临床医学论文-聚酮合成酶底物专一性的研究进展

临床医学论文-聚酮合成酶底物专一性的研究进展 【摘要】 聚酮合成酶能够合成包括许多大环内酯类抗生素在内的聚酮类天然产 物,它的结构和功能的模块性为组合生物合成的产生和发展奠定了基础。聚酮合 成酶的酰基转移酶功能域可以特异性地决定所选择酰基辅酶A的种类,决定产物 的结构。近年来,针对许多来源不同、结构各异的聚酮合成酶的底物专一性已经 从氨基酸序列、结构和功能等方面进行了大量的研究,为更有效地应用聚酮合成 酶开发新型抗生素奠定了基础。 【关键词】 聚酮合成酶; 底物专一性; 组合生物合成; 酰基转移酶 Progress in substrate specificity of polyketide synthase ABSTRACT Polyketide synthases catalyze the synthesis of complex natural products including macrolide antibiotics from simple precursors such as propionylCoA and methylmalonylCoA. The structural and functional modularity of these multienzyme systems has raised the possibility that polyketide biosynthetic pathways might be rationally reprogrammed by combinatorial manipulation. Previous studies have shown that the choice of these substrates is primarily controlled by individual acyltransferase (AT) domains within each PKS and the intracellular acylCoA pools. An essential prerequisite for harnessing this biosynthetic potential is a better understanding of the molecular recognition features of polyketide synthases. Within this decade, a variety of genetic, biochemical, and chemical investigations have yielded insights into the specificity of several architecturally different polyketide synthases. The results of these studies, together with their implications for biosynthetic engineering, are summarized in this review. KEY WORDS Polyketide synthase; Substrate specificity; Combinatorial biosynthesis; Acyltransferase 聚酮类化合物是一类由聚酮合成酶(polyketide synthase,PKS)催化合成的 结构复杂、用途广泛的天然产物。聚酮合成酶通过催化前体物质进行反复的缩合 反应,可以形成多种聚酮体,再经过甲基化、氧化还原、糖基化等修饰反应形成 各种各样结构复杂的聚酮类化合物。目前,在微生物中发现的聚酮合成酶主要有 两大类:I型聚酮合成酶是以模块形式存在的多功能酶,每一模块含有一套独特 的、非重复使用的催化功能域,主要催化合成大环内酯、聚烯及聚醚类化合物, 如红霉素糖苷6B(6deoxyerythronolide B,6dEB)的生 物合成,1,;II型聚酮合成酶为多酶复合体,含有一组可重复使用的单元,主 要催化芳香族聚酮类化合物的生物合成,如放线菌紫素等,2,。I型聚酮合成 酶和II型聚酮合成酶都包括一个或多个模块,每个模块含有三个关键催化功能 (ketosynthase,KS)可催化链的延伸; 酰基 载体蛋白(acyl carrier protein,ACP)为催化过程中的中间体提供一个带有巯 基的传输臂;酰基转移酶(acyl transferase,AT)可以结合酰基辅酶A的酰基部 分并将其传递给酰基载体蛋白。