冷应激对雏鹅HPA和HPT轴活性影响及其相关基因表达调控的研究

冷应激对雏鹅HPA和HPT轴活性影响及其相关基因达调控的研究 冷应激对雏鹅HPA和HPT轴活性影响及其相关基因表达 调控的研究 冷应激对雏鹅和轴活性影响 及其相关基因表达调控的研究国家科技部支撑资助 . 扬州大学动物科学与技术学院 年月目 录 中文摘要??.. 第一章文献综述 .前言??“ .冷应激对动物影响机制的研究进展? ..冷应激的概念及其生理反应机制 ..冷应激对动物神经内分泌系统的影响...冷应激对交感神经.肾上腺髓质 系统的影响 ...冷应激对下丘脑.垂体.肾上腺皮质轴的影响 ...冷应激对下丘脑一垂体一甲状腺轴的影响“ ..冷应激对动物能量代谢的影响? ..冷应激对免疫功能的影响 ..冷应激的防制.动物冷应激反应中多种基因调控机制的研究进展? ..抗冻蛋白基因表达与冷应激? ..热休克蛋白基因表达与冷应激??” ..即刻早期基因表达与冷应激 ..诱导型一氧化氮合成酶基因表达与冷应激? .热休克蛋白调控机制的研究进展” .. 的组成和分子生物学特性 .. 的基因调控 ...转录水平的调控 .实时荧光定量.技术? ..实时荧光定量技术的原理“ ..实时荧光定量技术中荧光标记方法的分类??“ ... 探针法??” ...分子信标法 ..影响实时荧光定量试验结果的因素?一“ ... 的完整性? ... 反应体系的优化...反转录? ..实时荧光定量的定量方法? ...曲线法的绝对定量...标准曲线法的相对定量? ..荧光定量技术的应用??” .生物信息学研究内容与方法?“ ..生物信息学主要研究内容? ..生物信息学研究主要数据库.本研究的目的及意义第二章雏鹅冷应激反应 中?、丑叮轴激素含量的测定与 .材料与方法??” ..试验材料? ...试验鹅群 ...主要仪器 ...主要试剂 ..试验方法” ...样品采集 .数据处理? .结果与分析??一 .讨论 .小结 第三章冷应激对皖西白鹅某些血相指标变化的影响. .材料与方法..试验材料” ...组织样品 ...主要仪器??” ..试验方法” .统计分析? .结果与分析.讨论 .小结 第四章雏鹅冷应激反应中、轴应激激素相关基因表达调控 规律的研究??.. .材料与方法?“??”??”??” ..试验方法? ...提取前的准备工作??” ...总的提取? ... 质量和浓度测定? ...引物设计??” ...总纯化... 扩增” ...基因目的片段的克隆测序...实时荧光定量检测“ .数据处理 .结果与分析.. 提取结果..目的片段的同源性分析? ..扩增产物特异性“ ..不同冷应激时间内、、、基因差异表达规律.讨论??” ..实时荧光定量方法??一 ..冷应激对轴的影响? ..冷应激对轴的影响?母 .小结 第五章鹅基因克隆及生物信息学分析 .材料与方法..试验材料? ...组织样品??” ...主要仪器??” ...主要试剂??” ...主要溶液的配制 ..试验方法? ... 提取、纯化和...引物设计 ... 基因目的片段的克隆测序 .序列分析. 结果与分析 .. 提取结果.. 的扩增结果 ..鹅基因的生物信息学分析??“ ... 基因核苷酸序列同源性分析. 讨论. 小结第六章雏鹅冷应激反应中、 规律?.. .材料与方法 ..试验材料一 ...实验动物的分组 ...主要仪器??” ...主要试剂??” ..试验方法” ...样品采集 ... 提取、纯化和...常规对引物进行检测... 质量和浓度测定? ...引物设计 ...实时荧光定量条件的优化? .数据处理??一 .结果与分析?” .. 提取结果“: .. 的扩增结果..扩增产物特异性 ..不同冷应激时间内、轴基因差异表达规律 .讨论?” .卅、结?” 第七章全文结论? .主要结论 .研究的创新点。 进一步需要开展的主要研究工作??参考文献?. 致谢? 攻读学位期间发表的学术论文目录?. 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书?.性应答反应。劣性应激可 引起畜 。寒冷是雏禽最普遍的应激原之 一,由此引起的直接和间接经济损失是制约北方畜牧业发展的重要因素,研 究动 物冷应激发生机制,探索科学的应激监测方法,对提高应激预防水平,保障畜 牧 业发展有重要意义。冷应激对动物和轴为主的神经内分泌系统产生重要 影响。然而未见冷应激对雏鹅、轴的影响及其相关基因表达调控的研究 报道。本研究以日龄皖西白鹅为试验对象,研究于?士?条件下进行急性冷 应激处理时对、轴的影响。利用放射免疫法、..等技术动态考 察冷应激反应中血液生理生化指标、应激激素相关基因、、、 和基因的变化规律。同时采用.技术克隆测序基因 序列,并进行生物信息学分析。为深入研究动物冷应激机理,动物冷应激的 早期监测和防治提供重要实验依据。研究主要取得如下成果: .雏鹅受到冷应激时血相指标变化的测定结果 以日龄皖西白鹅为试验对象,研究于?士?条件下进行急性冷应激对皖 西白鹅雏鹅某些血相指标变化的影响。研究结果表明,全血中红细胞、红 细胞压积、血红蛋白、红细胞分布宽度总体呈减少趋势, 且在冷暴露、和冷暴露结束后.和极显著低于冷应激前的水平; 和在冷暴露、和冷暴露结束后时显著低于冷应激前的水平; 在冷暴露后至结束冷暴露后期间均极显著低于应激前水平.。 