汉防己甲素对唑类药物抗真菌活 性增效作用的临床研究

汉防己甲素对唑类药物抗真菌活 性增效作用的临床研究 汉防己甲素对唑类药物抗真菌活 性增效作用的临床研 究 汉防己甲素对唑类药物抗真菌活性增效作 用的临床研究 1.汉防己甲素对氟康唑治疗外阴阴道念珠菌病增效 作用的临床研究 2.汉防己甲素对酮康唑治疗皮肤癣菌病增效作用的 临床研究 硕士研究生: 石建萍 导师:张宏 博士 教授 主任医师 单位:暨南大学附属第一医院皮肤科摘 要 目的: 以临床外阴阴道念珠菌病和皮肤癣菌病患者为研究对象,探讨汉防己甲素 对唑类药物抗真菌活性的增效作用。: 单纯性和复发性外阴阴道念珠菌病患者各随机分为三组。单纯性外阴阴道念 珠菌病:FCZ +TET 组:每枚栓剂内含氟康唑粉50mg和汉防己甲素粉 150mg;FCZ 50 150 50 组:每枚栓剂内含氟康唑粉50mg;TET 组:每枚栓剂内含汉防己甲素粉 150mg; 150 复发性外阴阴道念珠菌病:FCZ +TET 组:每枚栓剂内含氟康唑粉150mg和汉防 150 150 己甲素粉150mg;FCZ 组:每枚栓剂内含氟康唑粉150mg;TET 组:每枚栓剂内 150 150 含汉防己甲素粉150mg。采用阴道后穹隆处放置栓剂,每日1次,连续7天为1疗程。 单纯性外阴阴道念珠菌病1疗程;复发性外阴阴道念珠菌病4疗程。单纯性外阴阴 道念珠菌病在治疗开始后的第1~7天,治疗结束后第3天、1周末及2周末回访; 复发性外阴阴道念珠菌病在治疗结束后连续6个月进行追踪观察。观察临床疗效 及微生物学指标。体股癣和手足癣患者各随机分为三组。KCZ+TET组:霜剂内含2%汉防己甲素 2和2%酮康唑;KCZ组:霜剂内含2%酮康唑;TET组:霜剂内含2%汉防己甲素。使 用方法都采用适量涂抹于患侧,每日早、晚各一次。疗程体股癣用药2周,手足 癣用药4周,治疗中每周随访,停药后2周、4周回访。观察临床疗效及微生物学 指标。 结果: 单纯性外阴阴道念珠菌病患者的疗效观察中,在治疗开始的第 2 天,FCZ 50 +TET 组与 FCZ 组的临床症状体征总评分相比较,差异有统计学意义(P 150 50 0.05)。FCZ +TET 组临床症状、体征缓解(0分)的昀初时间较 FCZ 组短 50 150 50 (P 0.05)。在治疗开始的第 4、5天,FCZ +TET 组的临床疗效、真菌清除 50 150 率和总体疗效高于 FCZ 组(P 0.05)。复发性外阴阴道念珠菌病患者的疗效 观 50 察中,FCZ +TET 组和FCZ 组在随访期内的复发率比较,差异无统计学意义; 150 150 150 在治疗结束后第4至第6个月的复发患者症状体征总评分比较,P均<0.05, 差 异有统计学意义。 体股癣和手足癣患者的治疗中,KCZ+TET组与KCZ组在临床症状体征总评分 差值比较、临床疗效比较、微生物学疗效比较、总体疗效比较等方面,差异 均有 统计学意义(P 0.05)。 在整个治疗及随访观察过程中,外阴阴道念珠菌病患者中的TET组和皮肤癣 菌病患者中的TET组,临床疗效的有效率、真菌清除率和总体疗效的总有效 率均 为0。 两个临床试验观察中均无严重不良反应发生。 结论: 汉防己甲素作为唑类药物的增效剂能提高氟康唑治疗外阴阴道念珠菌病、酮 康唑治疗皮肤癣菌病的临床疗效。 关键词: 增效作用;汉防己甲素;氟康唑;外阴阴道念珠菌病;酮康唑;皮肤癣菌病 3ABSTRACT Objective: Clinical investigate on the synergistic effect of tetrandrine to the antifungal activity of fluconazole for treatment of vulvovaginal candidiasis and ketoconazole for treatment of superficial mycosisMaterials and Methods: A double-blind randomized clinical trial was undertaken in patients with acute vulvovaginal candidasis and recurrent vulvovaginal candidasis. Vulvovaginal candidiasis was demonstrated by both positive findings on microscopic examination of vaginal smears and positive culture as well as by the presence of clinical signs and symptoms. 