另外,I型聚酮合成酶的有些模块中还存在以下 (ketoreductase,KR)能够立体特异地将β 酮基还原成羟基;脱水酶(dehydratase,DH) 脂酰载体蛋白;烯还原酶(enoyl reductase,ER) 酰基载体蛋白,3,。 自然界中也存在一些结构特殊的聚酮合成酶。Sthapit等2004年从Streptomyces carzinostaticus中首次发现能催化合成芳香化合物的细菌I型聚酮合成酶,4,。Cheng等从Streptomyces atroolivaceus S140克隆得到leinamycin(LNM)生物合成基因簇,包括两个PKS基因lnmI和lnmJ,共编码6个聚酮合成酶模块,每个模块内都没有AT催化位点,而由聚酮合成酶基因簇之外的lnmG基因编码酰基转移酶。lnmG、lnmI或lnmJ的失活都将终止LNM的生物合成。体外实验结果进一步证明,lnmG编码的酰基转移酶能够有效、特异地向PKS的6个模块提供丙二酰辅酶A,5,。 1 PKS起始碳单元的选择 聚酮合成酶能够催化多种小分子羧酸进行缩合反应,经过不同程度的还原合成大量结构复杂、生物活性多样的天然产物。PKS模块中AT功能域可以选择特定的酰基辅酶A,通过ACP传递到KS的活性位点上并完成缩合反应,即AT对于反应底物的选择具有关键的作用。 PKS的负载域根据其模块结构(即聚酮合成的起始方式)主要可以分为两类:一类负载域除了AT和ACP之外,还有一个具有脱羧酶活性的KSQ(KS高度保守的半胱氨酸残基活性位点被谷氨酸即Q取代)功能域。这种负载域(如竹桃霉素、尼达霉素、苦霉素生物合成PKS中的负载域)以二元羧酸辅酶A(如丙二酰辅酶A、 甲基丙二酰辅酶A)为起始碳单位。起始碳单位在加载到第一个延伸模块之前必须经过脱羧反应,KSQ在这个过程中起关键作用,6,。另一类负载域出现于如红霉素、苦霉素的PKS中,只有AT和ACP。它们利用一元羧酸辅酶A(如丙酰辅酶A、异丁酰辅酶A)作为底物,将这些酰基辅酶A加载到相应PKS的第一个延伸模块上。在这个体系中,聚酮合成的起始过程没有经过脱羧反应。这类负载域对于聚酮化合物的合成不是必不可少的,例如灭活6B合成酶的负载域,极大程度地降低了红霉素的产量,但并不能完全终止红霉素的合成,7,。 除此之外,自然界中还发现了一些特殊的PKS负载域。FK506的生物合成PKS的负载域包括了CAS(dihydrocyclohexenylcarbonyl CoA synthetase)、ER和ACP功能域,但没有起始AT。CAS和ER催化莽草酸形成FK506生物合成的起始单位dihydrocyclohexenylcarbonyl CoA,ACP用于固定起始单位并将其传递给PKS模块1的3(ACP)合成酶功能域的半胱氨酸活性位点,8,。另外,Julien等发现epothilones(埃博霉素)生物合成PKS负载域是由KSY(KS高度保守的半胱氨酸残基活性位点被酪氨酸即Y取代)、AT、ER和ACP组成,9,。Brautaset等克隆的制霉菌素(nystatin)生物合成PKS的负载域NysA,包括KSS(KS高度保守的半胱氨酸残基活性位点被丝氨酸即S取代)、AT、DH和ACP,10,。但KSY和KSS的功能尚不清楚。 2 PKS延伸碳单元的选择 丙二酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A常用于聚酮链的延长,如红霉素的6个延伸模块都选择甲基丙二酰辅酶A作为催化底物。利福霉素B产生菌 Amycolatopsis mediterranei中的PKS既能利用甲基丙二酰辅酶A又能利用丙二酰辅酶A,其中模块2和模块9特异选择丙二酰辅酶A,其余八个模块特异选择甲基丙二酰辅酶A作为底物,11,。Reeves等在吸水链霉菌中发现子囊霉素(ascomycin)生物合成PKS的AT8能够利用甲氧基丙二酰辅酶A,12,。Reeves等还在子囊霉素PKS中发现了合成延伸单位乙基丙二酰辅酶A的基因,乙基丙二酰辅酶A为子囊霉素的C21提供了乙基侧链,13,。 通常情况下,聚酮链延伸模块AT功能域具有严格的底物专一性,也有一些AT功能域可以同时利用不同的底物。2000年,Julien从纤维堆囊菌中克隆了epothilones的生物合成基因簇,其模块4可以利用甲基丙二酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成两种产物epothilones A和epothilones B,9,。其它PKS也出现过这种不严谨的AT底物专一性,例如immunomycin,14,和monensin(莫能星),15,的生物合成酶,既能够利用甲基丙二酰辅酶A又能够利用乙基丙二酰辅酶A。 