【doc】高压液相色谱分析测定正常及癌症病人尿中的多胺

【doc】高压液相色谱测定正常及癌症病人尿中的多胺 高压液相色谱分析测定正常及癌症病人尿 中的多胺 磊缎茅套 , 压液相色谱分析测定正常 禹鼬 及癌症病人尿中的多胺, 中日友好医院临床医学研究所生化室 李树森吴翠,马宇玲李艺钟建范幕贞 ?_--一—_,一 本文用一与压液相色谱法(HPLC)分析测芷7d倒肿寤患者~,-60例正'曾人尿中多 胺,其结果表 明一肿瘤病人尿中腐胺,精眯精胺噩3种多脑总平均值分剐寿正常人的 2.24.9,11.2,3.6倍, 都有非常明显的统计学差异(P<0.005),特别是肺癌和食管癌更为显着 (P<0,001).证明谅 方法可用柞诊断癌瘤和观察疗效的生化指抒 关键词尿多胺精脒精胺高压液相色谱 生理性多胺主要有腐胺(1,4一二氨基 丁烷),精脒(1,3,一三氨基庚烷)和精 胺(1,3,7,10一四氨基癸烷)等.它们广泛 存在于生物体内,与细胞生长有密切关系, 在生物大分子合成中起重要作用.各种生长 状态不同的组织所含多胺的量也各不相同, 生长旺盛的组织多胺含量增高.1971年 Russell等用高压电泳法测定尿中的多胺, 发现癌症患者尿中多胺含量增多.远藤等 用高速液体层析法分离测定血液中的多胺含 量,发现有的肝癌患者血中多胺高于健康 人.范幕贞等.在柱层析后,用纸电泳分离, 再用分光光度法测得癌症患者尿中多胺明显 高于正常人.但这种方法灵敏度不够理想, 操作繁琐.本文采用高压液相色谱法分析'冽 定癌症患者尿中多胺的含量,以达到癌瘤诊 断和疗效评价的目的.并可用于多胺代谢机 理方面的研究. 与方法 一 ,试剂 1.腐胺,精脒,精胺均系瑞士FIuka公 司产品,用前制成盐酸盐. 2.邻苯二醛(o—phthaladehyde)瑞士 Fluka公司产品. 3.乙睛(Acetonitrile),德国Merck 公司产品及浙江黄岩化学实验厂产品,色谱 1990年第L卷第4翔 试刹(一级). 4.离子对色谱试剂(IPR-B),天津市 化学试剂二厂产品. 5.其它试剂均为一级或分析纯商晶. 二,尿样处理 取第1次晨尿1.6mI,加12NHel0.4 m1,使最终浓度为2.4N,摇匀,通入氮气 后密封,置105?烤箱中水解5小时.离心 (3000rpm,10rain)取上清0.5ml,加热 至50?,同时通入压缩空气或氨气吹干,再 用0.5ml0.INHCI溶解置冰箱备用. 三,肌酐测定 苦味酸法 四,HPLC测定多胺方法 HPLC是用日立(HITACHI)公司出 产的035A型,13立牌荧光检测器,激发光 波长为EX一360,发射光波长为EM-440, (LKB 梯度洗脱器(LKB一11300),器 一 2210—2)和柱后荧光反应器等均为自行装 配.层析柱(4×150mm)为ODS(日立一 3056),粒度1O.Um. HPLC是借助泵的压力使流动相通过微 小颗粒的固定相,将不同平衡分配系数的物 质分离开.本层析采用反相离子对柱,使硅 胶化学键台8烷基(IPR-B)的"分子毛" 与弱极性的多胺缔台,进行分配.根据不同 2 多胺的分配系数不同,将3种混台的多 胺分离成3个色谱峰(图1B)分别取3种 标准多胺的的不同浓度进行分析,结果表明 不同浓度(O.2-0.8nmoles)的色谱峰值成 线性关系(图2). 圈1正常墒病人累中多胺及标准多胺HPLC 井析图谱柱4×150ram(i0m) 流靖柑{乙脯:0.2M乙酸铺(:7VIV) 流量l1.5ml/min 荧光检测 I|_ . I !r ? ! ? 2T2 洗脱液配法sA溶液0.IM乙酸钠, 0.005MIPR—B(20m1),pH4.5;B溶液} 0.2M乙酸钠,0.005MIPR—B(20m1),pH 4.5,乙腈(7:3,V/V),(均用乙酸调pH) 荧光溶液配法O.6g邻苯二醛,加10ml 甲醇(优级)溶液后,再加入10mit酸乙酯 和4.5ml巯基乙醇,再与含有25g硼酸,25g KOH,3mlBrij35(30,W/V),5.8g硫 酸氰钾的溶液混合,再加双蒸水到1000ml 层析条件先用A溶液平衡6分钟后, 在上样品的同时,开始B溶液梯度洗脱,并 记录.流量1.5mI/min,压力140kg/cm,柱 温25?,进样量251.洗脱45min,B溶液达 100时,再用A溶液平衡.如不再运行, 应把整个系统换成甲醇. 结果与讨论 经过HPLC分析分离的多胺与柱后反应 器中的邻苯二醛的荧光物质反应后,所有的 多胺都标记上荧光物质,再经过检测器,测 定正常及癌症病人尿中多胺的含量.这是一 种灵敏度高(100pmoles),操作简便,快速, 易于应用肿瘤临床诊断和疗效评价的生化方 法.本实验测定了6O例正常人及74例癌症病 人的尿样.