46 patients with acute vulvovaginal candidasis were divided into three groups , FCZ +TET groups received a 50mg fluconazole and 150mg tetrandrine 50 150 vaginal suppository, FCZ groups received a 50mg fluconazole vaginal suppository, 50 TET groups received a 150mg tetrandrine vaginal suppository; 35 patients with 150 recurrent vulvovaginal candidasis were divided into three groups, FCZ +TET 150 150 groups received a 150mg fluconazole and 150mg tetrandrine vaginal suppository, FCZ groups received a 150mg fluconazole vaginal suppository, TET groups 150 150 received a 150mg tetrandrine vaginal suppository. The vaginal treatment was inserted to the vulva in the evening at bedtime once daily for 7 consecutive days as one course, patients with acute vulvovaginal candidasis need one course, patients with recurrent vulvovaginal candidasis need four courses. Follow-up visits at day 1~7 after the beginning of therapy and at day 10 ,week 1,2 after the end of therapy in patients with acute vulvovaginal candidasis and 6 months in patients with recurrent vulvovaginal candidasis. The synergistic efficacy of tetrandrine was assessed by clinical signs and symptoms and microscopic examination of the vaginal lavage fluidA double-blind randomized clinical trial was undertaken in patients with superficial mycosis. All patients were divided into three groups, KCZ+TET groups received a therapy combined with 2% ketoconazole and 2% tetrandrine cream, KCZ groups received a 2% ketoconazole cream, TET groups received a 2% tetrandrine cream. The4creams were applied to skin lesions twice a day. The course of treatment was two weeks for tinea corporis and tinea cruris and four weeks for tinea manus and tinea pedis. Follow-up visits at every week after the beginning of therapy and at weeks 2、4 after the end of therapyThe synergistic efficacy of tetrandrine was assessed by clinical signs and symptoms and microscopic examination of skin lesionsResults: Follow-up visits in patients with acute vulvovaginal candidasis, compared with FCZ group, there was a significant decrease of first time needed to release signs and 50 symptoms in the FCZ +TET groups(P 0.05).On the day 2 after the beginning of 50 150 therapy, total scores of the signs and symptoms in the FCZ +TET groups were 50 150 lower than that in the FCZ groups (P 0.05)On the day 4,5 after the beginning of 50 therapy, the clinical efficacy and mycological cure rates in the FCZ +TET groups 50 150 were higher than that in