白细胞在冷暴露和时显著升高。淋巴细胞绝对值在冷 暴露时显著低于应激前的水平尸?,淋巴细胞百分比%在冷暴 露后、和时显著升高.,但冷应激时淋巴细胞百分比已经 恢复正常,雏鹅已经开始适应。首次获得了皖西白鹅血液生理指标参考值, 为兽 一 医临床诊断与治疗提供了重要依据之一。 .雏鹅冷应激时脚、轴应激激素测定的结果 研究于?士?条件下进行急性冷应激处理时对雏鹅下丘脑.垂体.肾上腺皮 质轴和下丘脑.垂体.甲状腺轴的影响。结果表明, 在冷暴露 和时显著升高。在冷暴露显著升高.,随后逐渐下降,至结束 冷暴露后显著降低尸.?。在冷暴露过程中逐渐升高,在冷暴露和结 束冷暴露后.和时明显高于应激前水平。在冷暴露和结束冷暴露后时达 血 到峰值。在冷暴露时显著升高酊,并在冷暴露期间保持高水平。 清中随冷暴露时间延长而逐渐升高,在冷应激时显著高于应激前的水平 .,至冷暴露结束后时,再次明显升高尸.?。、 和反应敏感,初步认为它们可以作为评估冷应激程度的辅助指标。 .雏鹅冷应激反应中、轴应激激素相关基因表达调控规律 采用技术对、轴应激激素相关基因、、和 克隆、测序,同源性比较,鹅基因测序序列与上鹅序列同源性为 %。鹅、、基因序列与上鸡、、基因序 列同源性分别为%、%和%。利用实时荧光定量逆转录技术分析这些基 因的表达调控规律。下丘脑基因转录量在冷应激.、、、、 与应激结束后、和显著升高,其他时间内均下降到室温时的转录水平。垂 体基因转录量在冷应激.至期间显著升高,应激时转录水平达 到最高点,而其他应激时间均降低到应激前的水平,应激结束后至期间垂体 基因转录水平也被显著升高,冷处理结束后已恢复到应激前的正 常水平。下丘脑基因转录量在冷应激、、时与应激结束后.、 和显著升高,其他时间点降到应激前的正常水平。肾上腺基因转 录水平在冷应激.、时显著升高,其他时间点均迅速下降到应激前水平; 冷处理结束后.和,由于又突然受到热的室温应激,基因转录量 又显著升高,其他时间点降到应激前的正常水平。 下丘脑基因表达呈现波动性变化趋势,但表达量均不超过.,说 明下丘脑基因是负调控的。下丘脑、垂体和肾上腺基因 的表达量分别在...、...、...范围内,总体呈上升趋势,说明、 和基因均是冷应激反应时的正调控基因。 .鹅基因的克隆和生物信息学分析 首次克隆了皖西白鹅基因序列,包括全序列 和序列,编码个氨基酸。与上乌棕鹅基因 序列进行比对分析,皖西白鹅基因共存在个核苷酸变异均在区, 只有个蛋白质位点的差异,编码区同源性序列比对,与乌棕鹅同源性达%, 与家鸭、鸡、日本鹌鹑基因编码区同源性序列同源性分别达%、%和 %,与哺乳动物同源性均高于%,进一步证实了在不同生物间的高度, 保守性。 利用生物信息学预测鹅蛋白质的结构与功能,结果表明,蛋白 质以亲水性区域为主;该蛋白具有丰富的细胞抗原位点;抗原表位区域、柔韧 性区域和表面可能性区域出现了较多的重叠区,这些区域相对易于形变, 便 于抗 原、抗体的自由结合,可能是抗原位点的富集区;该蛋白二级结构以【.螺旋 和无譬 规则卷曲为主,无明显的跨膜螺旋,含有个磷酸化位点,无糖基化位点,推测 其可能在细胞信号转导与调控中发挥重要作用。 .雏鹅冷应激反应中肿、轴 的动态表达规律 实时荧光定量逆转录法检测结果表明,下丘脑 转录量在冷 应激。?.、和显著升高,其他时间点均恢复到正常水平;在冷 处理结束后内 转录水平均显著升高,应激结束后转录水平最 高,随后又迅速下降到室温下的转录水平。垂体 转录量在冷应激 .、.、和时显著降低,其他应激时间均升高到应激前的水平,应激结 束后.、和转录水平也被显著降低,随后逐渐升高到应激前的正常水平。 甲状腺 转录量在冷应激.时显著升高,随后迅速下降到应激前的关键词:鹅; 冷应激;激素;克隆;生物信息学;组织表达;荧光定量,: ,基因;;:轴;轴 一, , . . . ,. 。 ?, . , , ,,,, , .,,,,,, ,.,,,,, . ? .. : ?. 嬲. ?. ,,, ... ? . , ? . .. ? .尸..% ., . , , .. 。士? . .. . 士?, ?.,., . . 一 ., .,... . .,,. %,% %, 、, ,, .?. 知.,,, ; .;. . ; , .; ? . . ; .. ; ’ .,.,..、..、.. ,. ,,一. ., .’ , . , .% , ?% . , , . . .,; .. .. . .?. . ; ; ,, 一 ; ...,., . .. ,, . ., ,. . . ., . . ? . .?.. .,. .? ., , .,。 . . :; ,,;; ; ; ; ;;;,; ;常用词语缩写 中文名称 缩写 英文名称 . 热休克蛋白基因 。。 。核糖体斟一氧化氮 中枢神经系统 室旁核 下丘脑垂体肾上腺皮质 ? 下丘脑垂体甲状腺 ?交感肾上腺髓质 . 疵咖 蛐 例耻腺皮霎激素释放激 促甲状腺激素释放激素 糖皮质激素促肾上腺皮质激素促甲状腺激素 聚合酶链式反应互补脱氧核糖核苷酸 编码区 。 血 ; 逆转录.聚合酶链式反应 强 开放阅读框 焦碳酸二乙酸 乙二胺四乙酸十二烷基磺酸钠 三烃甲基氮基甲烷 红细胞 ?毋 ?, 白细胞 订 淋巴细胞 中性粒细胞单核细胞 血红蛋白血小板 血细胞比容, 红细胞压积 平均红细胞容积 红细胞平均血红蛋白量 血小板压积皮质醇 三碘甲腺原氨酸 ?