移植对 传导阻滞心脏电生理变化影响 分类号 R5 密 级 公 开 学 号 1002009023 学校代码 90031 博士学位论文 转染HCN4 基因的犬骨髓间充质干细胞同种异体移植对传 导阻滞心脏电生理变化的影响* 魏 璐 指 导 教 师 宋治远 教授、主任医师 导 师 组 成 员 培 养 单 位 第三军医大学西南医院心内科 临床医学 申请学位类别 博士专业学位 专 业 名 称 内...
转染HCN4基因的犬骨髓间充质干细胞同种异体移植对传导阻滞心脏电生理变化影响
转染HCN4基因的犬骨髓间充质干细胞同种异体移植对传导阻滞心脏电生理变化影响 转染HCN4基因的犬骨髓间充质干细胞同种异体移植对 传导阻滞心脏电生理变化影响 分类号 R5 密 级 公 开 学 号 1002009023 学校代码 90031 博士学位 转染HCN4 基因的犬骨髓间充质干细胞同种异体移植对传 导阻滞心脏电生理变化的影响* 魏 璐 指 导 教 师 宋治远 教授、主任医师 导 师 组 成 员 培 养 单 位 第三军医大学西南医院心内科 临床医学 申请学位类别 博士专业学位 专 业 名 称 内科学(心血管病) 论文提交日期 2013 年 04 月 论文答辩日期 2013 年 05 月 答 辩 委 员 会 主 席 曾智 评 阅 人 姜红、冯丽萍、陈丰原、覃数、王旭开 二一三年五月 * 1.国家自然科学基金项目 30871060 2.重庆市自然科学基金项目 2008BA5005 第三军 医大学研 究生 学位论文独创性声 明 论文 我 秉承学校严谨的校风和科研作风,本人 申明所呈交的 是 本 工 成 。 我 ,除 了 据 取得 研 果 所知 人 进 的研 作及 的 究 在导师指导下 行 究 文中特别加 以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人 已经发表或 撰写过的研究成果,也 不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证 ,与 我同工 的同志 本研究所做 的任何 贡献均 已 而 过 材 作 对 书 使用 的 料 论文 作 了明确 的说明并表示谢意。 在 中 论文 若 不 之 ,本人承担一切相关责任。 申请学位 与资料 有 实 处 ?? : 招b 日 :冫岵 f?? 论文作 签 咳‰ 期 者 名 叩 第三军 医大 学研 究生 学位 论文版权使 用授权 书 人完全 了 第三军医大学有关保护知识产权的规定,即 :研究 本 解 工 三 医 大 。 人 生 学 期间论文 作的知识产权单位属第 军 学 本 保 在攻读 位 证毕业离校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第三军医 。 留 向国家 关部 门或机构送交论文的复印件和 磁 大 校 保 并 有 学 学 有权 。 公 全 或 ,允 查 校 以 学 论文的 部 部分 内 盘 许论文被 阅和借 阅 学 可 布 位 保密 ,可 以 用影 、 或其他手段保存论文。 容 内容除外 采 印 缩 印 论文作者签 指导教师签 日 ― ― ― 20― 目 录 缩略语 表.............................................................................................................................. 1 英文摘 要.............................................................................................................................. 2 中文摘 要.............................................................................................................................. 5 论文正文 转染小鼠 HCN4 基因的犬骨髓间充质干细胞同种异体移植对传导 阻滞心脏 电生理变化的影 响........................................................................................... 9 第一章 前 言 .......................................................................................................... 9 第二章 慢病毒载体介导小鼠 HCN4 基因转染的犬骨髓间充 质干细胞体外电生理特 性研 究..............................................................................................................14 2.1 材料与方 法..........................................................................................................14 2.2 结 果 .............................................................................................................21 2.3 讨 论 .............................................................................................................29 第三章 mHCN4-cMSCs 同种异体移植增强完全性房室传导 阻滞模型犬心室自律性 .........................................................................................................................33 3.1 材料与方 法..........................................................................................................33 