the FCZ groups (P 0.05). Follow-up visits in patients 50 with recurrent vulvovaginal candidasis, there were no significant differences of recurrence rate between FCZ +TET groups and FCZ , but total scores of the 150 150 150 signs and symptoms of relapsing cases in the FCZ +TET groups were lower than 150 150 that in the FCZ groups (P 0.05)at 4~6 months after the end of therapy150 Follow-up visits in patients with superficial mycosis, compared with KCZ groups, there were significant differences of clinical cure rates and mycological cure rates and total response rates in the KCZ+TET groups(P 0.05) There was no improvement of mycological cure in the groups with tetrandrine vaginal suppository and 2% tetrandrine creamNo drug-rlated serious side-effects were found in all clinical trialsConclusion: Tetrandrine as a synergist can enhance the antifungal activity of fluconazole for treatment of vaginal candidiasis and ketoconazole for treatment of superficial mycosisKeywords: Synergist; tetrandrine; fluconazole; vulvovaginal candidasis; ketoconazole; superficial mycosis 5汉防己甲素对唑类药物抗真菌活性 增效作用的临床研究 前言 1 唑类药物的耐药状况 真菌引起的感染可分为浅部真菌感染和深部真菌感染。浅部真菌病是一种常 见的多发病,其致病菌是各类癣菌,传染性强,主要侵犯人的皮肤、毛发、指 (趾) 甲等。浅部真菌病约占真菌病患者总数的90%。深部真菌病较常见的致病菌 为白 色念珠菌和新隐球菌,主要侵犯人的内脏器官和深部组织,其发病率虽低但 危害 性极大,常可危及生命。近几十年来,随着人类生存环境的恶化,社会的老龄化 程度加大,恶性肿瘤、艾滋病和糖尿病等代谢性疾病患病率的增加,器官移植和 外科其他介入性治疗的不断实施,广谱抗生素和皮质类固醇激素的广泛应用,以 及真菌致病病原体由于种种原因也发生了变迁,真菌感染发病率呈明显上升趋势 [1] 。 对真菌病治疗手段的进步主要表现在抗真菌药物的开发和临床应用上。在抗 真菌药物研究中,影响真菌麦角甾醇生物合成和功能的化合物一直是人们研究的 重点。在抗真菌药物发展史上,临床应用昀成功,而且现在仍然作为治疗真菌病 一线药物而被广泛应用的有酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、两性霉素 B 和特比奈 芬等。两性霉素 B 抗菌谱广、疗效好、但毒性大,抗真菌疗程难以完成成为临 床一大难题。20世纪 80年代初第一个生物利用度高,可以口服使用的唑类抗真 菌药物??酮康唑在临床广泛应用后,不久临床上就有报道在长期用酮康唑治 疗 念珠菌的患者中,有治疗失败并伴有病原真菌昀低抑菌浓度( MIC)值升高的情 况。80年代后期氟康唑的发现并应用于临床是抗真菌药物研究中的一个里程碑, 其作用机制是通过抑制细胞色素 P450 依赖性的羊毛甾醇 14-α-去甲基化酶 14DM ,影响羊毛甾醇 14-α-甲基的羟基化反应,从而造成麦角甾醇合成减少 以及一些甾醇前体化合物的增多,导致细胞膜的结构和功能发生改变,产生抗真 [2] 菌作用。唑类抗真菌药物具有许多共同点 :在化学上均为弱碱性物质,中性 PH 附近带正电荷;在生物学方面,具有广泛的抗菌谱,包括大多数酵母和丝状真菌、 革兰氏阳性菌、厌氧菌、一部分原虫;对真菌细胞的选择毒性比较高;与其它抗 真菌药物无交叉耐药现象,唑类抗真菌药物之间有广泛的交叉耐药现象;在生长 昀低抑制浓度 MIC附近的浓度发挥抑菌作用,比之高的浓度则具杀菌作用,具 6有 MIC以下的广阔的 Sub-MIC区域。因其具有抗菌谱广、高度选择性、生物利 用度高、安全等优点,在治疗浅表和深部真菌感染中倍受青睐。 然而,不容忽视的是随着唑类药物的广泛及长期使用,它的耐药性越来越普 遍。