一 甲状腺素 游离三碘甲腺原氨酸 ,’.游离甲状腺素 反应管内荧光信号到设定 域值时经历的循环数 甘油醛磷酸脱氢酶 .. ‘ 。 饿 实时荧光定量 ? 脱氧三磷酸腺苷强 三羟甲基氨基甲烷 氨苄青霉素 异丙基?硫代半乳糖 ... 一 一. 一 苷 . 培养基 溴化乙锭基本局域联配搜寻工具 国家生物技术信息中心 美 四甲基乙二胺 ’,’一 。甲状腺激素’脱碘酶 抗冻蛋白 屠云洁:冷应激对雏鹅轴和轴活性影响及其相关基因表达调控的研究 第一章文献综述 .前言 气候是影响家禽生产性能和生理机能的重要外部条件之一。气候因素是指气 温、气湿和气压等,尤以气温对家禽的影响最大。当环境温度变化很大时,如天气 突然转冷,气温骤降,秋季日夜温差变化很大往往可达十几度,或者在北方, 尤其在冬天,长期保持寒冷的天气?以下,尤其是.?以下,家禽常常会产 生冷应激,造成很大的危害,表现为生长缓慢、饲料报酬降低、蛋鸡产蛋率明显下 降、发病率高及死亡率高等问。寒冷应激对雏禽的影响非常大,使体温调节功 能还不完善的雏禽死亡率非常高。冷应激引起的不利影响是制约畜牧业发展的主 要因素之一。年内蒙古东部大部分地区遭受雪灾,据不完全统计,全区受灾牲 畜 万头,因灾死亡牲畜万头,大量母畜因灾流产,造成许多死胎。极 低的环境温度加上雪灾,给北方畜牧业造成了严重的损失。年元月,持续冰雪 灾害给我国的上海、浙江、江苏、安徽等南方十多个省市家禽业带来重大的经济 损失。据统计,家禽因灾死亡万只;倒塌禽舍总面积万平方米,畜牧业累 计直接经济损失达.亿元,家禽所占的直接经济损失达亿元。如何提高家禽的 抗寒性,以提高家禽生产的经济效益,对于家禽业具有重要意义。 .冷应激对动物影响机制的研究进展 ..冷应激的概念及其生理反应机制 年创立的神经内分泌学说,是指机 应激是由加拿大病理生理学家 体对外界或内部的各种异常刺激所产生的非特异性应答反应的总和【】。应 激在典型 情况下可分三个阶段:第一阶段为惊恐反应或动员阶段 ,这是机体对应激原作用的早期反应。在此阶段家禽识别应激释放 肾上腺髓质激素交感神经系统释放儿茶酚胺迅速动用机体内的能量贮备糖 元分 解释放葡萄糖这一阶段时间短。但如果家禽耐受过即进入第二阶段,反之也 会 死【 激原 非特 常用 为衰 代谢 加, 死亡 状, 寒冷 生理 激反 和长期冷 根据低温作用时间的长短,通常分为急性冷应激 应激 。急性冷应激的冷暴露时间从几十分钟至不等,长期 冷应激的冷暴露时间从到几周不等。急性冷暴露时,动物产生的冷应激反应称 为“报警反应 ”;长期冷暴露时,动物的代谢发生变化,儿茶酚胺、 糖皮质激素、血管紧张素、甲状腺素等应激激素分泌增多,机体能量代谢持续 增强,动物由寒颤产热转到非寒颤性产热,继而应激激素水平和其他生理反应在 低温条件下达到新的平衡,此时称为冷适应。冷适应是生物机体 的一种整体适应性变化,涉及机体多系统、多层次的协调,是一种十分复杂的生 物机能调节过程。随着秋季到冬季的气候变化,动物生理调节逐渐发生变化,体 表绝热保温能力和血管运动适应能力逐渐增强,但能量代谢及产热量变化不大, 此时称为冷驯化。 为研究冷应激对动物的影响,以及动物对冷环境的反应机理,通常采取在实 验室或人为调控条件下对动物进行冷暴露处置。对动物冷适应的研究通常采用 周的连续或间歇冷暴露】。目前的研究以急性冷应激为主,而且,冷应激对动物的 屠云洁:冷应激对雏鹅轴和轴活性影响及其相关基因表达调控的研究 影响及其机理研究已逐渐成为研究热点。 ..冷应激对动物神经内分泌系统的影响 寒冷应激是新生动物的一种最普遍的应激因素,对家禽养殖的整个过程的影 响都非常大。冷应激反应的生理机制几乎涉及所有器官和组织,能量代谢、神经 内分泌、行为和生产性能等均发生改变,其中,中枢神经系统许多部位在整合调 节过程中起主导作用。下丘脑是调节体温的基本中枢,当外界环境温度下降超过 体内体温调定点阈值时,机体冷敏神经元兴奋,发放神经冲动频率增加,促使产 热活动加强,如皮肤血管收缩、骨骼肌紧张性增加等,同时热敏神经元兴奋性减 低,机体散热受到抑制,从而保持体温和内环境的相对稳定。在此过程中,动物 能量代谢、行为和生产性能发生改变,一系列神经内分泌反应发挥重要作用【。 寒冷应激反应的机制十分复杂,几乎涉及所有的器官和组织,其中,中枢神。. 经系统及其高级部位大脑皮层是起整合调节作用的主导部门,通过下丘脑一 交感神经一肾上腺髓质轴、下丘脑一垂体一肾上腺皮质轴及下丘脑一垂体一甲状.. 腺轴等实现的。 。 ...冷应激对交感神经.肾上腺髓质系统的影响 冷应激时,中枢肾上腺素能被神经元被激活,迸一步调节外周自主神经主 要是交感神经活动,使外周交感神经和交感神经.肾上腺髓质系统持续处于高度 激活状态,肾上腺素和去甲肾上腺素的合成、释放和转运增强吼与心血管活动及 内分泌活动有关的脑区有大量的血管紧张素神经元,血管紧张素在脑内可兴 奋交感.肾上腺髓质系统和下丘脑.垂体.甲状腺轴,是一个具有 广泛作用的兴奋性递质,与交感神经的中枢部分存在着相互加强的正反馈作用。 血管紧张素对离体肾上腺合成糖皮质激素也有促进作用。冷应激过程中 轴和系统相互作用,促肾上腺皮质激素释放激素增力活力, 使血浆儿茶酚胺增加;冷应激激活的系统通过增加肾上腺髓质儿茶酚胺的合 成和释放,促进轴激活,在应激反应中形成.去甲肾上腺素一 正反馈调节系统【。 