3 生物信息学方法分析PKS的模块结构和底物专一性,16, Yadav等以大肠埃希菌的丙二酰辅酶A载体蛋白转酰酶(malonylCoA:acyl carrier protein transacylase,MAT),17,、天蓝色链霉菌A3(2)的MAT,18,等酰基转移酶的晶体结构以及大量聚酮合成酶的基因、生化、化学实验数据为基础,开发了一种用于评估PKS模块结构和底物专一性的软件,所得到的分析结果储存在数据库PKSDB(polyketide synthase database)中。该软件在一定程度上揭示了聚酮合成酶氨基酸序列和聚酮产物之间的关系,并可以 辅助预测新发现PKS的聚酮产物。 该软件提出了特异识别丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A的酰基转移酶的特征:如基序QQGHS,QMI,GRSHT,NS,V出现于特异识别甲基丙二酰辅A的AT中, 而QQGHS,LVIFAM,GR,FP,H,ANTGEDS,,NHQ,V是特异识别丙二酰辅酶A的AT的特征基序。由于目前发现的特异识别较稀少酰基辅酶A(如乙基丙二酰辅酶A)的AT功能域的例子极少,因此该软件还不能够找到特异识别稀少酰基辅酶A的AT的识别模式。不过,该软件提出了一个区分特异识别一元羧酸辅酶A、二元羧酸辅酶A的AT的特征——117位氨基酸。特异识别二元羧酸(如丙二酰、甲基丙二酰)的AT在117位上是一个保守的Arg;当Arg117变成非极性的氨基酸时,AT功能域可以特异地识别一元羧酸底物如丙酸、苯甲酸、2 3 4 通过功能域置换的方法改变PKS酰基转移酶AT的底物专一性 自发现PKS这种特殊结构的蛋白以来,引起了人们极大的关注,日益完善的基因工程技术为利用聚酮合成酶合成复杂结构的非天然的聚酮化合物提供了充分的条件。以红霉素合成基因为例,红色糖多孢菌的6B合成酶(6deoxyerythronolide B synthase,DEBS)包括6个模块,催化了由一个丙酰辅酶A起始单位和六个甲基丙二酰辅酶A延伸单位聚合形成6的反应。1996年,Oliynykl等通过将DEBS1TE(thioesterase,硫酯酶,位于PKS末端且起到将合成的聚酮长链从PKS上解离下来的作用)的AT置换成雷帕霉素(rapamycin)聚酮合成酶基因模块2的AT,合成了两个新的三酮内酯,这两 个新产物在C4上都没有甲基基团,证明可以通过功能域置换的方法产生有活性的“杂合”聚酮合成酶,19,。Liu等通过用特异识别丙二酰辅酶A的酰基转移酶置换6DEBS的酰基转移酶,产生了6DEB的类似物,20,。此后,通过用特异识别丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A和甲氧基丙二酰辅酶A的AT取代6DEBS中特异识别甲基丙二酰辅酶A的AT得到了许多红霉素的类似物,20,24,。 多数情况下,通过功能域置换所得到的“杂合”聚酮合成酶催化非天然聚酮合成的产率远远低于野生型PKS。可能的原因有:?细胞内处于稳态的杂合PKS浓度很低;?杂合的蛋白不能有效折叠或蛋白水解敏感性较高;?在催化过程中外源的功能域无法识别其它功能域;?杂合模块的其它催化位点或下游模块对延伸单位的限制。为了解AT功能域的置换对PKS模块结构和活性的影响,Hans等对DEBS的模块6的一系列“杂合”模块(原来的AT被来自DEBS其它模块的AT取代)的生化性质进行了深入研究。实验结果显示更换AT功能域减弱了模块催化链延伸的能力,原因在于外源AT改变了ACP和KS之间的功能域的相互作用。进一步的实验表明,引入的这个外源的AT功能域使得KR和ACP功能域之间的一个位点(距引入的AT功能域C端几百个氨基酸处)对胰蛋白酶更敏感。这个发现对模块的重组具有指导意义,25,。 5 定点突变的方法改变酰基转移酶的底物专一性 通过功能域置换改变聚酮合成酶的底物专一性,有时并不能得到理想的结果。例如,DEBS模块4的几次AT置换,在标准条件下都未能够检测到聚酮产物,显 示置换模块4的AT,对DEBS的蛋白结构影响很大,使DEBS丧失了催化聚酮合成的能力,13,。Christopher等通过比对不同聚酮合成酶模块的AT功能域的序列,并对照大肠埃希菌脂肪酸合成酶的酰基转移酶晶体结构,希望找到AT4中可以改变其底物专一性且最小程度地影响DEBS蛋白折叠的基序。结果发现有三个独立的基序与AT4特异选择甲基丙二酰辅酶A有关。通过定点突变的方法将其变成了特异选择丙二酰辅酶A的基序。每个基序单独突变以及三个位点全部突变都能够得到有功能的DEBS,这些DEBS除能够合成天然聚酮化合物6霉内酯B外,还能产生预期的新的类似物66B,13,。后者的合成说明这些突变的基序的确改变了AT的专一性。这个实验的成功为改变聚酮合成酶PKS的酰基转移酶的底物专一性提供了一个可行的方法。 