20世纪80年代及90年代初,多数医院的真菌感染以白色念珠菌为主,而近年 来国内外研究表明感染菌种发生了变迁,昀引人注目的变化是念珠菌种类的变 化,白色念珠菌的比例在逐渐减少而非白色念珠菌呈上升趋势,多数学者认为非 [3] 白色念珠菌的增加可能与唑类药物特别是氟康唑的广泛应用有关 。临床中治 疗艾滋病患者口腔和食道念珠菌感染的药物如氟康唑、酮康唑和伊曲康唑等药物 [4] 均出现了不同程度的耐药现象,尤其是氟康唑的耐药现象较为严重。 Wroblewska [5] 等从临床分离的851株白念珠菌中,有37.2%的菌株对氟康唑耐药。Law 等调查 [6] 显示,在AIDS患者口咽白念珠菌感染中,33%是氟康唑耐药株。Graybill等 也 发现因白色念珠菌氟康唑耐药株的出现导致治疗失败率大大增加。伊曲康唑在临 床应用的时间相对较短,并且以口服为主,耐药的报道相对较少。但在免疫缺陷 患者中,已分离出耐伊曲康唑的念珠菌、烟曲菌、新生隐球菌。伊曲康唑对氟康 唑耐药的念珠菌和烟曲菌的MIC值明显升高,即使沃利康唑对氟康唑耐药的念珠 [7] 菌和烟曲菌的MIC值亦有所升高 。这已成为困扰临床治疗真菌感染的一个重要 问题,所导致的治疗失败与日俱增。 2 真菌对唑类药物的耐药机制 真菌对唑类药物耐药机制研究的比较多的是白色念珠菌对唑类药物的耐药 机制,主要是获得性的,天然耐药株少见,获得的耐药性既可以是可逆的也可以 是稳定的遗传学改变的结果。对稳定耐药的研究较多,已发现有多种分子机制参 与,包括唑类药物作用靶酶 14-α-去甲基化酶的基因突变及过度表达、多药耐药 基因 CDR1、CDR2、MDR1 编码的外排泵的表达增加、靶酶生物合成途径的改 变以及生物膜等。其中多药耐药基因 CDR1、CDR2、MDR1 的表达增加是唑类 耐药主要机制,外排泵基因过度表达将细胞内的药物排出胞外,导致细胞内药物 [8-9] 浓度降低从而不能有效抑制真菌的生长。Sangland、Niimi 等 研究证实 CDR1 基因与唑类的耐药性之间确实存在密切的关系。在耐药念珠菌株中,CDR1基因 的 mRNA 水平可增高 5 到 8 倍,说明 CDR1 基因在念珠菌产生对唑类药物获得 性耐药中的重要作用。72.1固醇生物合成途径的改变 氟康唑通过抑制真菌细胞膜的主要成分麦角固醇的合成起到抗真菌作用,它 抑制 14-α-去甲基化酶不仅使麦角固醇耗竭,而且使甲基化固醇在真菌胞浆内积 5,6 蓄,从而抑制了细胞的生长。ERG3编码的? 脂肪酸脱氢酶的失活可导致细胞 膜固醇成分的改变和对氟康唑耐药。近来发现敲除 ERG3 基因导致耐药性增加, 为证实固醇生物合成途径的改变引起对氟康唑的耐药提供了直接的遗传学依据 [10] 。 2.2编码靶酶的ERG11基因的突变及过度表达 一些研究者将编码氟康唑耐药株的靶酶的 ERG11 序列同已公布的敏感株相 比较发现:Fl05L,E266D,K287R,G448E,G450E,0464S,V488I 等处的氨 [11] 基酸置换只在氟康唑耐药株上发现 ,但是这样的序列不同可能仅仅反映等位基 因的变动,还需进一步证实其与耐药发生的关系。ERG11 突变导致耐药发生的 更强有力的证据是配对比较从同一患者不同时期获得的敏感株及耐药株的 ERG11的等位基因序列,经比较可看出,在耐药菌中存在突变点R467K,是 467 位的精氨酸被置换成赖氨酸。进一步研究提示 R467K 突变可降低靶酶对氟康唑 [12] 的亲和力而产生耐药性 。在 ERG11 基因上存在另一个突变点 T315A,将 315 位的苏氨酸置换成丙氨酸。这种特殊的突变直接发生在酶的活性部位,即在血红 素的辅助因子上,因而可能引起血红素的结构与功能的改变而导致耐药。遗传学 证据提示:一种细胞有两个拷贝的 R467K 突变的菌株耐药性比只有单个等位基 [13] 因突变株所产生的耐药性高 。氟康唑的选择性压力看来是倾向于一旦 ERG11 的一个等位基因的突变导致耐药性增加,则可能使 ERG11向纯合子方向转化。 靶酶基因的过度表达可产生大量的靶酶,细胞内药物的浓度不能完全抑制靶 酶的活性,从而使真菌产生耐药性。在氟康唑存在下,ERG11 的过度表达可能 [14] [15] 是麦角固醇耗竭产生的一种反馈机制 。但 Franzetal 报道了一些氟康唑耐药 株在药物不存在情况下 ERG11 的表达比在药物存在下的敏感株的表达水平高。 这种基本的 ERG11 的过度表达看来可能导致耐药,但比 ERG11 突变产生的耐药 性程度略低。 2.3 外排泵基因的过度表达 近几年发现真菌能通过主动耗能的方式将氟康唑从细胞内排出到细胞外,而 8药物外排泵膜转运蛋白的功能增强是源于编码膜转运蛋白的基因的表达增加, 这是导致白色念珠菌耐药的较普遍的机制。有两类编码外排泵的基因:高度 同源 的基因 CDR1、CDR2 编码 ABC 转运子,需 ATP 作为能量来源;MDR1多药耐 药基因和 FLU1氟康唑耐药基因编码主要易化子,使用离子梯度势能作为能量 [16] 来源 。 在白念珠菌中,已发现的ABC超家族外排泵成员有Cdr1p、Cdr2p、Cdr3p、 Cdr4p,分别由CDR1、CDR2、CDR3、CDR4编码。CDR1和CDR2基因高度同源, 4%相同,91%相似。Cdr1p和Cdr2p氨基酸序列有84%相同,92%相似,Cdr2p和 Cdr1p的N端和C端都具有多样性,导致两者功能差异,表现为Cdr1p能特异性引 起白念珠菌对磺胺米隆耐药,而Cdr2p能特异性引起白念珠菌对甲紫耐药。