3.2 结 果 .............................................................................................................49 3.3 讨 论 ...............................................................................................................60 第四章 同种异体移植mHCN4-cMSCs 对传导阻滞犬心室致 心律失常易感性改变 的影 响..............................................................................................................66 4.1 材料与方 法..........................................................................................................66 4.2 结 果 .............................................................................................................74 4.3 讨 论 .................................................................. ...........................................81 全文总 结 .........................................................................................................................84 本研究局限 性 .................................................................................................................85 参考文 献 .........................................................................................................................86 文献综述 HCN 通道与心脏生物起搏研究进 展.............................................................95 参考文 献 .......................................................................................................................101 攻读学位期间公开发表或已接收论 文............................................................................104 致 谢...........................................................................................................................105 第三军医大学博士学位论文 缩略语表 缩略词 英文全称 中文全称 bpm beat per minute 每分钟 搏动次数 CHB complete heart block 完全性 心脏传导阻滞 cMSCs canine mesenchymal stem cells 犬骨髓 间充质干细胞 CX43 connexin 43 缝隙连接蛋白 43 cDNA complementary deoxyribonucleic acid 互补脱氧核糖核酸 DAPI 4’6-diamidino-2-phenylindole 4,6- 脒基-2-茚二酮 DPT diastolic pacing threshold 舒张期起搏阈值 EDTA ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸 EGFP enhanced green fluorescent protein 增强型绿色荧光蛋白 FCS fetal calf serum 胎牛血清 HCN4 hyperpolarization- activated cyclic 超极化激活环核苷酸 nucleotide-gated cation channel 门控阳离子通道 If funny current 起搏电流 Lv-EGFP-mHCN4 lentivirus vector encoding 表达 mHCN4 和 EGFP mHCN4 and EGFP 的慢病毒载体 Lv Lentivirus 慢病毒 mHCN 4 mouse HCN4 小鼠 HCN4 MAPD90 monophasicactionpotential duration 单项 动作电位时程 ΔMAPD absolute difference of VERP 单项动作电位时程差值 MOI multiplicity of Infection 感染倍数 OD optical density 光密度 PBS phosphate buffer saline 磷酸缓冲液 Pfu plaque forming unit 噬斑形成单位 PES programmed electrical stimulation 程序电刺激 VERP ventricular effective refractory period 心室有效不应期 ΔVERP absolute difference of VERP 心室 有效不应期差值 VVP ventricular vulnerable period 心室易 损期 VFT ventricular fibrillation threshold 室颤阈 值 1 第三军医大学博士学位论文 Alteration of