届扬州大学博士学位论文 下丘脑.交感神经一肾上腺髓质系统是动物对付急性应激原时作出快速反应的 主要途径,该系统体现了神经系统反应迅速的功能特点,负责使动物对急 性应激原作好战斗或逃跑的心理、生理和行为方面的准备,而不是适应它。 ...冷应激对下丘脑.垂体.肾上腺皮质加轴的影响 如果冷应激原继续作用于机体,下丘脑.垂体.肾上腺皮质系统就会被激活。下 丘脑.垂体.肾上腺皮质轴及由此引起的糖皮质激素或糖皮质类固醇分泌 增加,是应激的最重要特础。这一反应的基本过程为下丘脑接受神经和体液途径 传来的应激原刺激,其视上核和室旁核分泌颗粒沿神经纤维到达垂体后叶,或通 过垂体门脉送至垂体前叶,从而调节垂体及其有关的生理活动【。 在应激中的作用一是调节作用,即改变有机体对应激刺激的反应;二是预 备作用,即改变生物体对后继应激刺激的反应,或有助于适应长期的应激刺激。 通过负反馈下调下丘脑和垂体。在应激状态下,糖皮质激素的分泌 对免疫系统的功能有负效应。这种关系已经作为检验阻止免疫系统体内平衡有益 糖皮质 的的反应超过其预期的功能,并且防止其转变为对畜禽的不利因素。 激素主要为皮质醇和皮质酮,它们是参与应激反应的主要激素。 很多研究者通常测定外周血中的皮质醇半衰期接近含量来反映应 激的程度。研究表明,动物在急性热应激时,血液皮质醇明显升高,然后渐降, 降至低于热应激前水平并趋于稳定,但若为渐进性冷应激,则皮质醇呈逐渐升高 的趋势,且趋于相对稳定水平。 杨焕民等【】试验测定雏鸡在冷暴露下体内相关激素的动态变化规律,发现组 雏鸡的皮质醇含量均成波动性,总的趋势是个试验组均在冷暴露后、 升高; 组之间相比,?组仅在冷暴露后 皮质醇含量高于?组,其余 时间均低于?组的水平。王建鑫等研究表明,急性冷应激对金定鸭皮质醇 的含量前期上升迅速,后期变化规律不明显,并在试验期间内出现了次峰值, 分别是应激后立刻出现的和在应激后出现的,同时在应激后有一个小的波峰, 其差异不显著【。当雏鸡处于应激状态时,皮质酮含量增高,血浆皮质酮水平越 屠云洁:冷应激对雏鹅轴和唧轴活性影响及其相关基因表达调控的研究 高,免疫抑制越明显。 ...冷应激对下丘脑一垂体一甲状腺阳轴的影响 动物对寒冷反应主要是引起下丘脑一垂体一甲状腺轴功能的改变。动物试验 证明,急性寒冷经皮肤感受器通过传入神经将寒冷刺激信息传到下丘脑,冷应激激 活下丘脑和下丘脑前部视前区等部位的合成和释放,进一步导致血浆中 促甲状腺激素浓度升高,随后甲状腺激素含量增高。是糖蛋白激素, 其主要作用是促进甲状腺的生长与合成,释放甲状腺激素的功能活动。甲状腺分泌 和两种激素以游离的形式发挥作用,具有加强组织氧化代谢活动,提高 耗氧量和产热量;促进糖类吸收、利用糖原的异生作用,升高血糖浓度;加速 脂 肪的分解【 。冷应激在激活轴分泌的同时,也激活了甲状腺以外组织中的甲 状腺素’脱碘酶’.,加速脱碘转化为活性更强的。一方面与交感神 经协同作用刺激产热增加,另一方面又刺激解偶联蛋白的基因表达【引。另外, 水平的升高可增强细胞膜上.?.活性,促进、的跨膜转运,进而 增加?岍的消耗,使基础代谢率增加【。 很多研究者研究了冷应激对家禽血清中、的变化规律。一般对急性 寒冷反应发生迅速,在 内即可出现血清水平增加,引起血中三碘甲腺。’ 原氨酸、甲状腺素水平升高】。 王金涛【】检测了雏鸡下丘脑 的表达水平,血清、的 游离形式及的游离形式的含量,结果表明,呈上升趋势,而 呈下降趋势,这表明冷暴露可以使下丘脑.垂体.甲状腺轴的激素分泌发生改变。 急性应激后期的表达增加,与的含量均显著升高,表明机体的 基础代谢率升高,增加组织的耗氧量和产热量以维持机体的体温。慢性应激时 含量升高,进一步发挥其保护作用,含量降低,可能是由于机体的需求量以及 脱碘转化为增加所致, 的表达水平基本无变化,且均低于对照组, 显示机体可能已经适应了寒冷的环境,使其表达维持在一个新的水平,对机体发 挥一定的调节作用。李士泽【 】实验认为,冷暴露后,水平降低到最低值,是 届扬州大学博士学位论文 脱碘转化变成的结果,因为血液中%的来自,的生物学作用比大 倍。王建鑫【试验结果表明,环境温度对金定鸭血清中含量的影响较显著,而 对浓度影响不显著。在应激后血清中也降到了最低,但在中间有上升的 过程,只是在应激开始后其含量一直在正常值以下;血清中的变化较为平稳, 说明的稳定性对于机体有较重要的意义,可以保证机体在较短时间内最大限度 的调整体内的营养物质代谢来适应环境的改变。对雏鸡冷应激的大量研究表明, 在冷应激开始后浓度上升而浓度下降,可能是由于在急性冷应激时机体甲状 腺激素的利用脱碘向转化,血液中%的来自,的减少还可能是粪便清除增加,以及禽类本身所具有的昼夜生理节律性变化所致。在应激后 血清中也降到了最低,但在中间有上升的过程,只是在应激开始后其含量一直 在正常值以下;在对肉鸡进行周和周的冷应激后,血液测定结果是明显升 高,而不受影响。血清中的变化较为平稳,的生物学作用比大倍,说 明的稳定性对于机体有较重要的意义,可以保证机体在较短时间内最大限度的 调整体内的营养物质代谢来适应环境的改变。许绍芳【】报道,将鹌鹑在.?~. ?冷暴露后,在前血中水平比冷暴露前提高了倍,然后逐渐下降并维持在最 初水平的倍。杨琳等利用京白育成鸡试验研究表明,环境温度对血浆中水平具 有极显著影响,血浆中的水平随着环境温度的降低而提高【】。 