复方大果木姜子乳膏体外抗HSV1病毒的实验研究【文库论文】

复方大果木姜子乳膏体外抗HSV1病毒的实验研究【文库论文】 复方大果木姜子乳膏体外抗HSV1病毒的实验 研究 ====================================================================== 【摘要】 目的通过对复方大果木姜子软膏?号、?号、?号3个制剂处方水提、醇提物体外抗病毒作用的研究，优选出一个最佳组方提取工艺，为进一步将其开发成一种安全有效的治疗单纯性疱疹病毒的中药新药提供依据。通过细胞培养法，采用观察细胞病变(CPE)和噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性，观察复方大果木姜子软膏提取物抗病毒感染的作用;以治疗指数(TI)为评价指标，比较各处方的抗病毒活性强弱。结果复方大果木姜子软膏?号，?号，?号三个处方其水煎液及醇提液都有不同程度的体外抑制 在细胞中增殖的作用;其中?号处方的水提取物作用最强。结论 选用复方大果木姜子软膏?号处方采用水煎提取作为制剂研究的最优处方工艺。 【关键词】 复方大果木姜子软膏; 细胞培养实验方法; 抗病毒活性; 处方筛选 大果木姜子Cinnamomum migao H. W. Li系樟科樟属植物米槁的干燥果实，是贵州十大苗药之一。现有的研究表明，大果木姜子具有增加血循环、改善心肌缺血、抗流感病毒,1,4, 等作用。通过前期的实验研究已证明了大果木姜子精油具有良好的体外抗病毒作用(大果木姜子精油体外抗病毒实验研究待发表)，为将其更好地开发为一种治疗单纯性疱疹病毒的复方药物，本研究采用细胞培养技术对大果木姜子精油与其它药物组成的?号，?号，?号3个处方，进行抗病毒活性研究，现将实验结果报道如下。 1 材料与仪器 1.1 试剂材料 培养(GIBCO公司);胰酶(GIBCO公司);新生牛血清(杭州四季青生物制剂公司);平衡盐液:Hanks液;噻唑盐(MTT，北京天港邦定生物医学科技有限公司)，其它试剂均为纯。 MTT溶液:称取50 mgMTT，放入小烧杯中，加入50 ml维持液，过0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，分装于小试管中，放于,4?冷藏室中保存，两周内有效。 培养液:含10%新生牛血清的培养液(含1×105 u?L-1青霉素，100 mg?L-1链霉素，0.2%heps)。维持液:成分同营养液，但小牛血清浓度为2%。临用前用5.5%碳酸氢钠液调pH值为7.4，4?冰箱保存备用。 消化液:胰蛋白酶液(0.25%胰蛋白酶加入0.01%EDTA，0.22 μm的微孔滤器除菌)。使用前用5.5%NaHCO3调整pH值为7.6。 1.2 药物的制备以大果木姜子精油为主，分别配伍:珊瑚姜、杠板归、飞龙掌血、苦参、土荆皮、蛇床子、花椒等药物组成?,?号方。?号、?号、?号试验药物用70%的乙醇加热回流提取?号，?号，?号3个处方，另加入超临界萃取的大果木姜子精油及0.5%吐温作为增溶剂，搅拌混匀，即得。?号，?号，?号试验药物用水煎煮提取?号，?号，?号3个处方，另加入超临界萃取的大果木姜子精油及0.5%吐温作为增溶剂，搅拌混匀，即得。以上药物用0.22 μm的微孔滤器除菌。 本实验中所列药物的浓度是按原生药浓度计算(大果木姜子精油按出油率 计算)。 为10% 1.3 仪器二氧化碳细胞培养箱(Thermo electron corporation);超净工作台(苏州净化设备厂);数字照相机:;倒置显微镜:尼康 ;低速离心机:北京医用离心机厂);通用酶标仪 (美国产品)。 1.4 细胞细胞株:人喉癌细胞(细胞株由贵阳医学院免疫学教研室保存)。 1.5 病毒株病毒株:，由贵阳医学院基础医学院——组织培养及干细胞研究中心提供。在Hep,2细胞上复壮三代，传代增殖后，分装使用。 2 方法 2.1 病毒滴度的测定用含2%新生牛血清的RPMI,1640维持液将病毒稀释成10，102，103，104，105，106，107，108，109，1010倍10个浓度，按常量分别加入已长成单层细胞的96孔细胞培养板中，置于37?，5%CO2温箱内孵育2 h，弃去含病毒维持液，更换正常细胞培养液，继续培养，分别于1，2，3，4，5，6，7 d在倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)程度。同时正常细胞对照。计算细胞半数感染量(TCID50)。 