the ventricular electrophysiology by allografting mouse HCN4 transfected canine mesenchymal stem cells into conduction blocked heart Abstract Object The field of biological pacing is entering its second decade of active investigation. The princple was to employ both gene-based and cell-based methodologies and taken distinct approaches to achieving automaticity pacemaking fuction in heart with bradycardiac- arrhythmia. Here we study the ability of mesenchymalstemcells MSCs as delivery platforms which have been loaded with genes of interest to reconstruct biological pacemaking function in animals. This study was conducted under the long-term research of HCN4 gene and MSCs in our department and combined with the advanced achievements of biological pacemaker nowadays. The following list are what we had explored in this study. 1.To construct pacemaker-like cells by transfection of mouse HCN4 gene into canine mesenchymal stem cells cMSCs with pysiological pacemaking function 2.To assess the capability of the mHCN4 modified cMSCs to reconstruct biological pacemaker fuction in vivo by transplanting them in dogs with experimentally induced complete heart block and electronic pacing. 3.To assess the effect of mHCN4 modified cMSCs transplantation on cardiac electrophysiology in dogs with experimentally induced complete heart block and electronic pacing. Methods 1. We packaged lentivirus vector Lenti6.3-IRES2-EGFP-mHCN4 or Lenti6.3- th IRES2-EGFP with 293T cells to get lentivirus supernatant.Then the 2-3 passages of cMSCs were transduced by EGFP-mHCN4 or EGFP. Expression of GFP was detected by fluorescence microscope and expression of HCN4 was detected by immunofluorescent staining.Patch clamp was performed to evaluate the electrophysiological properties of the positively transfected cells. 2 第三军医大学博士学位论文 2. Complete atrioventricular block CAVB was induced in adult dogs by radiofrequency ablation of His bundle with backup electronic pacemaker implanted subcutaneously. After 1 week recovery,certain amount of cMSCs transfected with mHCN4 mHCN4- cMSCs or not EGFP-cMSCs were injected subepicardially into the left ventricular anterior wall of these dogs. Overdrive pacing was performed at the injection site,followed by marking with suture. 3. The ventricular automaticity was evaluated by 24-hour animal Holter,six-lead surface ECG,electronic pacemaker log record,HRV analysis , catecholamine responsiveness test and physical exercise responsiveness.Expression of HCN4 was detected by HE staining ,immunofluorescence and Western blot. 4. Cardiac electrophysiology was measured in intact canines by epicardially programmed electrical stimulation PES in different sites injection sites, right ventricular anterior wall,and left ventricular free wall near apex .The following listed electrophysiological parameters was measured through PES: diastolic pacing threshold DPT , ventricular effective refractory period VERP , absolute difference of VERP ΔVERP , monophasic action potential duration MAPD , absolute difference of MAPD ΔMAPD , ventricular fibrillation threshold VFT . Then certain amount of mHCN4-cMSCs or normal cMSCs or saline were injected subepicardially into the left ventricular anterior wall of the animals. The injection site was marked with suture,and the animals were divided into HCN4 group, control group and saline group as the different treatment. 5. After 1-week recovery, animals of control and HCN4 groups were interventioned into complete atrioventricular block CAVB . ECG was recorded by 24-hour ECG monitoring throughout the following 4-weeks study. Then PES was performed again to measure the ventricular electrophysiology. Histology study and immunochemistry methods were used to evaluate the changes in gap junction properties between canines treated with the different substance. Results 1. The transfection efficiency of passage 3-4 cMSCs were about 65% and the expression of HCN4 was confirmed by immunofluorescent staining.And the expression of HCN4 was quite strong after several rounds of generation. 3 第三军医大学博士学位论文 2. By using the whole cell patch clamp we recorded a time- and voltage-dependent inward current which was fully activated when hyperpolarized at -160 mV and completely deactivated at +20 mV in mHCN4-cMSCs.The current was suppressed by extracellular Cs+ and increased by intracellular cAMP which is similar to I current. f 3. At 2 weeks, the imum heart rate and the number of impulses generated from the injection sites was much higher in dogs injected with HCN4 modified MSCs dogs than in control dogs. Basal heart rate increased in the HCN4 group and became fully stabilized by Week 4, evidenced by markedly reduced numbers of electronic pacemaker beats. At Week 2, HRV during exercise was significantly higher in HCN4 dogs than in controls. HRV in the control group remained at a low level throughout the observation period. 4. HE staining,immunofluorescence stainning and western blot proved that cMSCs survive and express HCN4 protein in situ in heart of HCN4 dog. 5. PES results showed that the ventricular electrophysiological parameters including DPT,VERP,ΔVERP,MAPD and ΔMAPD were all increased at 4 weeks after CHB induced,but the VFT decreased. The parameters of dogs injected with mHCN4- -cMSCs were higher comparing to the dogs injected with EGFP-cMSCs. EGFP At the same time,ΔVERP and ΔMAPD in dogs injected with cMSCs were significantly higher than the ones injected with saline. Conclusion 1.Mouse HCN4 can be introduced into MSCs cultured in vitro. Pacemaker current had been recorded from mHCN4-cMSCs and EGFP-cMSCs by patch clamp study. 