有关急性和慢性寒冷反应中分泌变化的研究虽然很多,但其结果随着条 件的不同如实验对象的性别、年龄等而不一致【。。 ..冷应激对动物能量代谢的影响 低温环境对动物能量代谢影响明显。动物在临界温度时,与环境之间处于热 平衡状态,代谢率最低。当环境温度低于临界温度下限时,机体静止能量代谢率 升高,产热量增加。环境温度对动物代谢、产热、能量、蛋白质和脂肪种类等有 很大影响。当动物进行急性冷暴露时,实际的日粮能量主要从生产功能而转向产 生大量的体热,以维持体温恒定。若热量产生不足,可引起生长发育的继发性改 变及某些疾病的产生,严重者将导致死亡。 屠云洁:冷应激对雏鹅轴和轴活性影响及其相关基因表达调控的研究 绵羊于?时的产热量是?时的.倍。妊娠和空怀母猪在舍温?时,环 境温度每降低?,代谢能需要增力:.兆焦/天;在~?时,需增加.;焦/ 天;在。。时需增加.爿焦/天。 动物体将饲料转化为畜产品的各个阶段,包括采食、 消化率、能量和蛋白质 贮留以及营养分配,都要受到寒冷的影响。研究表明,寒冷应激使鸡的基础代谢 率升高,能量代谢和采食增加,呼吸加深,耗氧量增加。一般认为,低温下鸡的 饲料消耗增大,但饲料利用率却降低。蛋鸡在低温环境中,虽然采食量增加了仍 不能维持产蛋需要,从而动用体内贮备,致使体重下降。在低温中,随着温度降 低,维持能量需要增加,食欲提高,消化机能降低,结果生产水平下降。 研究表明,细胞钠泵是动物冷适应非寒颤产热的重要机制。机体冷适应过程 中,细胞钠泵功能增强,因此机体产热增加。另外,腺苷酸环化酶在动物 冷适应的代谢调节中也越来越受到重视,动物在冷适应时,通过分解胞浆内的枷 ,使浓度增加,从而发挥代谢产热作用。动物冷暴露时机体产热作用的 主要机理是起的浓度升高以及..活性增强的共同调节【。黟 ..冷应激对免疫功能的影响 冷应激会影响动物的体液免疫和细胞免疫,当寒冷应激较弱时动物的体液免 疫加强。当寒冷应激较强时,动物的体液免疫明显下降,并能易化对其他应激原 的反应。冷应激时分泌型减低,表明应激影响了细胞和粘膜免疫【。通常,短 期应激一般不影响免疫反应,但鱼的短期拥挤会迅速抑制补体和白细胞吞噬功能 【】;中度精神应激会增强免疫反应。应激动物的年龄和性别对免疫指标也有影响。 大量研究表明,动物应激过程中的神经内分泌系统功能的变化对免疫机制有抑制 作用,表现为巨噬细胞吞噬功能抑制,脾脏细胞活性降低,抑细胞对 刺激的反应,抑制淋巴细胞产生抗体,一、.和.水平显著降低掣】。人 应激时细胞与/::率减低,其中,精神应激时淋巴细胞细胞和分 泌型均增加,冷应激时分泌型减低,表明应激影响了细胞和粘膜免疫【】。 应激蛋白也可通过改变细胞免疫系统和递呈抗原调节细胞免疫反应。动物应激 届扬州大学博士学位论文 后,由外周淋巴组织产生的应激免疫抑制蛋白也能抑制淋巴细胞转化, 抑制免疫功能【。细胞肉增多,可加强感染部位细菌诱导的对细菌的攻 击,有利于细菌感染的恢纠引。袁学军等试验表明,急性冷应激可使海兰 雏鸡细胞免疫水平下降,表现为血液嗜碱性细胞数目增加、异嗜性细胞/淋巴细 胞/明显增加【。小鸡在环境温度偏低时易导致白痢杆菌的发生寒冷常常 是许多疾病如禽流感、传染性支气管炎、传染性喉气管炎、大肠杆菌病、霉浆体 病等的诱因之一,使家禽死亡率大大提高,给养禽业造成极大危害。 ..冷应激的防制 对动物应激的防治主要是改善动物饲养环境,避免不良刺激,同时,加强饲 养管理和优良品种的选育,动物的驯化和适应在一定程度上可提高抗应激能力, 缓解应激对动物所带来的不良影响。对新生幼仔和雏鸡尤为重要。由于在冷环境 中饲料转化率减低,因此要保持基础代谢能应适当增加饲料标准。适宜的高脂饲 料摄入有利于增强抗寒能力和建立冷适应。同时,要在营养调控、增加光照、铺 设垫草和选择耐寒优良品种等方面采取综合,其中,维生素、微量元素、氨 基酸等营养物质和某些药物或添加剂在防制动物冷应激方面的研究和应用较多 许多营养素和药物及其添加剂具有缓解应激性伤害的作用。、、、 、胆碱、某些氨基酸及、、等矿物元素能提高畜禽对应激的抵抗力, 银杏叶、巴戟天、麻醉椒等中草药,某些饲料添加剂、复合剂等都有一定抗应激 能力。 研究表明,可提高寒冷条件下人红细胞膜..活性,降低膜 含量【;冷暴露的动物在饲料中添:后,其血浆中含量明显低于单纯冷 暴露组,由于能量代谢增强和生物膜得到保护,机体的抗寒能力增强。虽然动物 具有合成能力,但在冷应激条件下,自身合成能力减低,补充后抗寒能力增 强。冷暴露大鼠补充核黄素可使血浆中升高,而且增强对某些黄素 酶的诱导,并降低大鼠对冷应激的敏感性,增强机体的冷适应能力【。 屠云洁:冷应激对雏鹅轴和轴活性影响及其相关基因表达调控的研究 冷应激条件下,机体对、、、、、、、、等微量元素的需 求量增加。杨焕民等研究表明,在和缺乏时,合成不足,同时不能转化为 ,甲状腺代谢功能异常,幼龄动物的抗寒和生存能力降低【】。陈景元等‘删研究 表明,大鼠急性冷暴露后血清中含量明显降低,且体温调节能力下降,难以维 持体温的恒定,而高可稳定矿转运酶的构象,提高其活力,进而增强机体 在冷暴露时维持线粒体膜稳定性的能力,防止膜损伤,摄入高的小鼠在.?的 冷室内存活时间比正常摄入的延长,表明补可以提高机体耐寒力。一方面 参与血红蛋白的运氧功能,一方面维持机体组织中重要酶类,如线粒体细胞色素 氧化酶、铁硫蛋白等活性,充足元素的供应,可增强机体含酶的活性, 增加机体对冷应激的耐受力。