Niimi [9] 等 研究证实CDR1基因与唑类药物的耐药性之间确实存在密切的关系。在耐药 [17] 白念珠菌株中,CDR1基因的mRNA水平可增高5到8倍。Sangland 对一系列从 一AIDS患者口腔分离的对氟康唑敏感性不一的白念珠菌研究发现,氟康唑MIC 值高的菌株其CDR1表达也高;作者在敲除了PDR5的酿酒酵母中导入含有 CDR1 [18] 的质粒,发现该酵母对氟康唑的敏感性下降。Nakamura 在敲除了外排泵的氟 [19] 康唑敏感酿酒酵母中表达CDR1基因,发现该酵母对氟康唑耐药了。White 对一 系列白念珠菌研究发现,氟康唑耐药株的CDR1表达量约为氟康唑敏感株及剂量 [8] 依赖株的5倍。Sangland 等研究发现,在CDR1高表达的耐药株中,常常伴随 CDR2的表达增高;单独敲除CDR2的耐药株对氟康唑的敏感性并无增加,但同时 敲除CDR1及CDR2的白念珠菌比单独敲除CDR1的菌株对氟康唑更为敏感。在临 床分离株的氟康唑敏感株未能检测到CDR2的表达。 人类的MDR1基因位于7号染色体的q21.1,包括28个外显子,编码一个长 4500bp的mRNA。研究昀多的是 MDR1所编码的跨膜蛋白P-gp。人的P-gp有1280 个氨基酸残基,相对分子量是170000,具有典型的ABC超家族外排泵的典型特征 [20] 。近三十年时间, P-gp是发现和研究时间昀长、 研究昀广的药物外排蛋白。 P-gp 具有泵功能,可向外排出食物中的天然毒物,内源性代谢产物和细胞毒性物质。 人的P-gp过度表达是肿瘤细胞对多种化疗药物产生多药耐药性的主要原因之一。 P-gp可与多种药物结合并以耗能方式排出药物,降低细胞内药物浓度而产生耐药 性。它能够通过脂质双分子层有效的清除细胞毒性药物和许多常用的药物,它的 9跨膜区域结合带有中性或正电荷的疏水性药物底物,可能直接从脂质双分子层递 呈给转运蛋白。P-gp的量随体外MDR细胞耐药程度的增强而增加。P-gp的表达与 几种类型抗癌药物的耐药相关,包括蒽环类、长春碱类、紫杉醇类和鬼臼毒素类 等。P-gp同时亦是一种钙离子和氯离子通道,能使MDR细胞线粒体跨膜电位降 [21] 低,这种降低并非线粒体数目减少,而与P-gp的过度表达有关 。 近年来,一个类似 MDR1 的基因因在 FLU1 酿酒酵母变异体上能传达耐药性 而被分离出来。在白色念珠菌其他耐药基因敲除的背景下,失活的 FLU1 能使白 色念珠菌对氟康唑的敏感性提高,证实了 FLU1 能在白色念珠菌中介导对氟康唑 [22] 的耐药性 。但在对白色念珠菌临床耐药株的研究发现,FLU1 基因高表达与白 [23] 念珠菌对氟康唑耐药无相关性 。 2.4 多种相关基因的表达 多个基因的差异表达也与氟康唑耐药表型相关。这其中包括伴随 CDR1、 CDR2 过度表达的 GPXl、RLA3、EBPI;伴随 MDR1 过度表达的 IFDI、IFD4、 IFD5、IFD7、GRP2、DPP1、CRD2、INO1 等。其中大多数基因与氧代谢应激有 [24] 关,提示白色念珠菌对氧代谢损害的钝化可能有利于氟康唑耐药性的发生 。 [25] 研究发现 ,PDR16 基因与 CDR1 和 CDR2 基因同属于一个转录系统,由 Tac1p 所潜在控制。实验表明,去除 PDR16 基因的耐药菌株对唑类药物的耐药 性下降了约两倍,提示 PDR16 基因在唑类药物的耐药中起重要作用。它可能的 机制一方面是直接或间接影响麦角固醇合成酶的活性,另一方面,PDR16 基因 的突变引起质膜脂质成分的改变。当然更多的机制还有待进一步的研究。 [26] Anna semecki 等 研究发现非整倍体和等臂染色体结构在唑类抗真菌药耐 药中的重要作用。所谓非整倍体和特异性非整倍体片段是由 5号染色体的两个左 臂构成的等臂染色体,等臂染色体周围存在一种着丝粒,并在其侧面有反向重复 序列,这个等臂染色体是一种独立染色体或其端粒被融合到 5号染色体整段同系 物中,与唑类药物的耐药密切相关。耐药性的增强还是减弱与等臂染色体的丢失 和获得明显相关,因为它携带的基因调节靶酶的表达,这个酶正是唑类药物麦角 固醇通路作用的靶酶,还有流出泵及作为调节流出泵基因亚群的转录因子。 2.5 白念珠菌生物膜的耐药机制 白念珠菌生物膜是相对于单个分散游离状态的白念珠菌而言的另一种白念 10[27] 珠菌独特的生存形式 ,其昀具特征性的表型是对多种传统抗真菌药物高度耐 药。典型的白念珠菌生物膜为酵母态细胞粘附在生物材料的表面,在这之上是被 [28] ECM包裹的菌丝态细胞 。白念珠菌生物膜对抗真菌药物耐药的机制尚未明 了。当白念珠菌生物膜被破坏或重新悬浮后置于抗真菌药物环境中,这些白念珠 [29-30] 菌细胞仍对抗真菌药物耐药 。这表明白念珠菌生物膜耐药是其细胞本身的内 在特性。生物膜相关微生物耐药机制包括:生物膜细胞低生长率;ECM生成后 [27] 产生物理屏障,妨碍药物渗透入生物膜;生物膜耐药相关基因的表达 。但它 们在白念珠菌生物膜耐药中的作用仍不确定。 生物膜细胞低生长率:在生物膜里,细胞的生长速度已经被认为是药物活性 调节的一个重要因素。事实上,所有的抗生素对快速生长的真菌细胞更有杀伤力。 