2.Transplantation of mHCN4 modified cMSCs provided a stable biological pacemaking function that allowed an appropriate chronotropic response to physical exercise and catecholamine for up to 6 weeks. 3.Injection of cMSCs loaded with mHCN4 into myocardium can achieve biological pacemaking function and alleviate alteration of ventricular electrophysiological properties in canine with CAVB. Keywords:Biological pacemaker ,HCN4 gene ,Gene therapy,Cell therapy, Mesenchymal stem cells ,Heart rate variability, Cardiac electrophysiology 4 第三军医大学博士学位论文 转染小鼠HCN4 基因的犬骨髓间充质干细胞同种异体移 * 植对传导阻滞心脏电生理变化的影响 摘 要 背景与目的: 生物起搏 Biological Pacemaker 是利用细胞技术和基因技术, 将目的基因 起搏 基因或可促进心脏自主节律的基因 直接导入心脏或者利用各种起搏/非起搏细胞将起 搏电流传递至疾病的心脏,使其能在局部发挥其接近生理状态的起搏或提高心率的作 用。本研究拟通过基因转染技术和细胞治疗技术,利用骨髓间充质干细胞 MSCs 作为 传递起搏电流的细胞平台,试图在动物体内 “构建”生物心脏起搏器,以 探索治疗缓 慢型心律失常疾病的新方法。本研究是在本课题组前期研究的基础上,结合国内外这 一领域研究的最新成果,就小鼠HCN4 基因 mHCN4 转染犬骨髓间充质干细胞 cMSCs 同种异体移植对完全性房室传导阻滞 CAVB 心脏电生理改变的影响进行探索。包括以 下三方面内容: 1 利用携带 mHCN4 基因的慢病毒载体 Lentiviral-mHCN4 ,将 mHCN4 基 因 转 染 到 cMSCs , 体 外 构 建 可 表 达 功 能 性 起 搏 通 道 的 起 搏 样 干 细 胞 Lv-mHCN4-cMSCs ; 2 将构建好的起搏样干细胞 mHCN4-cMSCs ,同种异体移植到 已植入电子心脏起搏器的 CAVB 模型犬心室肌内,通过监测全天心律、运动变时性研 究、神经递质反应性研究、组织学和分子生物学等,细胞移植对传导阻滞心脏心 室自律性的影响; 3 将 mHCN4-cMSCs 同种异体移植到 CAVB 模型犬心室肌内,观 察其对传导阻滞心脏的致心律失常相关电生理参数的改变有无影响,以探索和评价利 用 mHCN4-cMSCs 心室移植增强传导阻滞心脏生物起搏功能的安全性和临床应用可行 性。 方法: 1.利用构建好的 Lentiviral-EGFP-mHCN4 慢病毒载体进行 293T 细胞病毒包装,将 mHCN4 基因转染到第 2-3 代 cMSCs,得到 Lentiviral-EGFP-mHCN4-cMSCs HCN4 组细 胞,以下简称mHCN4-cMSCs ;对照组cMSCs 只转染Lentiviral-EGFP , 得到EGFP-cMSCs 。 待荧光显微镜观察到两组 cMSCs 稳定表达 HCN4 通道蛋白和绿色荧光蛋白 GFP 后,利 * 1.国家自然科学基金项目 30871060 2.重庆市自然科学基金项目 2008BA5005 5 第三军医大学博士学位论文 用全细胞膜片钳技术对两组转染阳性的 cMSCs 进行通道电生理学研究。 2.取成年犬射频消融希氏束建立完全性房室传导阻滞 CAVB 动物模型,并在颈部 皮下植入电子起搏器。1 周后对模型犬进行开胸手术,将 mHCN4-cMSCs HCN4 组 或 EGFP-cMSCs 对照组 悬液斜行注入左心室前壁 第一对角支和第二对角支之间区域 处心外膜下,并在该处心外膜进行超速起搏,做好标记。 3.术后对各组模型犬的心室自律性和移植部位组织目的基因蛋白表达进行综合检 测和分析。主要采用体表心电图 QRS 波形分析、24 小时动态心电图心律变化、 起搏器活动日志记录分析、其对于神经体液调节和体能运动的反应能力评估心室自律 性变化;用组织病理学 HE 染色、免疫组织荧光染色技术和 Western Blot 分子生物学 技术等多项技术方法对细胞移植后体内存活和目的基因蛋白表达进行检测。 4.另取健康成年犬开胸,于心外膜直视下用程序电刺激 PES 的方法测定其各局部 左室前壁拟注射细胞部位、右室前壁、左室游离壁下部 心脏电生理基础参数,包括: 舒张期起搏阈值 DPT 、心室有效不应期 VERP 、心室有效不应期差值 ΔVERP 、单 项动作电位时程 MAPD 、单项动作电位时程差值 ΔMAPD 、室颤阈值 VFT 。测定 之 后 做好 注 射 部 位 标 记 ,在 标 记 处 附 近 注 射 mHCN4-cMSCs HCN4 组 、 EGFP-cMSCs cMSCs 对照组 和生理盐水 盐水组 ,然后关胸。 5.1 周后对 HCN4 组和细胞对照组犬制备 CAVB 模型,盐水对照组不进行 CAVB 制作,术后每 96 小时检查 24 小时动态心电图。4 周后各组再次开胸行 PES 测定心脏 电生理参数,处死动物,取材利用组织病理学 HE 染色、免疫组织化学染色、western blot 技术检测移植部位细胞存活和 HCN4 蛋白表达及移植部位边缘心室肌缝隙连接蛋白 43 CX43 表达情况。 结果: 1. 慢病毒载体 Lentiviral-EGFP-mHCN4 经包装后转染第 3-4 代犬骨髓间充质干细 胞的转染阳性率约为 65%,经免疫荧光染色技术测定其膜表面可表达 HCN4 蛋白,经 多次传代后细胞生长状态依然良好,仍可表达 HCN4 蛋白。 2. 利用全细胞膜片钳技术对转染阳性的细胞进行电生理研究,能够记录到类似 If 特性的细胞膜通道离子电流。该电流具备超极化钳制电压激活和时间依赖的特点,对 细胞内 cAMP 反应良好,符合起搏电流 If 的典型特征。