MEMS微探针及其在嗅粘膜神经递质检测中的研究

MEMS微探针及其在嗅粘膜神经递质检测中的研究 MEMS微探针及其在嗅粘膜神经递质检测 中的研究 第19卷第5期 2006年l0月 传感技术 A兀IA)RS Vo1.19No.5 Oct.2006 onMEMSandItsDetectionof theNeurotransmitterintheOlfactoryMucosa LIUQing~un,XUYing,CAIHua,WANGPingh,SimonAng 1.BiosensorNationalSpecialLaboratory,DepartmentofBiomedicalEngineering,KeyLaboratoryofBiomedicalEngineeringof) NationalEducationMinistry,ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China;I 2.DepartmentofElectronicEngineering,UniversityofArkansas,Fayetteville,AR72701,USAJ Abstract:Usingelectrodearrayofmicroprobe,neurotransmitterinolfactorymucosaofratmonitoredinvi— VO.Basedonthetechniqueofmicroelectromechanicalsystems,aprobechipwith8channelselectrodear— rayswasfabricated.Thesensorareaofeachelectrodeis16m× 120ttmor0.3ttmX120m.Theprobe couldevendetectdopaminein50nMusingcyclicvoltammetry.Catecholamineswerealsomonitoredinvivo withtheprobesettlinginratnasalmucosa.Usingontheanimalmodeloftrigeminalstimulationinduced bycarbondioxide,theresultsdemonstratetheprobecouldmonitorthetimecourseofneurotra nsmitter substancesbymultiplesensorsites. Keywords:microprobebasedonMEMS)dopamine;olfactorymucosa;bio-MEMSdevice EEACC:2575;7230J MEMS微探针及其在嗅粘膜神经递质检测中的研究 刘清君,徐莹,蔡华,王平,SimonAng ,1.浙江大学生物医学工程与仪器科学学院,生物传感器国家专业实验室,生物医学工程教育部重点实验室,杭州310027., \2.DepartmentofElectronicEngineering,UniversityofArkansas,Fayetteville,AR72701, USA, 摘要:采用微探针电极阵列对大鼠嗅粘膜神经递质进行了在体检测.基于MEMS技术,制备了具有8通道电极阵列的微探 针芯片.每一电极的传感器表面为16~trnX120m或0.3m×120p.m尺寸.采用循环伏安法,该探针可以检测到50nM浓度 的多巴胺.将探针固定于大鼠鼻腔嗅粘膜,对多巴胺等单胺类神经递质进行了在体检测.通过二氧化碳诱导的三叉神经刺激 动物模型的研究,证明微探针适合于神经递质的多位点实时测量. 关键词:MEMS微探针;多巴胺;嗅粘膜;生物MEMS器件 中图分类号:TP2l2.3文献标识码:A文章编号:lOO4.1699(2OO6)O5—2145-04 对诸如多巴胺(Dopamine)等单胺类神经递质 的释放与回收过程进行实时监控,是神经系统信息 传递过程研究的重点之一.