取上述处理好的正常人及癌症病 人的尿样,在HPLC上进行分析测定,其结 果见图1(A)及(C). 将测定的正常人和癌症病人的所有尿样 进行统计学处理(表1)后,癌症病人尿中 3种多胺(腐胺,精脒,精胺)均比正常人 高,升高倍数分别为:腐胺2.2(P<0.001); 精脒4.9(P<0.005);精胺n.2(P<0.005), 都有非常显着的差异J癌症病人尿中多胺的 总量高于正常人的3.6倍(P<0.001),更有 显着的差异. 本文中放检测的6种肿瘤病人尿中多胺 均比正常人明显增高,其中肺癌(P< 0.o1),食管癌(P<o.001)等(表2) 更为显着此与范慕贞等.测定结果基本一 中耳肿艚临床 [ILIIz言nz*善 线 准 蓦量 多胺胖暗 补腐糖精三.×. 图 袭1正常人豆癌请人屎中多胺的含量 注X?标准误P<O.o01}P<o.o1 圈3正常厦癌病人尿中腐胺古量柏分布比较 致.目前证明:细胞增殖迅速的恶性肿瘤腐 胺升高明显",本实验结果表明t几乎所有 癌症病人尿中腐胺含量都有增高(图3). 可能用腐胺作为癌瘤诊断的参考指标,更优 于其它多胺. 从图4可见,正常人尿中多胺含量的总 平均值为16.88nmoles/mg肌酐,分布在该 1990年第17卷第4期 {$}P<O.05 平均值以上的有18例,占3O,以下的有42 例,占7O癌症病人尿中多胺含量分布在 正常人总平均值以上的有61侧,占82.5, 分布于平均值以下的有13例,占17.5.不 难看出多数癌症病人尿中多胺含量高于正常 人的平均值,仅有较少数的交叉从不同癌 症病人尿中多胺含量与正常人比较的分布图 (图5)可以看出,肺癌和食管癌与正常比 较交叉更少.但这种交叉符合生物学规律, 有两种可能一是癌症病人的多胺排泄量与 肿瘤大小或恶性程度有关,瘤小,恶性程度 低,多胺排泄量则少一些,=是正常人也 有使多胺排泄量增高的可能.有人证明.: 如药物影响,组织增生,炎症等也可能使多 胺排泄量增加.在取正常人尿样前未经体格 检查,后来发现,有的人早有炎症病史,故 其尿中多胺含量较其它正常人为高.一经发 现,即从正常组中删除,但还可能有些未被 发现者难免影响检测结果.如能严格选择正 常对照组,相信这种交叉还会大为减少. 尿中多胺的变化与肿瘤生长有极为密切 2"' 圈{正常及癌病』'屎中总多胺含量酌井布比较 睦I5正常显不同癌捐^尿中多胺古量的舒布图 的关系,在肿瘤迅速生长的情况下,尿中多 胺排出量增加,当肿瘤被切除或受到抑制 时,尿中多胺排出量减少,有些则恢复正 常,已被许多研究所证明".用高压液相 色谱法检测癌瘤手术前后尿中多胺的变化, 214 鉴定手术疗效是一个较理想的监测方法.目 前较常选用的测定方法是高压液相色谱法和 放射免疫测定法.有些人用这两种方法测定 体液中的多胺,但由于血清多胺测定,采血 量较大,多次采血对病人不利,而测定病人 尿巾多胺则是对病人毫无影响的一种理想的 生化指标.由于少量交叉问(图4,5)尚 未解决,影响高压液相色谱法测定尿中多胺 的诊断价值,但对肺癌,食管癌(图5)等 交叉很少的癌瘤则有较高的诊断意义.特别 在癌变机理研究,』陆床治疗效果的评价及 抗癌药物筛选等方面都有一定的应用意义. 目前已发现:肿瘤治疗显效后,尿中多胺 大量减少,其中又以腐胺减少更为明显. Fujita,Russell和Ashman等测定了实 体瘤病人治疗前,后尿中多胺的变化.治疗 前病人尿中多胺含量为17.1lmg/24hr,治疗 后则降为g.47mg/24hr,接近于正常人尿中 多胺的含量(8.7amg/24hr).因此,可以证 明:该方法用于癌症患者疗效观察和药物筛 选等,是一个目前较好的生化指标. (本立承我院胸外科,昔外科太力支持,提供痈盎病 ^的履样.并得』赵清洁和王风娟的协勖,特此致姑) 参考文献 1.RusselDH,Natafe233:14,1971 2.远藤康击等,《医学0南咿》106:282,l978 3.范幕贞等,中华医学杂志59:89,1979 .SchultzHP.JACS7012666,1948 5-Se1LerN,Mechods;nEazymo1ogy94:29, 1983 6.ChapekarMS.CancerRes44:2144.1984 7.Ue~.araN,LifeSei26:461.1980 8.RltsseIDHetal,Ca.telRes31:蹦8'】971 9.Dur:eBGM.CancerRes3:214.1977 1o.Sug~uraMetal,CancerRcs4z1440,1984 11.MartomLJeEal,ClinChefn19z923,1973 12.F,j~tattetaT.CancerRes36:132o.1976 13.AshmanWHGetaI.CaaeerRes821IS2{. 1972(下转第218页) 中国肿籀临床