而 EGFP 对照组细胞 转染 lentiviral-EGFP 检测不出类似特性的电流。 3. 将mHCN4-cMSCs HCN4 组 和EGFP-cMSCs 对照组 移植到已植入电子心脏起 搏器的 CAVB 模型犬的左心室心外膜下。在移植后第 2 周内,24 小时动态心电图及 6 第三军医大学博士学位论文 每周体表心电图检查提示 HCN4 组 8 只犬中有 6 只出现起源于左室的自主心律,占总 心搏数的比例高于 60% ;并且在第 2 周末时犬运动时最大心率达到最高 103?12 bpm 对 50?3bpm ,同时休息时的静息心率和平均心率也随着时间逐渐增照组为 加,到第 4 周 时趋于稳定 基础心率 55?6 bpm,平均心率 59?5 bpm 。且明显高于对照组对应心率 指标 基础心率 27?2 bpm,平均心率 38?2 bpm 。HCN4 组电子起搏率从第 2 周开始 下降,到第 4 周时下降至 6?2% ,而对照组则为 57?7% 。通过神经递质反应性测试证 实,这一异位起搏心律对阿托品无明显反应,但对肾上腺素反应良好,同时对生理性 体能运动也有良好的变时性。 4. 用组织病理学、免疫荧光化学染色和分子生物学技术检测细胞移植部位的心室 肌标本,证实移植的 MSCs 细胞能够在移植部位存活至少 6 周,局部未发现明显的细胞 凋亡坏死和免疫排斥反应。免疫荧光组织化学研究证实异体移植的 MSCs 细胞能够在 移植部位有效表达 HCN4 通道蛋白,且其表达量明显超过注射未转染基因的对照组。 5. 心脏电生理参数测定结果显示犬在模型制备前各组间参数无显著差异;细胞移 植+CAVB 模型后 4 周细胞对照组 QT 、QTc 、DPT 、VERP 、MAPD 显著高于盐水对照 组 P ,0.01 和 HCN4 组 P ,0.05 ,ΔVERP 、ΔMAPD 显著高于盐水对照组 P ,0.01 , VFT 低于盐水对照组 P ,0.01 和 HCN4 组 P ,0.05 ;HCN4 组 ΔVERP 、ΔMAPD 显 著高于细胞对照组 P ,0.0 1 ,VFT 高于细胞对照组 P ,0.05 。 结论: 1(利用慢病毒载体可在体外稳定转染 mHCN4 基因至犬骨髓间充质干细胞。转染 阳性的细胞可稳定表达 HCN4 通道蛋白。全细胞膜片钳技术对转染阳性细胞进行膜通 道电流检测,证实其在体外培养环境下可表达对 cAMP 反应敏感的起搏样电流 IHCN4 , 因此我们把这种细胞称为起搏样干细胞 mHCN4-cMSCs 。 2 (将 mHCN4-cMSCs 同种异体移植到完全性房室传导阻滞犬心室肌后,能在机 体内存活达 6 周,且在体内继续表达 HCN4 蛋白,并可有效提高移植部位的室性自主 节律,减少电子起搏器依赖,并且这种生物起搏心律具有良好的变时性和神经递质反 应性。 3 (健康犬在心脏传导阻滞后其心室电生理特性明显改变,各致心律失常敏感性指 标均高于健康状态;在心室心外膜下移植 mHCN4-cMSCs 可部分减轻传导阻滞后心室 电生理特性的改变,并且移植部位边缘心室肌缝隙连接蛋白的表达高于移植普通 cMSCs 的对照组和注射生理盐水的空白组。 4. 通过转基因技术和骨髓间充质干细胞移植相结合,能够传递起搏电流至心脏, 7 第三军医大学博士学位论文 提高完全性房室传导阻滞后的心室率,且一定程度上可以减轻心动过缓心脏的电活动 不稳定性。 关键词:HCN4 基因,骨髓间充质干细胞,生物起搏,心率变异性,基因治疗, 细胞治疗,心脏电生理 8 第三军医大学博士学位论文 转染小鼠HCN4 基因的犬骨髓间充质干细胞同种异体移 植对传导阻滞心脏电生理变化的影响 第一章 前 言 缓慢型心律失常 Bradyarrhythmias 是临床常见的一类以心率减慢为特征的心脏疾 病。多由心肌炎症或心肌缺血坏死等原因导致心脏传导系统功能减退,或系原发性心 脏传导系统退行性变,导致心脏窦房结自律性低下及传导系统传导功能阻滞 包括窦房 传导阻滞、心房内传导阻滞、房室传导阻滞等 。这类患者由于心率减慢及心输出量减 少,常出现头昏、乏力、失眠及心功能不全所致各种症状,严重者可造成大脑血液灌 流不足而发生反复晕厥,甚至猝死。目前,临床治疗缓慢型心律失常的标准治疗 为植入人工心脏起搏器。心脏起搏器植入术用于临床已有 50 多年的历史,如今人工心 脏起搏器的结构及功能已达到了一个相当高的水平,能根据机体需要相应地调节起搏 频率的电子起搏器 频率应答型心脏起搏器 及具有心脏起搏与除颤功能的埋藏式自动 除颤装置 ICD 已在临床广泛使用,并挽救了数百万患者的生命。尽管如此,植入电子 [1] 起搏器仍然存在一些难以克服的缺陷和问题 ,包括:?心脏起搏器植入部位囊袋出 血、感染及心肌穿孔等;?电池寿命有限,需定期更换;?外来强磁场作用会干扰心 脏起搏器功能,故不能接近强磁场;?心内电极断裂或脱落的风险;?长时 间单一局 部起搏带来的收缩功能障碍甚或发生心力衰竭;? 对于儿童患者,植入的电极无法适 应患儿身体生长而需要重新植入电极及反复更换起搏器,使患者产生心理负担等。因 此,医学工作者们很早就提出设想,希望在未来能构建出一种安全、稳定、经济的生物 起搏技术,以替代人工心脏起搏器治疗。 生物起搏 Biological Pacemaker 的概念是:利用生物学及其相关技术,对受损的心 脏自律性起搏点或传导系统进行组织修复或重建,以尽可能恢复心脏的自主节律和冲动 传导 [2, 3] 。为了弥补甚至替代现有的植入人工心脏起搏器的治疗手段,理想的心脏生物 起搏器应该优于具备以下特点: 1 在起搏效果不亚于电子起搏器的前提下,它不需要 电池、电极,可以使用终身; 2 不仅自身起搏节律稳定,而且能受自主神经系统调节, 适应机体运动和情绪改变的需要; 3 可以植入在心脏自身的传导通路上以模拟符合生 理需要的冲动传导,不至于影响心脏收缩和输出功能; 4 无致心律失常、炎症、感染 和成瘤的风险; 5 对于还在生长期的儿童患者,能够适应机体生长发育需要。 9 第三军医大学博士学位论文 根据这一要求,科学工作者致力在生物起搏领域研究了 10 多年,其中基因治疗和 细胞治疗技术的研究进展被广泛应用在生物起搏领域。这些研究工作的基本原理是: 构建一种能够模拟心脏的生物节律和生物活性的生物起搏器,并且该起搏器能与周围 心肌组织建立生物电联系,传导电活动到特定位置,从而能激活心脏的传导系统。因 此,构建生物起搏器的关键问题在于: 1 构建一种能自主启动和发放电信号的 “触发 器”,即自身具备起搏功能或通过导入外来基因产生自主起搏功能的单个或多个细胞; 2 起搏器的周围环境必须存在能够接收起搏信号并向外传导和放大起搏信号的细胞; 3 在起搏细胞与接收起搏信号的细胞之间必须存在电传导的通路,如缝隙蛋白等。 [3] 目前构建生物起搏器的策略有:基因点燃起搏和细胞点燃起搏 。前者是直接将 基因导入活体的心脏,原本无起搏功能的心脏细胞在转染了基因后产生起搏电流;后 者是利用自身能够产生起搏电流的细胞或体外构建可以表达起搏电流的细胞,将细胞 移植到心脏后产生起搏功能。而用于传递起搏电流或基因的系统或技术有: 1 基因传 递系统包括:质粒、病毒; 2 细胞传递系统包括:细胞平台、胚胎细胞、胚胎干细胞、 多能干细胞; 3 化学和生物材料支撑体系:细胞融合、生物结构材料、生物示踪材料。 因此,选择的起搏基因和传递电流的细胞显得尤为重要。 具备起搏功能的心肌细胞与普通工作心肌细胞不同,其电生理学特性在 于动作电 位 4 期的自动除极 即舒张期除极 ,是指在心室舒张期,起搏细胞的膜通道内向电流 逐渐增加或外向电流减弱,达到一定程度后,心肌细胞就开始逐渐去极化,当达到阈 电位水平时,动作电位随之而生。目前大量研究已证实,其内向电流主要构成成分为 [4] funny 电流 I f ,另外还有部分 T-型 和 L-型 Ca 通道电流 。因此,通过增加 4 期超 极化时内向 I f 电流即可以促使心肌细胞在超极化状态下逐渐除极产生起搏电流。 近年来,超级化激活环核苷酸门控阳离子通道 hyperpolarization-activated cyclic [4] nucleotide-gated cation channel,HCN 基因成为生物起搏研究领域的热点 。作为心脏 内生起搏电流 I f 的分子基础,HCN 通道存在于所有的自律性细胞,它具有超极化激 活、对钾钠离子通透、且受细胞内 cAMP 调节等特点,是参与编码 I f 的基础,并参与 窦房结动作电位的产生 图 1 [2, 5] 。 10 第三军医大学博士学位论文 图 1 窦房结动作电位产生的各离子通道成分和 HCN 通道功能示意图[2] 目前在对哺乳动物的研究中发现, HCN 家族 有四种基因亚型的表达:HCN1 , HCN2 ,HCN3 ,HCN4 。在心脏中 HCN1,HCN2 和 HCN4 是主要的亚型,而 HCN3 主要 [6] 分布于神经系统 。而 HCN1,HCN2 和 HCN4 在心脏组织中的分布区域和其通道激活 [7] 学特点又各有不同 。在哺乳动物中窦房结含量最高的主要亚型是 HCN4 ,其次是 HCN2 、HCN1 ,HCN2 在心室肌中表达最高。通道激活动力学方面,HCN1 具备最快 的通道激活特性,但它对 CAMP 的反应最弱,其次为 HCN2 ;HCN4 虽然激活最慢, 但后两者对 CAMP 反应性非常灵敏。目前在心脏生物起搏研究领域,多数研 究者主要 [8] 采用 HCN2 亚型以构建生物起搏器。最早的研究报道来自 Qu 的实验 ,他们用腺病 毒载体结合小鼠 HCN2 基因,用直接注射的方式将 HCN2 基因传递至犬左心房,在注 射后四天,对犬进行双侧迷走神经刺激,诱导出房室传导阻滞状态,在刺激期间内他 们发现犬出现了左房来源的自主节律,之后通过检测左心房组织,发现 HCN2 在左心 [9] 房有高表达。其后 Plotnikov 等也进行了一项实验研究并证实了这一结论 ,他们同样 将连接腺病毒载体的 HCN2 基因经心内导管注射的方式注射至犬心脏左束支处,在迷 走神经刺激下实验犬犬也出现来源于左室的逸搏心律 而注射腺病毒连接 GFP 的对照 组犬大部分产生的是右室节律 ,并且注射 HCN2 基因的犬心率 接近 60 次/分 明显快 于对照组,同时行免疫组化方法也证实注射部位有HCN2 的高表达。2007 年,Potapova 等[10] 的实验中,首次利用人骨髓间充质干细胞 MSCs 作为一个细胞平台传递起搏电流 11 第三军医大学博士学位论文 至心脏。该实验先利用腺病毒载体将鼠HCN2 基因转染至人骨髓间充质干细胞,在体 外检测出转染阳性细胞可表达 If 电流。然后在犬左室壁心外膜下植入这种表达起搏电 流的干细胞,通过迷走神经刺激引起传导阻滞,发现期间有来自左室注射部位起源的 自发起搏,起搏频率 61?5 次/分;明显高于对照组 注射只转染了 EGFP 的人骨髓间充 质干细胞 45?1 次/分的心率。而且移植区域组织免疫荧光染色移植的细胞与邻近 宿主心肌细胞之间有缝隙连接蛋白 43 Connexin-43 形成。之后 2007 年的一项实验更 证实经转染 HCN2 基因的 MSCs 移植到完全性房室传导阻滞犬体内后可存活达 6 周时 间,并有效产生生物起搏功能,不发生明显的细胞和体液排斥反应[11] 。这些实验结论 和方法为我们利用 HCN4 构建心脏生物起搏器研究提供了技术方法基础和理论实践依 据。 利用 HCN4 基因构建生物起搏是该领域研究的另一热点。蔡军[12]等将腺病毒载体 与人 HCN4 基因整合后注射至猪左心室游离壁,后消融房室结制成完全性房室传导阻滞 模型,发现注射 HCN4 的猪心室率明显快于对照组,且此逸搏心室率对异丙肾上腺素反 应良好。我们团队在多项国家自然科学基金项目的资助下,长期从事 “HCN4 基因转染 MSCs 心脏移植、重建心脏生物起搏功能”的实验研究,主要理论依据是:?在目前已 研究的哺乳动物中,在 mRNA 水平上,表达占窦房结细胞绝对优势的亚型是 HCN4 , [7] 为总 HCN mRNA 的 80% 以上 ;?HCN4 在动物胚胎心脏传导系统发育过程中也起着 至关重要的作用[13,14, 15] ;?最新的研究表明,在对 HCN4 敲除的小鼠,HCN4 的功能更 倾向于为舒张期从 “超极化-去极化”这一过程提供去极化储备电流,而且在应对自主 神经调节过程中主要起着稳定节律的作用[16, 17] ;? 利用 MSCs 联合起搏基因构建生物 起搏的优点在于能持续观察起起搏效果,且能在体内作用较长时间 最长观察到 6 周 , 而直接基因注射目前的结果只观察到几天到 2 周时间。本课题组在前期的研究中[18, 19] 利用慢病毒载体将小鼠 HCN4 基因转染至犬 MSCs,体外测得其表达 IHCN4 ,将其注射 至异体犬右心室游离壁,2 周后进行迷走刺激,发现注射带 HCN4 基因的 MSCs 的犬心 率明显快于注射只转染 EGFP 的MSCs 的对照组犬心率。但因为所采用的迷走刺激法诱 导出房室阻滞只是暂时的效应,故无法测试其对自主神经递质的反应性。 与此同时,MSCs 移植用于治疗心肌梗死和心力衰竭已有大量研究。