2.2 药物对细胞的毒性检测细胞用胰酶消化后，用培养液配成细胞密度为1×105/ml单细胞悬液，接种于平底型96孔培养板中(每孔加入0.2 ml)，适应生长24 h，至细胞生长呈单层。?,?号药液分别用维持液进行二倍量系列稀释，把不同浓度的药液加入到培养板中(100 μl/孔)，每个剂量组设4孔细胞。用透明胶带封口后，置于培养箱中继续培养，同时设另设正常细胞。培养72 h后，观察细胞病变(CPE)情况;并用噻唑蓝(MTT)比色法,5,检测细胞活性计算存活细胞的百分比。按Reed-Meuench法计算各处方药物对细胞的半数毒性浓度(50% Cytotoxity Concentration,CC50)。 细胞存活率(%)=试验孔平均OD值对照孔平均OD值× 100%药物对细胞生长的半数毒性浓度(CC50) CC50,Antilog,B + (50 - <50%抑制百分率/ >50%抑制百分率-,50%抑制百分率)×C,式中C=A-B;A=log(>50%药物浓度);B=log(<50%药物浓度) 2.3 测定各处方对HSV,1病毒液的治疗作用除第1列外(正常细胞对照列)其余各孔将100 TCID50浓度的HSV,1病毒稀释液0.1 ml加入到已生长呈单层细胞的96孔细胞培养板中，于37?，5%CO2孵箱中吸附2 h后。分别加入用维持液将?,?号制剂药液已稀释成不同浓度的制剂溶液0.1 ml/孔，每个浓度4孔，每种剂量组孔设4个重复孔，同时设细胞对照及病毒对照。放入37?，5%CO2培养箱中培养72 h，按上述MTT比色法测定细胞的活性，计算存活细胞的百分比。按Reed-Meuench法计算各处方对病毒治疗的半数有效浓度(50% Effective Concentration，EC50)。 病毒抑制率的计算: 病毒抑制率%=,实验孔(药物+病毒)平均OD值-病毒对照孔平均值,(细胞对照孔平均值-病毒对照孔平均值×100% 药物对细胞生长的半数有效浓度(EC50) EC50,Antilog,B+(50 - ,50%抑制百分率/ ,50%抑制百分率- ,50%抑制百分率)×C,式中C=A-B;A=log(,50%药物浓度);B=log( ,50%药物浓度)。 3 结 果 3.1 病毒滴度通过 Reed-Meuench法计算病毒的半数感染量TCID50为105/100μl。实验使用病毒攻击量为100 TCID50。 3.2 药物对细胞的毒性通过观察?,?号制剂药液的最大无毒浓度CC0分别为:100 mg/ml;?、?号制剂CC0分别为50 mg/ml。MTT法测定细胞存活率显示?,?号制剂药液在浓度分别为100 mg/ml 时，细胞的抑制率为102%，88%，91%，80%;?,?号制剂在浓度50mg/ml 时，细胞的抑制率为90%，76.1%，说明在此浓度下对细胞已基本没有毒性。?,?号制剂的半数细胞毒性浓度(CC50)分别为:200，200，,200 ，200，122.6，95.5 mg/ml。 3.3 制剂处方对病毒的治疗作用实验结果表明，?,?号制剂处方在不同浓度下，都具有降低所致的CPE作用，且病毒抑制率随着药物浓度增加与药物浓度呈正相关。根据公式TI=CC50/EC50，通过实验计算出各处方制剂体外抗病毒的治疗指数。?,?号制剂体外抗病毒疗效结果见表1。表1 实验药物体外抗病毒疗效对比(略) ?,?号制剂处方制剂都有对病毒治疗作用;其中?号制剂处方MIC浓度最小，治疗指数最大:,256.4 4 讨论 4.1 对于药物的评价需要考虑其药效与毒力的相对关系，这个相对关系可用TI 表示。以治疗指数TI作为分析判断指标，结果:?号制剂液最优，即用?号处方水煎提取工艺，体外抗病毒疗效最优。 4.2 增溶剂空白对照实验证明，吐温,80在浓度为0.125%时，培养72 h后，细胞没有出现细胞病变情况;且对病毒没有产生明显的抑杀作用，说明选用吐温,80作为增溶剂是可行的。 实验结果表明各处方对HSV-1病毒的抑制都有一定的治疗作用，且治 4.3 疗作用与药物的浓度呈明显的量-效关系。 【参考文献】 ,1,覃仁安，孙学蕙，邱德文.米槁心乐滴丸抗心肌缺血作用的实验研 ,.中国药房，1997，8(6):251. 究,J ,2,孙学蕙，隋艳华，邱德文.大果木浆子油对麻醉猫血流动力学的影响,J,.中国中药杂志，1995，20(10):622 . ,3,孙学蕙，叶家齐，冯兴芬，等.大果木浆子油对离体内脏平滑肌的药理作用,J,.中药药理与临床，1990，6(2):32. ,4,邱德文，谢宝忠，孟宪容，等(大龙合剂抗流感病毒的实验研究,J,.贵阳中医学院学报，1991，(2):53. ,5,张卓然.实用细胞培养技术，第1版,M,.北京:人民卫生出版社，1997.