由于营养获得的限制,生物膜细胞处于缓慢生长或饥饿状态,导致真菌的代谢降 低,尤其是在生物膜的基层,因此表现出真菌细胞对抗菌药物的不敏感。生物膜 中的细胞生理状态呈不均质性,是其生存的重要因素之一。 生物膜的屏障作用:生物膜中的EPS可以阻碍或延缓抗生素渗透入生物膜。 [31] Thumheer 对白念珠菌生物膜的研究提示,阻碍荧光探针通过生物膜的原因是 大分子在渗透入生物膜时要通过迂曲的途径,这可能是药物进入生物膜受阻的原 因。 生物膜耐药相关基因的表达:白念珠菌生物膜耐药还可能与某些基因的表达 有关。外排泵编码基因CDR1、CDR2和MDR1的过度表达是游离态白念珠菌对唑 类药物耐药的重要机制之一,它们的过度表达可将进入白念珠菌细胞内的药物泵 [32] [33] 出胞外 。Mukherjee 等构建了CDR1、CDR2、MDR1双基因和三基因白念珠 菌缺陷株,发现缺少CDR和MDR1基因的变异株形成的早期生物膜比中晚期的生 物膜对氟康唑的敏感性要高,而由变异株与母株形成的成熟的生物膜均对其有高 度耐药性。Rh123外排试验也发现,在生物膜形成早期,其对Rh123 的外排率较 游离态白念珠菌高 P 0.0006 。但在生物膜形成晚期二者无明显差异。麦角固 醇水平在白念珠菌生物膜形成的中期和成熟期与早期相比有明显下降。说明麦角 [34] 固醇可能参与了中期和成熟期生物膜的耐药 。 3 控制耐药真菌感染的策略 3.1 研发抗真菌药物113.1.1新一代三唑类衍生物 许多新的三唑类抗真菌药如伏立康唑、泊沙康唑posaconazole、雷夫康唑 ravuconazole等开发应用于临床。伏立康唑是目前 FDA 批准治疗曲霉菌感染的 [35] 首选药物,在体外和体内均对耐氟康唑的念珠菌和曲霉菌有较强的抗菌活性 。 而且伏立康唑很少出现毒副作用,对全身重要脏器损害少见,视觉障碍是昀 多的不良反应。其抗菌谱广,抗菌活性明显增强,体外抗念珠菌活性明显高于氟 康唑,对克柔念珠菌等耐药菌株也有很明显的抗菌作用。泊沙康唑对于多数念珠 [36] 菌属、新型隐球菌属、曲霉菌、镰孢菌属等均具有广谱抗菌活性 。但由于对 氟康唑和伊曲康唑耐药菌株不断增加,唑类药物之间的交叉耐药对新的唑类药物 的应用带来明显负面影响。 3.1.2 干扰细胞壁葡聚糖合成的抗真菌药物 富含葡聚糖和几丁质的真菌细胞壁是真菌的特有结构,其作用是维持细胞内 的膨胀压力,保持菌体的完整性,若其受到破坏必导致菌体的溶解。通过干扰或 抑制上述成分的合成,能有效地抑制和杀灭真菌,而哺乳动物的细胞上没有细胞 壁,故避免了药物可能对哺乳动物造成的毒性。尼可霉素和多氧霉素是两类几丁 质合成酶抑制剂,因其结构与几丁质的前体尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖类 似而竞争性抑制几丁质合成酶。几丁质合成酶抑制剂的抗菌谱比较窄,将这类药 物与其他的抗真菌药物联用可以扩大抗菌谱,提高药效。迄今发现的β-1,3-葡聚 糖抑制剂主要有脂肽类、糖肽类、环肽类及萜类等四大类。现已有两种脂肽类的 [37] β-1,3-葡聚糖合成酶抑制剂上市:卡泊芬净和米卡芬净 。此类药物对多种念珠 菌和曲霉菌有效,加之由于作用机制不同,可与氟康唑和两性霉素B 联合应用, 已成为抗真菌药物开发的热点。 3.1.3 其他 PLD-118,一种新型抗真菌药,通过竞争性抑制异亮氨酸-tRNA合成酶,干 [38,39] 扰真菌蛋白合成,影响真菌延伸。其在体内具有高效抗白念珠菌活性 。 H-ATP 酶调节剂 CAN-296,它易穿透细胞壁,干扰细胞膜上 H-ATP酶,抑制药物排出, [40] 发挥快速而高效的杀菌作用 。另外天然植物提取物,如茶树油、白蒺藜提取 [41-43] 物甾体皂苷 TTS-12和 TTS-15 也具有良好的抗真菌作用。上述新的抗真菌药 物在体外对耐氟康唑白念珠菌均有较高的抗菌活性。它们对耐氟康唑白念珠菌的 12MIC值比氟康唑降低几十甚至几百倍。 3.2 药物的新剂型 3.2.1 脂质体两性霉素B(L-AmB) 两性霉素B(AmB)是强效杀真菌药,但其较强毒副作用严重限制了临床应 用。目前对其进行降低毒副作用的研究,如脂质体两性霉素B(L-AmB),是在 AmB分子的外面包裹了生物脂质体,通过脂质体的携带可改善药物在体内的分 子代谢,较多地分布在肝、脾、肺,而在肾组织中分布减少,L-AmB进入体内 可直接结合至真菌的感染灶,吸附于真菌细胞膜表面后,真菌产生的磷脂酶能水 解L-AmB 中的脂质,脂质体中的AmB破裂后逸出,渗入菌体,并以高浓度集中 [44] 于该处组织,杀灭大量真菌 。目前L-AmB有三种剂型:两性霉素B脂质体 Ambisome,两性霉素B脂质复合物(amphotericin B lipid complex, ABLC) 和两 性霉素B胶质分散体(amp-hotericin B colloidal dispersion, ABCD)。所含成分及结 构不同,其在体内的代谢与分布也有所不同。与AmB比较,它们都能增强抗真 菌作用并减少不良反应,尤其减少肾毒性反应。 3.2.2 制霉菌素脂质体 制霉菌素属多烯类抗真菌药,具有广谱抗真菌作用,对新生隐球菌、念珠菌 属、曲霉菌等均有良好作用,但经皮肤粘膜用药不吸收。口服后血药浓度极低, 几乎全部自粪便排出,对深部真菌感染无治疗作用。