目前在基础 研究和临床试验中这一技术的应用均取得了相当满意的效果,例如可以明显减少心肌 坏死区面积、改善梗死后心脏的血流灌注和心脏泵功能等[20-22] 。但 MSCs 移植是否增 加致心律失常风险仍存在争议。体外 MSCs 与心肌细胞共培养的实验证实二者之间能够 表达缝隙连接蛋白 43 connexion43 ,证明两种细胞间能形成缝隙连接[23-25] 。然而体 12 第三军医大学博士学位论文 内电传导光学标测技术却发现,MSCs 移植会造成局部电传导延迟,尤其是随着移植细 胞的密度越大,这种现象越明显[25] 。原因之一可能是 MSCs 本身与心肌细胞相比具有 电惰性,在形成电耦联后会造成电流的部分沉降和丢失 source and sink [26] 。而且, 心梗后 MSCs 移植也会造成心脏神经的重构,虽然其背后的机制尚不清楚,但有人提出 MSCs 能够通过直接转分化过程[27]和分泌 NGF 或其他生长因子[28, 29]增加局部神经的生 长。除此之外,在研究干细胞移植致心律失常作用的实验结果也受很多因素影响,例 如:细胞注射途径不同,有经静脉、经冠脉、心肌内直接注射;具体实验方案不同, 注射细胞的剂量、供体-受体种属匹配;实验采用的疾病模型不同,有急性心梗模型、 慢性心肌缺血模型、心衰模型等。这些因素都或多或少都会影响实验的结果。造成干 细胞移植存在致心律失常性可能性和其影响心脏电生理特性的机制有以下几点:? 干 细胞本身的形态结构及电生理特质与成熟心肌细胞存在很大不同[30] ;?移植细胞与宿 主心肌细胞之间的电通讯整合不理想[31] ;?缝隙连接的重构、分布形式改变和失耦联 造成电传导速度不一致,导致折返性心律失常[32] ;?有研究报道干细胞 移植会增加心 脏交感神经发芽重构[33]等。在以往的关于 MSCs 移植对心室电生理影响和致心律失常 作用的研究中,多数采用的是心梗模型和小动物模型,研究得到的结果既有增加高[33-35] 也有减低[36-38]诱发室性心律失常敏感性的报道。在早期的临床试验研究中,直接经冠 脉注射骨髓来源的 MSCs 对有轻微的改善左室功能的作用,同时减少了室性心律失常 风险发生率[39-44] 。同时,也有一些 ?期和?期临床试验正在进行 MSCs 移植用于治疗 急性心梗和/或心力衰竭的有效性和安全性评价[45] 。但对于其是否会导致心脏电生理改 变尚无定论[46 , 47] 。 目前关于干细胞移植影响心脏电生理特性的研究都集中在用于治疗心肌梗死疾病 模型的基础上进行[11] 。但在生物起搏研究领域内,MSCs 转染起搏基因移植对心脏电生 理的影响尚未见报道。因此我们选择HCN4 基因和 MSCs 作为细胞平台构建心脏生物起 搏器,将转染 HCN4 基因的 MSCs 移植至犬心脏,在导致异位心率明显增快的同时,细 胞移植部位是否会成为新的致心律失常病灶、引发恶性室性心律失常也是对在体重建心 脏生物起搏功能安全性的另一担忧。因此,本研究拟通过射频导管消融技术建立犬永久 性心脏传导阻滞模型,将转染 HCN4 基因的 MSCs 移植至犬心室肌,再通过心电生理检 测技术,探讨重建心脏生物起搏功能的可行性及其对心脏电生理特性的影 响,为进一步 评价心脏生物起搏的电生理安全性提供实验基础与理论依据。 13 第三军医大学博士学位论文 第二章 慢病毒载体介导小鼠HCN4 基因转染的犬骨髓间充质干 细胞体外电生理特性研究 本实验为了使外源性 mHCN4 基因整合到 MSCs 基因组中,获得稳定持久表达 HCN4 基因的 MSCs ,以便于后期移植到活体内能持续长时间观察其在体起搏功能的 效果,采用 pLenti6.3-HCN4-IRES2-EGFP 和 pLenti6.3-IRES2-EGFP 慢病毒载体转染第 2-3 代犬骨髓间充质干细胞 cMSCs ,获得稳定高效表达 mHCN4 通道的起 搏样干细胞, 用免疫荧光染色技术观察细胞的 HCN4 通道蛋白表达情况,并用膜片钳检测转染阳性 细胞的起搏电流表达。 2.1 材料与方法 2.1.1 主要试剂 犬骨髓间充质干细胞 本实验室前期研究获得[18] 293FT 细胞 中科院细胞库 Ploybrene Sigma 公司 pLenti6.3-HCN4-IRES2-EGFP 质粒图谱见图 1 上海 Invitrogen 公司 pLenti6.3-IRES2-EGFP 质粒图谱见图 2 上海 Invitrogen 公司 3 质粒系统 第三军医 大学免疫学系 杀稻瘟菌素 blasticidin αMEM 培养基粉末 美国 Hyclone 公司 胰蛋白酶 美国 Hyclone 公司 胎牛血清 美国 Hyclone 公司 羟乙基哌嗪乙硫磺酸 HEPES 上海生工 乙二胺四乙酸 EDTA 上海生 工 乙二醇二乙醚二胺四乙酸 EGTA 上海生工 台盼蓝染色液 上海碧云天 细胞重悬液 上海碧云天 PBS 粉末 武汉博士德 14 第三军医大学博士学位论文 MTT 试剂 武汉博 士德 三磷酸鸟苷 GTP 、K-aspartate 、 Sigma 公司 Na -phosphocreatine 、Mg -ATP 2 2 兔抗小鼠 HCN4 抗体 英国 Abcam 公司 Texas red 标记山羊抗兔 IgG 英国 Abcam 公司 SABC 免疫组化试剂盒 武汉博士德 DAB 显色试剂盒 武汉博士德 DAPI 北京中杉金桥 碳酸氢钠、KCl 、MgCl 、KOH 、NaCl 、CaCl2 、NaH2PO4 、NaOH 、 Glucose 等 2 基础试剂均为国产分析纯。 图 1 慢病毒包装系统质粒图谱 pLenti6.3-HCN4-IRES2-EGFP 15 第三军医大学博士学位论文 图2 慢病毒包装系统质粒图谱 pLenti6.3-IRES2-EGFP 2.1.2 主要仪器设备及耗材: 滤膜 Millex-HV 0.45 μm /0.22 μm PVDF Millipore 100×20mm 培养皿 Greiner 公司 24 孔细胞培养板
/
本文档为【转染HCN4基因的犬骨髓间充质干细胞同种异体移植对传导阻滞心脏电生理变化影响】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。 本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。 网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。

历史搜索

    清空历史搜索