缺会导致旷.酶活性降低,并使大鼠体温调节 能力减弱【引。 参、 色氨酸是.羟色胺.的前体物质。作为中枢神经递质,具有促进’ 生长激素释放激素和肾上腺皮质激素释放激素分泌的作用,进而影响到生长激素 和的分泌和释放,在调节应激反应中起重要作用【钓】。酪氨酸作为儿茶酚胺的~ 前体物质,必然影响到去甲肾上腺素、多巴胺和肾上腺素等神经递质的合成。冷 应激时,由于糖皮质激素增加,经糖皮质激素受体诱导肝脏酪氨酸转胺酶的大量 合成,从而消耗大量的酪氨酸。给冷暴露动物注射酪氨酸后,可使代谢率增加。 研究表明,仔鼠给予胆碱、酪氨酸和色氨酸后产热量有很大提高。 通过药物或添加剂提高机体的抗寒冷应激能力是目前抗冷应激研究的热点。 中药红景天、刺五加等可调节机体特异性和非特异性免疫功能,并调整细胞代谢、 增强机体代谢率,增加冷适应过程中红细胞膜活性和、的含量, 抑制红细胞膜含量的增加,从而增强抗寒能力和冷适应能力【】。吴永魁等对 由中药和维生素组成的抗寒添加剂进行了喂养试验,结果,中、高剂量组大鼠 体重增长较快,能量物质肌酐含量升高,表明机体代谢功能增强【】。王凯等给大 鼠服用复方中药制剂,发现抗冷应激能力增强。在实际应用中,单一的营养物 质或单一的药物对提高动物的抗寒能力往往达不到理想的效果‘。因此,复方添 加剂对提高抗冷应激能力更具应用前景。 届扬州大学博士学位论文 .动物冷应激反应中多种基因调控机制的研究进展 动物与环境的关系问题一直是动物学家关心的问题,动物只有与环境条件协 调配合才能够顺利生存下去。而动物的诱导表达适应机制提示人们,动物对环境 的适应是一个能动的过程。动物通过启动与抗冷性有关的基因表达,给出逆境保 护措施,从而协助动物度过难关或逆境。因此,如何迅速诱导动物冷适应机制的 高效运作,提高动物在不利环境下的存活率,将是现在乃至将来动物学家应倾力 研究的课题。 在正常的生活条件下,动物体内的许多基因包括诸多抗冷性基因及其多拷贝 个体都处于闲置和被埋没的状态。这些闲置基因是动物在非极端条件下不需要的, 是额外或多余的,符合生物生长冗余的定义【。通过研究动物低温抵抗力生长冗 余关系的分子机制来提高动物抗冷性,以便深入研究动物机器运转的客观规律, 揭示动物自身拥有的巨大生存潜力。现已经发现,抗冷能力与动物基因组中抗冻 蛋白基因的拷贝个数成正比。可以认为,诱导和开发动物的这种巨大潜力,必将 为人类正确认识和合理利用现有动物资源、增加农业秋冬季节畜牧产量等做出贡 献。 除加强代谢保持生物稳态平衡而需要稳态相关基因活动如膜蛋白外,耐 冻生物具有抗冷性基因 。南极鱼抗冻蛋白的发现为人们深入 动物抗冷性研究和培育耐冻动物物种启开新的曙光。通过在寒冷逆境下转录抗冻 蛋白等耐冻性相关蛋白基因形成,然后在各种转录翻译调节因子的调节下 表达形成蛋白质和酶,从而形成冰冻耐性或冰冻避性或毁损修复反应。其中,转 录后调节和上调节是动物常用的抗冷基因表达机制。 ..抗冻蛋白基因表达与冷应激 抗冻蛋白 ,是年在南极一种鱼的血液 中首次发现的,它在生物体受冻害胁迫时产生并能防止细胞免受冰冻伤害。热滞 效应和抑制冰晶的重结晶是的两个重要特性‘彤】。研究者们已经在多种耐冰 冻生物体中发现,包括鱼类、昆虫、细菌、真菌和植物‘。】。抗冻蛋白不仅 屠云洁:冷应激对雏鹅轴和轴活性影响及其相关基因表达调控的研究 有抗冻活性,还可能有抗冻和抗病双重功能。 现在对鱼类南极鱼抗冻蛋白的研究最为透彻。它们分别是抗冻糖蛋白 、型抗冻蛋白 、?型抗冻蛋 、?型抗冻蛋白 。 在鱼体内有两种不同的分布:一类称为肝型,由肝脏 分泌进入血液循环;另一类称为皮肤型,它广泛分布于与环境直 接接触的组织细胞内,甚至在脑中也有表达。与的主要差别为前 者具有信号肽编码序列而后者无,从而造成两种在比目鱼体内的定位完全不 同。含有惟一的一个内含子~,具有肝特异性的增强子活性, 能为肝中富含的转录激活因子所结合。利用内含子缺失分析实验发现, 序列对其表达非常重要。 海渡鸦 的基因在基因组中有个拷,对其中一个拷贝进行序砖 列分析表明,在的序列中含有个外显子和个内含予,而且在该基因两贝 的区域内没有第二个基因拷贝的存在。该基因转录起始点上游的 是一个含。 有个串联重复的顺式调控元件,翻译起始点位于第个处。 的编码基因在基因组中也为多拷贝基因,.纽芬兰大洋条鳕的基因组中 】。狼鱼?【,叫基因在其基因组中含 约含有拷贝的基因 有个拷贝,其中含有许多不规则相连的基因和较大的串联重复,每个串联 重复都包含两个方向相反、结构相似的基因,不同方向的基因均具有活性。 抗冻糖蛋白,糖蛋白也可以是抗冻蛋白。年在南极海 峡的一种鱼的血液中发现特殊抗冻物质。它有共同的三肽糖单位:【 】,根据重复数 的多少形成种分子量不等 的抗冻糖蛋白。它们的活性随其分子 量的增加及重复数的增多而提高。通过化学修饰乙酰化或过氧化糖基后会导致 其抗冻活性的丧失,因此认为糖基是决定其抗冻活性的主要基团。 届扬州大学博士学位论文 ..热休克蛋白基因表达与冷应激 家族主要分为、、、和小等个亚族。 在正常细胞中水平较低,且高度保守,在应激状态下显著升高,可作为应 激反应和评价组织细胞处于危险状态的分子生物标志,因此已成为中关注的 焦剧】。热、冷、运输、低氧、重金属、乙醇、氧自由基以及缺血再灌注、某些 细菌、寄生虫感染等应激因素均可诱导细胞的表达。