所以在临床上仅限于局部应 用,治疗口咽部、胃肠道及阴道真菌感染。通过将游离制霉菌素包裹在多层脂质 中,已研制出注射用制霉菌素脂质体,在降低其肾毒性的同时仍保留其抗菌活性。 3.2.3 灰黄霉素的卵磷脂脂质体新制剂灰黄霉素是一种上市已近半个世纪的广谱抗真菌老药。但由于有严重的肝毒 性故不宜口服,只能外用治疗包括头癣、股癣、体癣、足癣和手癣等皮肤真 菌感 染。在20 世纪90 年代已开发出灰黄霉素的卵磷脂脂质体新制剂。动物实验表明, 其肝毒性大大低于常规灰黄霉素口服剂,从而使灰黄霉素可用于治疗包括隐球菌 性脑膜炎在内的多种严重深部真菌感染疾病。 3.3 联合用药 由于许多真菌感染的难治性特征,联合治疗越来越作为增强抗真菌疗效,降 低耐药性,降低潜在毒性的一种手段。从理论上讲,不同种类的抗真菌药有不同 13的作用机制和作用部位,联合应用可能有协同作用或相加作用,并可以减少单一 用药的剂量及其毒副作用,缩短疗程,还可降低耐药的发生率。然而,对难治性 真菌感染尚无充分的临床研究资料支持联合抗真菌治疗的益处胜过单独治疗。对 于联合用药还需要进行大样本的临床研究,以出安全可靠的用药。联合 用药包括两种抗真菌药联合使用及一种抗真菌药与一种其它药物制剂联合使用。 3.3.1 抗真菌药物之间的联合 唑类药物和丙烯胺类,因这两类药物作用于真菌麦角固醇合成的不同位点, 唑类抑制细胞色素 P450 类固醇合成酶,丙烯胺类则抑制角鲨烯环氧化酶,都可 [45] 导致麦角固醇合成减少,故有可能产生协同或相加作用 。 临床研究表明两性霉素和5-氟胞嘧啶联合使用治疗严重的念珠菌病的有效 率明显升高。此外,两性霉素脂质体和卡泊芬净在剂量下联用时安全且耐受 [46] 性好,副作用并无加重,亦无新的副反应产生 。 但并非所有的抗真菌药物联 合使用时其疗效均优于单用等剂量的抗真菌药。联合使用抗真菌药的疗效与用药 种类、用药顺序及用药剂量相关。 3.3.2 抗真菌药物和非抗真菌药物间的联合 [47] Marchetti等 发现环孢霉素在体外可提高白念珠菌对氟康唑的敏感性,在小 鼠白念珠菌心内膜炎、小鼠肾脏白念珠菌病的疾病模型中,环孢霉素与氟康唑联 合治疗组的有效率高于氟康唑、两性霉素 B、环孢霉素单独治疗组。 [48] Schuetzer-Muehlbauer等 发现FK506、GP382、环孢霉素等在体外可逆转CDR介 导的白念珠菌对氟康唑、酮康唑的耐药,并且证实该类药物是通过抑制Cdr1p、 Cdr2p而起作用的。但有研究发现氟康唑和环胞霉素的协同杀菌作用不依赖 [49] CDR1、CDR2、CaMDR1、FLU1编码的多药外排蛋白 。氟康唑和FK506 联合 使用时对耐钙调神经磷酸酶抑制剂的白念珠菌无效,推测FK506发挥增效作用可 [50] 能与钙调神经磷酸酶有关 。因环孢霉素、FK506均为免疫抑制剂,有较大的心 肾毒性,故它们与唑类药物联合使用治疗白念珠菌感染的可行性较小。氟康唑和 氧氟沙星体外联合使用时无协同作用,但体内两者合用时具有协同作用,能明显 降低患有由耐氟康唑白念珠菌引起的系统性念珠菌病的小鼠的肾脏真菌载量,并 [51] [52] 初步证明与作用于外排泵,减少药物外排有关 。Quan等 用40株耐氟康唑的 白念珠菌观察体外氟康唑和盐酸小檗碱的相互作用,发现两者联合使用时对32 14株菌表现为协同作用,8株表现为相加作用,未发现有拮抗作用。另有体外 实验 发现氟康唑和抗氧化剂联合使用时后者通过与膜磷脂相互作用提高氟康唑与细 [53] 胞膜的亲和力,增加进入细胞内的氟康唑的量 。 3.4免疫调节剂的应用调节改善机体的免疫功能是预防真菌感染和防止真菌产生耐药性的重要措 施。当机体免疫功能低下时,容易发生真菌感染,临床上许多治疗失败也与机体 免疫功能低下有关。在抗真菌治疗的同时,使用免疫调节剂提高机体的免疫功能, 可能更有利于迅速清除感染的真菌,减少耐药性的产生。临床常使用细胞素防止 原发性和继发性的耐药菌株的产生,但其有效性仍有待证明。细胞素如粒细胞克 隆刺激因子、γ-干扰素、免疫效应细胞对防止耐药菌株的产生似乎有效,细胞 功能如其生活周期、抗体介导的细胞毒作用、氧化代谢物等和宿主对真菌感染 的免疫反应等可能在使用细胞素后有所改善。 3.5 增效剂与汉防己甲素(TET) 3.5.1国际抗真菌药物活性增效剂的相关研究 相比较加大抗真菌药物剂量和联合用药所带来的不良反应的增加,现有药物 结构的修饰所带来的耗时与价格的昂贵,寻找一种天然药物作为抗真菌药物的增 效剂,是一种新的思路与尝试,目前国外研究未见类似报道,国内仅有本课题的 系列研究。 3.5.2汉防己甲素TET的药理作用及安全性 汉防己甲素(TET)又称粉防己碱,是千金藤属植物粉防己块根中的主要成 [54] 分,含量约 1%,分子式为 C H N O ,化学结构属双苄基异喹啉类化合物 。 33 42 2 6 TET又是一种非选择性钙通道阻滞剂。目前已发现其具有抗高血压、抗心肌缺血 2 + 及再灌注损伤、抗心律失常、拮抗 Ca 通道、抗矽肺、抗肿瘤、抗过敏抗炎及 免疫抑制、解热镇痛等作用。已用于临床的有抗高血压、抗矽肺、抗心律失常、 [54,55] 抗肝硬化门脉高压等 。在我国已有很长时间的临床应用历史,其疗效和安全 性均得到普遍认可。近年来研究发现,TET对逆转肿瘤细胞对化疗药物的多药耐 药有良好的效果。