无论在体还是离体研究, 高灵敏性,高特异性和快速响应等特点,都是神经递 质研究的基本要求.所以,具有上述特点的循环伏安 法等电化学方法在多巴胺的在体研究中获得了广泛 应用,尤其在碳纤(carbonfibers)电极电化学传感 器的研究中更是如此.采用循环伏安法,碳纤电极最 低可以获得60nM的在体检测浓度[】].但是,体积 相对较大的碳纤电极尺寸,限制了放置在动物组织 的电极数目采用薄膜微电极方法,可以在近似一个 碳纤的载体上制备出多个传感位点组成微电极阵列 (microelectrodearray,MEA),以克服碳纤电极的 不足嘲.在生理测试中,采用碳纤电极同样具有可测 收稿日期:2006—07—01 基金项目:国家自然科学基金资助(30570492);浙江省人才基金资助(R205505) 作者简介:刘清君(1975一),博士,从事生物医学传感器研究,lqjmail@sina.com; 王平(1962一),男,教授,博士生导师(通讯联系人),从事生物医学传感技术研 究,cnpwang@zju.edthcn 2146传感技术2006血 试位点不多,硬度不高等缺点,所以需要采用 MEMS技术的加工方法,制备出硬度较高,易于测 试的硅基底金属电极阵列,以便开展神经递质的生 物在体研究. 嗅觉是生物的基本功能感觉,但是生物嗅觉感 知的机理研究,相对于其它感觉系统而言却相对较 为滞后,其中一个重要的原因就是嗅觉感知所涉及 的复杂的时间与空间编码模式lL3].大鼠的嗅粘膜主 要由三叉神经支配,其交感神经末梢释放的神经递 质主要为多巴胺和去甲肾上腺素,这些神经递质主 要集中分布在嗅粘膜的色曼氏腺细胞周围,具有调 节气味分子感受敏感性的功能l_4].因此,本实验的研 究目的便是试图建立基于微电极阵列的多巴胺电化 学传感检测系统,并将其应用于大鼠嗅粘膜多巴胺 类神经递质的多位点实时检测,以便对生物嗅觉感 受机理的研究探索新的实验方法. 1材料与方法 1.1微电极阵列 本试验所采用微探针芯片(图1)是在原来的硅 微电极阵列研究的基础上l_2],采用微机械加工技术, 通过一个系列掩膜与蚀刻,在硅基底上制备出的能 够集成8通道金电极阵列的微探针芯片(36m), 其中8个焊点为300m×800m,每一电极表面为 16tzm×120t~m(4个正面电极)或0.3tLm×12m (4个侧面电极).对其中一个通道进行方波刺激时, 记录其余通道的输出信号,再通过和原通道信号比 talk) 较,发现微电极阵列各通道之间的串扰(cross—不超过4%.在两类电极比较研究中发现,侧面电极 的电流幅度低于正面电极大约42%,由于其面积仅 为正面电极的53,估计与电极表面的不同溶液扩 散方式有关.总之,两类电极均能表现出良好的输出 响应. 图1微探针的微电极阵列结构 1.2电极表面处理 多巴胺分子中含有两个容易被氧化的酚羟基, 因而具有电化学活性.由于与多巴胺共存于组织中 的抗坏血酸(ascorbicacid)在固体电极上的氧化电 位与多巴胺接近,对多巴胺含量的测定产生严重干 扰,所以需要对电极表面进行相关处理,以增加检测 敏感性.一种可行的方法是在电极表面修饰一层具 有阳离子交换功能的Nation膜,因为在生理pH条 件下,多巴胺为阳离子,而抗坏血酸为阴离子,利用 Nafion膜磺酸根阴离子与阴离子的静电排斥作用, 可较好地消除抗坏血酸的干扰.本实验的处理方法 是:将微探针电极浸入0.5mol/INaOH溶液中于 -- 0.2,1.0V以160mV/s循环扫描10min,然后 用1阳离子交换剂Nation乙醇溶液(Sigma— Aldrich)浸30S并在100?烘lh.经此处理后,同 样浓度的儿茶酚胺和抗坏血酸在电极上的氧化电流 之比为1000:l,使得抗坏血酸对儿茶酚胺的测定 没有干扰E. 