孵化中的鸡卵受热、冷 应激也出现的高表达,而且,在不同日龄和组织中的表达量不刚彤。 应激可导致核蛋白变性疏水区暴露并相互作用而聚合,此时,从细胞 质迅速转移到细胞核,与变性蛋白疏水区结合,从而限制了其相互聚合,并可使 已聚合的蛋白解聚,恢复其正常结构,发挥细胞保护作用。表达被认为是生 物细胞逃避有害刺激的最原始机制之一。当然,如果综合应激强度过大,造成细 胞的膜结构损伤和蛋白质结构改变,不但使表达合成降低,而且会使在 细胞内的分布改变。合成水平通过反馈抑制 转录来进行调控, 其调控机制依赖于的累积惭。 人们对热应激与的关系研究较多,认为可作为热应激的生物标志 物【】。研究发现,仔猪冷应激同样导致肝脾、肌肉和血淋巴细胞内的高效 表达。小鼠经跑步训练可增加肝脏的含量,从而抵御热、冷、氧化等多种应 测】:饲喂蔗糖也能增加大鼠下丘脑中应激诱导的 的水平【】。如利 用生物方法或物理化学方法将基因导入动物细胞,或通过日粮和驯化,使组 织 中表达增加,可能减少应激所造成的损伤。冷可诱导小鼠在棕色脂肪组织中 合 ;该诱导伴随着增强的热休克转录因子结合到上,当以肾上 成 腺素受体拮抗剂处理时可以被阻断。研究发现,仔猪冷应激同样导致肝、脾、 肌肉和血淋巴细胞内的高效表达,认为可作为评价冷应激的分子标 志物【。冷应激时,机体为了适应环境的变化,各系统和各器官组织充分发挥 自 我调节作用,除某些血液生理生化和内分泌指标发生改变外,在各器官组织 中的表达水平也不同,而且,随冷暴露强度和冷应激时间的变化,的表达也 有不同表现,这反映了各器官组织在不同冷应激反应中的功能调节作用。 屠云洁:冷应激对雏鹅轴和轴活性影响及其相关基因表达调控的研究 ..即刻早期基因.表达与冷应激 在多种应激条件下,基因快速表达,并通过调控其它基因的转录及翻译 使外界短暂刺激转化为机体长期的反应。但不同应激刺激时,.基因在中枢神 经系统及不同组织器官中表达不完全相同,具有定区域性和时效性【。作为 第三信使与表达蛋白形成复合物,可提高启动子活性,从而调节肾上腺皮质 激素释放激素的转录。室旁核中的可能调节促皮质激素释放激素 的表达,进而控制促肾上腺皮质激素的分泌,启动轴【】。 .可能介导神经内分泌免疫活动,垂体是神经内分泌整合机制的中心。.可 能介导神经内分泌免疫活动,垂体是神经内分泌整合机制的中心,垂体中.基 因的表达可作为神经内分泌系统激活的标志。室旁核中的.,可能调节促皮 质激素释放激素的表达。近年来,.作为神经元的活动和示踪标志,被广泛应 筝 用于应激的神经通路研究中。中药、某些肽类可减少应激条件下.的表达, 可能在抗应激中发挥作用【。。进而控制促肾上腺皮质激素的分泌,启动轴。 ..诱导型一氧化氮合成酶基因表达与冷应激 一氧化氮是一种弥散型神经递质和信息分子,介导和调节许多器官系一 穗 统的生理、病理生理功能,它由一氧化氮合成酶催化.产生, 可分为结构型和诱导型,主要分布于神经原和 内皮细胞,主要受水平调控。具有稳定的活性,在正常情况下不表达, 当细胞受到刺激时,活性增强,大量释放。在体内具有双重作用,即 有作为生物信使和参与中枢神经内分泌及免疫调节的有利的一面,又是一种 活性 很强的气体分子自由基,具有细胞毒性,过量时会导致细胞功能紊乱,甚至死 亡。 作为鸟苷酸环化酶内源性活化因子促进合成,通过磷酸二酯酶等 效应靶分子调节各种生理活动,因此,.形成信号转导通路发挥作用。不 同组织及中枢神经系统不同神经核团的神经元活性差别很大。在许多应激状 态下,如强迫游泳、热、冷、高原、束缚等活性主要是处于高水 平,生成量增多。因为过量能通过细胞毒性作用和使神经细胞内超载,届扬州大学博士学位论文 导致神经元形态和功能受损,进而反馈抑制的活性,而生成又受其前体 .影响,所以在不同应激原不同应激强度和应激的不同时期,活性和 生成量不同,而且,二者并不一定总是正相关。大鼠应激状态下饲喂蔗糖诱导下 丘脑的表达,就是通过增加的产生而介导的【】。对所诱导 的细胞溶解有保护作用可看作是抗的防御分子【。和可在中枢神经 系统多个神经核团细胞内共表达,不同的应激原对和在细胞内共表达特 征尚需进一步研究。供体药物对应激性胃粘膜损伤具有一定保护作用,因此, 在动物其它应激损伤的防治中也可能发挥作用。 .热休克蛋白调控机制的研究进展 热休克蛋白 ,是一类在生物进化中高度保守的多 肽,广泛存在于原核及真核生物细胞中。早在年,发现果蝇暴露于高 温后其唾液腺染色体发生蓬松现象,他把这种现象称为“热休克反应”【‘】。后来, 等【】发现,除热以外,多种刺激因素均可诱导的表达升高,如冷、低 氧、紫外线、重金属、组织损伤、肿瘤、营养缺乏、氧化剂、自由基、某些病毒、 细菌、寄生虫感染等,因此,又称为应激蛋白 ,】。根 据的相对分子质量,主要的被分成个家族:大分子量家族、 家族、家族、 家族、小分子量家族和泛烈。其中 在应激反应中最 是中最保守、最重要的一族,在大多数生物中含量最多, 敏感,因而是中最受关注、研究最深入的一种峭。。 .. 的组成和分子生物学特性 家族成员包括分子量为、、、、等多种应激蛋白。 它们具有相同的等电点和相似的生化特性。在不同生物中名称不同,即使在 同种 生物中,也因其在细胞内分布不同、表达情况有差异而名称各异【。 和诱导型 家族主要包括两种蛋白结构型 。