Kumar等,26,首先用点突变的方法灭活DEBS模块6的AT,得到的DEBS与来自leinamycin合成酶的MAT,5,共表达,从而得到了6B的类似物26脱氧红霉内酯B。在这个工作中,“杂合”聚酮合成酶与野生型聚酮合成酶在体内、体外催化聚酮合成的速率基本相同。 6 改变酰基辅酶A成分,合成特定聚酮化合物 PKS能够利用的起始/延伸单位包括乙酰辅酶A、丙酰辅酶A、异丁酰辅酶A、异戊酰辅酶A、丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A、丙基丙二酰辅酶A、羟基丙二酰辅酶A、甲氧基丙二酰辅酶A,27,。在微生物体内,聚酮途径所需要的酰基辅酶A通常存在一个以上的合成途径,28,。对于那些稀有的酰基辅酶A(如羟基丙二酰辅酶A或35A),其生 物合成基因往往位于利用该底物的PKS基因簇内,28,。例如Wu等在FK520生物合成基因簇中发现了稀有聚酮合成单位乙基丙二酰辅酶A和甲氧基丙二酰辅酶A的合成基因,29,。Liu等在肉桂地链霉菌中发现了丁酰辅酶A的合成途径,30,。 特定模块的酰基转移酶功能域通常倾向于利用某种特异的酰基辅酶A。但当细胞内缺少这种酰基辅酶A时,它也能够利用其它酰基辅酶A合成相应的聚酮化合物的衍生物。Fu等发现在缺少丙二酰起始单位时,土霉素生物合成PKS能够利用乙酸起始聚酮链的形成,31,。Richardson等在研究6 酶(6methylsalicylic acid synthase,MSAS)的底物专一性时发现,在缺少丙二酰辅酶A的情况下,MSAS甚至能够利用malonylSNAC(malonylSacetylcysteamine)作为延伸单位,32,。 因此,可以通过基因工程手段改变细胞内辅酶A组成,从而改变酰基转移酶功能域的底物专一性,也可以达到合成特定聚酮产物的目的。在大肠埃希菌中引入甲基丙二酰辅酶AA差向异构酶代谢途径,产生了大肠埃希菌中缺乏的(2S)A,该酰基辅酶A能够被在大肠埃希菌中异源表达的6DEBS利用,产生聚酮化合物6B(6dEB),33,。Kato等将Actinosynnema pretiosum中的安丝菌素(ansamitocin)生物合成基因 5个基因asm13,17与红色糖多孢菌的6DEBS基因在变铅青链霉菌中共表达(该6DEBS的甲基丙二酰特异的AT6已经被吸水链霉菌的FK520合成基因簇的甲氧基 丙二酰特异的AT8所代替),重组菌株产生了预期的产物22 B(没有asm13,17时,产物为6B和2 6 脱氧红霉内酯B),34,。以上研究表明,通过改造微生物酰基辅酶A的组成,能够成功地合成新的聚酮化合物,使通过构建基因工程菌株生产有重要药用价值的聚酮化合物成为可能。目前,大肠埃希菌和天蓝色链霉菌已经被成功地改造成为聚酮化合物合成的工程菌,33,。 7 展望 近二十年来,从天然产物中筛选新的抗生素变得越来越困难。另外,由于人们对抗生素的过度使用,使抗生素的耐药性问题日渐严重。寻找新抗生素的需求比以往更加紧迫,但用传统方法筛选有价值的前体化合物工作十分繁重,效率较低。因此,利用新技术开发新抗生素逐渐成为人们关注的热点。 聚酮化合物是一类结构多样的天然产物,很多具有重要的药用价值,如大环内酯类、四环素类、蒽环类、聚醚类的许多抗生素都属于该类化合物。目前已知的天然存在的聚酮化合物有7000多种,其中1%具有药物活性。更重要的是,聚酮合成酶由于其功能和结构的模块性使得组合生物合成成为可能。 自从1985年,Hopwood等,35,首次报道应用遗传工程的手段合成“非天然”的产物isochromanequinone以来,组合生物学得到了蓬勃发展,目前通过组合生物学的方法已经合成了大量聚酮类化合物。改变生物合成途径具有以下的 优势:酶有足够的精确性修饰特定的位点,而不会导致副产物的产生;可以改变 那些化学方法所不能改变的原子、基团。 当然,聚酮合成酶是结构复杂的生物大分子物质,其蛋白间、蛋白内的相互 作用机制十分复杂,蛋白质结构的微小改变,都可能对其催化活性产生极大影响。 只有充分了解聚酮合成酶结构、功能、反应机理,才能有效地进行改造并用来合 成新的有价值的化合物。通过对聚酮合成酶具体功能域的研究,尤其是对AT功 能域的研究,可以充分了解AT功能域中具体的氨基酸组成与聚酮产物的关系。 PKSDB软件可以用于预测“杂合”聚酮合成酶的产物,有利于设计、开发新型聚 酮类抗生素。AT功能域作为聚酮合成中控制起始单位和延伸单位选择的关键因 素,其结构与功能关系的研究十分重要,对于应用组合生物学合成新的非天然“天 然”聚酮化合物的开发研究也具有重要的指导作用。 【参考文献】 ,1, Haydock S F, Dowson J A, Dhillon N. 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