1.3电化学测量系统 循环伏安法(cyclicvoltammetry)是在固定面 积的工作电极和参考电极之间加上对称的三角波扫 描电压,记录工作电极上得到的电流与施加电位的 关系曲线以得到伏安图.从伏安图的波形,氧化还原 电流的数值及其比值,峰电位等判断电极反应机理, 并根据伏安特性曲线进行定性定量. 本试验循环伏安法在CHI660电化学工作站 (上海辰华仪器公司)上进行.Pt电极和Ag(AgC1) (3.0M)分别为对电极和参考电极,微探针作为工 作电极(见图2).本实验主要先利用一定浓度的多 巴胺溶液对微电极进行测试标定,然后将大鼠麻醉 固定后,对大鼠嗅粘膜中的多巴胺类神经递质进行 检测.溶液测定在15.0mI,pH7.2的PBS溶液(包 括1.0mI0.1M的MgClz,氢氧化钠溶液(用以调 整pH值),1.0mI六氰铁化钾和1.0mL六氰亚 铁化钾(两者浓度均为0.1M)中进行.循环伏安法 的起始电位为一0.2V,终点电位为0.6V,扫描速 度为160mV/s,静息时间为2s,采样间隔由实验情 况决定. 图2微探针的电化学测试装置 (RE:参考电极;CE:对电极;wE:工作电极,即微探针电极) 1.4嗅粘膜在体测量 . 采用循环伏安法对神经递质多巴胺进行在体检 测,最早始于Gonon于八十年代初发表在Nature 上的一个开创性研究E.其测量原理是利用了单胺 第5期刘清君,徐莹等:MEMS微探针及其在嗅粘膜神经递质检测中的研究2147 类神经递质(monoamines)在电极表面的氧化还原 特性所进行的检测.单胺类神经递质包括5一羟色 胺,多巴胺,肾上腺素,乙酰胆碱等多种神经递质,所 以在本试验中,离体检测均采用多巴胺的测量,而在 体检测结果,则可能更多的是单胺类神经递质的总 量.嗅粘膜微电极在体伏安法具体操作方法参照文 献[7],将SD大鼠(150—200g)采用水合氯醛麻醉(5 mL/kg)后用定位仪进行头部固定,剪去毛皮,解剖 暴露鼻腔.将微探针电极进行固定后调节电极尖端 位置,对准大鼠鼻腔嗅粘膜中后部,直至插入到粘膜 后部,如图3所示.将甘汞参考电极和铂丝电极放置 在大鼠的颅骨下中,靠近鼻腔微探针(工作电极)处. 图3微探针的嗅粘膜在体检测 同时,由于COz可以选择性的引起三叉神经痛 觉反应,而不引发任何嗅觉感受,所以常被用来作为 嗅粘膜三叉神经刺激研究的动物模型[83.经高效液 相色谱电化学检测(high-performanceliquidchro— matographyelectrochemicaldetector,HPI(,_ECD) 测定已经发现,在利用COz气体对三叉神经刺激之 后的多巴胺等单胺类递质含量变化会分别在15, 25min后下降33,在25,35min后下降56之 多,然后再逐渐恢复到基础水平[9].为了同结果进行 对照研究,本实验也采用了COz诱发分泌单胺类递 质的动物模型方法:即将100COz通人麻醉大鼠 的一侧鼻腔(微探针电极放置鼻腔的对侧鼻腔),控 制湿度为80,通气流速140mL/s,并在连续刺激 2min后停止刺激,开始测量. 2结果与讨论 2.1溶液测量 用PBS配制不同浓度的多巴胺标准溶液(0.05 M,0.1M,0.5M)对其浓度曲线进行标定,计 算方法采用背景减除(backgroundcurrentsubtrac— tiontechnique),以便得到微探针的响应曲线.图4 所示,是利用微探针作为工作电极所测得的多巴胺 和PBS溶液的循环伏安图,可以看到有明显的氧化 还原峰,利用电化学工作站自带的工作软件将其进 行背景减除,根据其的氧化还原峰值,可以对其浓度 电流进行标定.图5所示,是一个正面电极和一个侧 面电极不同浓度多巴胺相对于PBS的4次试验结 果的浓度响应曲线,侧面电极的敏感性略低于正面 电极.总之,通过系统研究发现多巴胺测量信噪比为 3,检测下限在50nmol/L浓度左右. 