这两种蛋白 的氨基酸序列%是相同的,它们的生化特性除了电泳泳动度稍有差异外,其余 屠云洁:冷应激对雏鹅轴和轴活性影响及其相关基因表达调控的研究 大部分特性都相同【】。有的属严格的诱导型,如细胞中的. 只在热休克时表达,而没有构成型表达,有的在非应激时为构成型表达, 而在应激时则诱导表达【】,如在细胞内约占总蛋白的%/。年, 等【】报道了在病理状态下循环中水平的升高,首次证实了胞外 的存在。 家族在进化上高度保守。真核细胞基因组包括至少个基因, 一些位于号染色体上的编码内,紧邻。基因,另一些位于和 号染色体上【。基因没有内含子,转录一旦启动就可产生成熟的, 使快速表达。 由于家族结构上的相似性,使其具有一些共同的生物学性质高度保守 性。真核生物间基因序列有~%的同源性,大肠杆菌之间有%的 同源性,但不同族之间则无明显序列同源非特异性。多种应激源均可诱导?’ 的产生。 根据 氨基酸的一级结构,可将分为个功能区:酶活性? 区由近端大小为的氨基酸序列组成,此区在结构上高度保守多肽结合区, 由酶活性区后大小为 相对保守的氨基酸序列组成;功能不明区,包括, 近端大小为 的结构多变氨基酸序列【卿。 .. 的基因调控 细胞受应激原刺激时,基因的转录迅速增加,在细胞内大量表达, 同时,细胞内其他基因的转录降低,且大部分蛋白质表达停止。转录水平 调节主要由热应激转录因子 ,调节,它能识别 热应激元件的靶序列,并与之结合,促进基因转录【】;而翻译水平调 节主要取决于 的稳定性和翻译效率。 ...转录水平的调控 是一种具有转录调节活性的蛋白质,其结构和功能在进化中较少变异, 具有广泛同源性,在脊椎动物中发现种,分别为、、、。子识别的目标序列是框 和同序列相联系的因子,包括 的其它热应激基因启动序列,这些因子的结合对转录前激活至关重要。当 因子自我附着于框时,核小体经过变构而使启动子打开准备转录图 。 屠云洁:冷应激对雏鹅轴和轴活性影响及其相关基因表达调控的研究 壬 ’口..豳图. 基因的激活与转录示意图? ...翻译水平的调控 基因不含内含子,转录的在加工之前不需要清除内含子,而使基 因得以快速转录,也得以及时,从而保证了机体对的需要及 对应激的快速反应。细胞在应激状态下,合成增加,而其它大部分蛋白合 成受到抑制,这不是其他基因受到抑制,而在于被优先翻译。对果蝇 的结构进行进一步研究发现,其’末端有一长的未翻译区域, 细胞内的翻译起始因子能够识别该结构,并发出起始翻译信号,同时,增强 的稳定性,使核糖体结合 并促进其翻译。另外,应激条件 下,多数蛋白的翻译被抑制,也能减小与的翻译竞争。非应激条件下, 帽位点依赖性翻译系统起作用,使有本底水平的表达。常温条件下, 稳定性 不稳定,其半衰期只有 ~,而在应激条件下, 增强,半衰期可达【】。 在正常温度下的稳定性是由降解 系统所控制。序列分析发现 端非翻译区、含量丰富,’端非翻 译区的删除可以增加 在正常温度下的稳定性。应激可增强降解系统 的活性,从而提高了 的稳定性。 届扬州大学博士学位论文 .. 的生物学功能 ...分子伴侣作用 当蛋白质处于非正确的天然构象的时候,那些存在于球状蛋白质内部的非疏 水性氨基酸将会暴露出来,将与一些肽、核酸分子和一些大分子发生不良的 相互 作用。分子伴侣 是一类介导新合成或解折叠蛋白质正确折 叠和组装的蛋白质,其本身不参与折叠的形成,而是通过减少不正确折叠来 加速 蛋白翻译过程。作为主要的分子伴侣之一,当新生的多肽出现在核糖体中 时,他们就结合到新生的多肽上,保护疏水的氨基酸残基不进行一些无效的 相互 作用‘母。同时,促进某些变性蛋白质的降解和清除:的分子伴侣作用 主要取决于其酶结构域或与肽链结合过程中起重要作用的末端的序 列高度保守序列。与多肽的结合和解离取决与或 结合的转换作用,当与结合时,它可以与肽或变性的蛋白紧密结合; 当与结合时,肽链就被释放,随着的水解,相对稳定的. 复合物也随即形成。 ...协同免疫作用 在病原体被识别、加工和递呈过程中表达水平较高,并可被主要组织 相容性复合体或类相关分子递呈,所以是免疫系统识别的主要抗原, 在抗原加工、处理和递呈以及效应细胞的激活过程中发挥重要作用。此外, 当 外界环境因素引起机体细胞免疫应答时,伴随着各种细胞因子如白介素.、.、 肿瘤坏死因子.的产生,也大量产生,以对抗细胞因子对细胞的损害 作用。可通过诱导免疫细胞产生细胞因子参与免疫应答,与人单核 细胞表面结合后,刺激单核细胞产生.【、.和.等因子【。免疫应答过 程关键是抗原加工递呈,既参与.类途径又参与.类途径,分 别将抗原信息递呈给细胞和细胞。而且,还可作为抗原递呈分子 直接将抗原肽递呈给,细胞。 屠云洁:冷应激对雏鹅轴和轴活性影响及其相关基因表达调控的研究 .. 的应用和展望 作为一组高度保守的蛋白质,有其独特的生物学特性,在细胞内广泛地 参与多种复杂的功能活动,人们将的生物活性形象地比喻为“瑞士军刀”【别。 随着对研究的不断深入,的应用价值正在不断的被发掘。形成了医学和 分子生物学研究领域的许多研究热点。与肿瘤的研究报道很多,被 认为是癌细胞表面的特异性结构【鲫,它通过多种机制表现出抗肿瘤活性。 类分 作为分子伴侣与肿瘤细胞的内源性多肽结合提呈给杀伤细胞,并参与 子介导的抗原加工】。同时,诱导某些细胞产生的细胞因子师.【、.、 。 .、.、等也达到抑制肿瘤生长及杀伤肿瘤细胞的目的【 是重要的分子生物标记物。研究发现,仔猪及其随冷