临床上应用TET治疗高血病已有多年的历史,一般用量是100 mg,3次/天。 临床研究显示,TET对高血压患者具有良好的降压作用,临床症状消失,却没有 15[56] 明显的反射性心动过速等副反应 。临床研究发现,口服TET 100 mg,3次/天, 连续14天,能降低肺动脉高压,同时改善肺血气及右心室功能,对心率和正常体 [57] 动脉压无影响,且副作用极小 。在抗肝纤维化方面,TET能提高患有肝硬化大 鼠血清ALB水平,降低HA水平,显著减轻胆道梗阻。同时能有效地增强肝脏自 由清除能力,抑制胆道梗阻后肝脏脂质过氧化损伤,使肝纤维化程度明显减轻 [58] 。TET在逆转肿瘤耐药方面,现在临床上一般采用的方法为治疗前5天开始服 [59] 药,100 mg,3次/天,10天为一疗程,如有必要可在停药5天后开始第2个疗程 。 TET 进入大鼠及人体后,大部分以原形存在,少部分进行转化,已鉴别出 的产物有汉防己甲素- N - 2 -氧化物异构体和 N - 2 - 去甲基汉防己甲素。体内半 衰期 90min ,清除率为 38. 6L /kg /h 。在常用量时,TET无毒性作用,偶可引 起色素沉着性药疹。 TET昀小致死量: 蟾蜍前淋巴囊注射时为 1000 - 1200mg/kg ; 小鼠腹腔注射时为 700~800mg/ kg ;家兔静注时为 40~42mg/ kg。 3.5.3 汉防己甲素逆转肿瘤耐药的相关研究 [60] 许文林,敖忠芳等 采用自身对照的方式,观察 TET 逆转血液系统肿瘤细 胞多药耐药的临床效果,22例受试患者中 17例取得好转,其中 8例取得完全缓 [61] 解,缓解率为 36. 4 %。许文林,江云伟等 研究了 TET对慢性粒细胞白血病急 性变白血病细胞株 K562/ADM(ADM 耐药细胞株)MDR 逆转的机理。流式细 胞仪检测结果发现,TET 明显减低了细胞表面 P-gp 的表达,将耐药细胞株 K562/ADM 内的 ADM 浓度提高了近 15 倍,恢复了耐药细胞的化疗敏感性。用 荧光定量 PCR检测 MDR1基因的表达,发现 TET能下调 MDR1的 mRNA表达, 引起细胞内 P-gp 的减少,昀终导致细胞内化疗药物的明显增加。另外,该研 究 还发现,经 TET作用后,K562/ADM 细胞在 ADM 存在下,凋亡细胞明显增加, 推测这种促进细胞凋亡的作用也可能导致了 TET对 K562/ADM 耐药性的逆转。 [62] Fu等 发现TET浓度为2.5、1.25、0.625 ?m/L时能逆转人类乳腺癌细胞 MCF-7对阿霉素的耐药,使其IC 降低5.4-22.4倍。该实验还观察了TET在非细胞 50 毒性剂量下体内对MCF-7的逆转作用,发现予患有MCF-7诱导的乳腺癌小鼠同时 腹腔注射阿霉素4 mg/kg及TET 30 mg/kg,隔天一次,能显著抑制肿瘤生长且不 增加阿霉素的毒性。而两者单用时均无抗癌作用。证实TET是通过减少P-gp介导 的阿霉素的外流,及降低细胞膜脂质成分的流动性而增加了MCF-7/Adr细胞内的 16阿霉素的浓度,逆转P-gp介导的肿瘤细胞耐药。 [63] 李文俞等 用 MTT法测定柔红霉素的 IC 及荧光法测定细胞内柔红霉素浓 50 度,发现加入 TET组 IC 值下降 94.1%, TET通过提高耐药细胞株 K563/A02(耐 50 阿霉素)细胞内柔红霉素浓度,增加柔红霉素抗 K562/A02 细胞的作用。 [64] 孙付军等 观察TET对模拟临床化疗PFC方案诱导的小鼠S180细胞多药耐 药的逆转作用。TET降低肿瘤细胞耐药基因表达产物P-gp的过度表达,增加对细 胞凋亡因子Fas、 Trail表达率,增加耐药S180细胞的凋亡,降低细胞粘附因子CD54 的表达。 [65] Wang等 检测了从防己诺林碱和汉防己甲素中提取的新的双苄基异喹啉类 生物碱类衍生物逆转P-gp介导的耐长春碱(VBL)的小鼠白血病P388细胞 (P388/ADR)对长春碱的耐药的能力。研究发现5, 14二巯基汉防己甲素能使细 胞内VBR浓度明显升高,从而提高P388/ADR对VBL的敏感性,使VBL的IC50降 低了100倍。体内实验发现尽管两药联合使用能延长患有白血病的小鼠的寿命, 但增效作用不及体外强,可能与它具有较高的疏水性有关。该实验还证明其是通 过抑制P-gp的功能而不是降低P-gp的表达。 3.5.4汉防己甲素作为抗真菌药活性增效剂的有关研究 [66] 李丰霞等 以来自同一亲本的包括氟康唑敏感株、氟康唑剂量依赖性敏感 株和氟康唑耐药株的 16株白念珠菌为研究对象,通过体外实验发现 TET在?40g/mL、?2 ?g/mL时其与氟康唑联合使用可分别不同程度地降低氟康唑对白念 珠菌酵母相及菌丝相的 MIC,且成剂量依赖性相关。同时利用流式细胞仪技术 检测未加入与加入 TET,蓄积/外排实验后白念珠菌酵母相 Rh123 阳性细胞率的 变化。检测结果显示:未加入及加入 TET,蓄积实验示白念珠菌酵母相 Rh123 2平均阳性率分别为 26.65%及 70.99%(已去除本底对照),差异有显著意义(χ 62948,P 0.000),认为加入 TET后,白念珠菌酵母相 Rh123阳性细胞显著增 多,即 Rh123蓄积增多。未加入及加入 TET,外排实验示 16株白念珠菌酵母