图4微探针测量循环伏安图 图5不同浓度多巴胺溶液测量 2.2在体测量 对麻醉大鼠嗅粘膜单胺类神经递质的基础分泌 量进行测量,根据电流值,利用上述多巴胺敏感度测 量标定结果,初步估计其浓度大约在50nM左右,但 是信号噪声较大,估计与在体检测过程中嗅粘膜这一 溶液环境,以及电极的放置位置等多种因素有关.图 6为经C()2诱发刺激之后,其中一个通道的递质分泌 量测定.其中0min为未经刺激时的基础测量,以后7 次测量则是3min之内的循环测量峰电流的叠加值, 结果显示所测氧化还原峰由起初的逐步增高,至第 12min时的第4次测量达到最大值,接着逐渐降低恢 复.可见,cQ:诱发三叉神经刺激之后的整个测量过 程变化趋势基本和Lucero等的观察一致[9].但是,并 没有在Lucero等人所报道的0-5min之内到达最大 值,估计与微探针的灵敏度和响应时间有关.另外,测 量峰值不明显,即使经过3min的循环扫描叠加也不 能对其进行很好的区分.并且虽然这7次测量基本上 保持了峰形的一致,但是整体上同未受C()2诱发刺 激之前(即0min时的电流值)差别相对较大,尤其是 波形的差别更为明显.可见(通气过程对试验结 果的影响尚需进一步探究. 87654321O 《u,芒0U 2148传感技术2006生 036912l5l82l Time/min 图6三叉神经刺激后的大鼠嗅粘膜动态测量 3结论与展望 嗅觉信息的编码过程中,单一气味可组合性地 激活多种不同感受细胞,形成多种细胞组合编码,以 确定气味物质的特征.目前大量有关嗅觉系统的知 识往往是通过测量单个或少数几个神经元的活动而 获得,但是由于神经元网络的高度复杂性,通过少数 几个位点来分析气味激活状态,已经显示出了很大 的局限性.微探针芯片是采用MEMS技术构建出一 个多通道的电极阵列,用以提供一种多位点,无损 伤,以及长时程持续记录胞外电信号或神经递质等 化学信号的测量方法.将微探针芯片用于动物在体 研究,可以在原位水平的网络系统中了解神经元之 间的相互作用,有助于探索神经元是如何联系成一 个整体来处理和储存信息的.基于MEMS技术的微 探针芯片,其特点是采用微电极作为传感检测的手 段,同一般尺度的电极相比较,具有更高的灵敏性, 更精细的检测手段和更小的欧姆损耗,也就拥有了 更好的信噪比_2].同时,采用电极阵列进行检测,一 个基本的优点是可以根据检测信号来选取可用的输 出通道进行检测.如果输出均较好,则可以采用多通 道平均以便取得可信的统计学结果,甚至可以根据 电极分布来探究所测信号的空间分布范围,从而有 助于神经信息的空间编码研究,这本身也是微探针 芯片研究的出发点之一. 本文采用微探针进行研究,通过对多巴胺的体 外检测,初步验证了其对神经递质检测的灵敏性.多 巴胺的循环伏安法检测,是目前研究比较多,也相对 成熟的电化学检测方法.较高效液相色谱等技术而 言,微探针检测作为一种电化学传感器装置,虽然其 灵敏度有待进一步提高,但是其特点在于快速,高 效,实时,因此可以用来进行在体传感检测,以便生 物信息的快速准确输出.当然,微电极阵列芯片检测 的优势更在于其多通道的生物化学信号或电生理信 号的检测,其良好的应用前景便在于可望有助于嗅 觉信息的空间编码机理的阐明,以及与此相关的嗅 觉感知的学习与记忆机制. 参考文献: [1]Heien,^,LL八vI,Kahn,八&,Ariansen,J.L.Cheer, J.&Phillips,PIE,Wa~um,^,LK.,Wightrnan,^,LR.^,L, 2005.Real-TimeMeasurementofDopamineFluctuationsafter CocaineintheBrainofBehavingRats[J].ProcNatlAcadSci USA102,10023—10028. 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