功能矫治器引导大鼠下颌前伸咀嚼肌中MMPs表达

功能矫治器引导大鼠下颌前伸咀嚼肌中MMPs达 功能矫治器引导大鼠下颌前伸咀嚼肌中 MMPs表达 ? 618?现代El腔医学杂志2006年第20卷第6期JModernSomatol,November2006,Vol20,No.6 功能矫治器引导大鼠下颌前伸咀嚼肌中MMPs表达 孙慧玲周洪邹敏 【摘要】目的研究功能性矫治器引导大鼠下颌前伸后咀嚼肌中MMPs表达,探讨功能性颌骨矫形过程中咀 嚼肌适应性变化的分子机制,为矫形治疗提供理论依据.方法采用RT—PCR,免疫组化染色法观察大鼠二腹肌 前腹中MMP一2,MMP一9表达.结果?大鼠二腹肌前腹实验组和对照组中MMP一2mRNA,MMP一9mRNA 均表达.?MMP一2蛋白表达水平在14d(P<0.01)和21d(P<0.05)组有差异;MMP一9蛋白表达水平在7d(P <0.05),14d(P<0.05)和21d(P<0.01)组均有差异,实验组均表达增强.结论?MMP一2,MMP一9参与了 咀嚼肌正常的生长发育过程.?功能性矫治器引导大鼠下颌前伸后咀嚼肌中MMP一2,MMP一9参与了咀嚼肌的 适应性变化. 【关键词】咀嚼肌基质金属蛋白酶下颌前伸 Expressionofmatrixmetalloproteinasesingrowingratsmasticatorymuscleafterfunetional mandibularprotrusion SUNHuiling,ZHOUHong,ZOUMin.StomatologyHospitalofXi'anJiaotongUniversity.X i'an710004 【Abstract】ObjectiveToinvestigatemolecularchangesingrowingratsmazticatorymuscleafterfunctio nal man~bularprotrusion.MethodsSDratsarerandomlydividedintoeightgroupsascontronl3d,7d,14d,21dand experimental3d,7d,14d,21d.TheRT— PCRandimmunohistochemistrymethodsareusedtOfindexpressionandany differencesofMMPSingrowingratsmastieatorymuscleafterfunctionalmandibularprotrus ion.Results?Expressionof MMP一2mRNA,MMP一9mRNAinallgrowingratsmasticatorymusc|e.? Differenee~BexpressionofMMP一2protein in14d,21d;MMP一 9proteinin7d,14d,21dbetweencontrolandexperimentalgroupsafterfunctionalmandibular protrusionrespectively.Conclusion?MMP一2andMMP一 9participateinmasticatorymusclenormaldevelopment.? MMPSproteininvolvechangesingrowingratsmasticatorymuscleafterfunctionalmandibularprotrusion. 【Keywords】MasticatorymuscleMatrixmetalloproteinasesMandibularprotrusion 中图分类号:R783.5文献标识码:A 在功能性矫治器引导下颌前伸的过程中,除了 骨组织在肌张力的作用下发生改建和生长外,咀嚼 肌也会发生相应的变化和改建,这样才能使刺激下 颌骨生长的结果得以保持和稳定.近些年来,细胞 外基质(extracellularmatrix,称ECM)的活动愈来愈 受到人们的重视.结缔组织形成时,ECM的循环即 其分泌,合成与分解形成动态平衡.咀嚼肌结构和 功能的改变有发育性的,如面部形态异常;也存在适 应性的,如功能性矫治器的矫正治疗.肌肉细胞外 基质的变化在这些过程中起着重要作用.基质金属 蛋白酶(matrixmetalloproteinase,简称MMPs)在这 个变化中发挥了一定的作用. 资料和方法 1.实验动物及分组:选用健康的雄性SD大鼠 80只,4周龄.质量(70?5)g,自由饮水,定时摄食. 作者单位:710004西安交通大学口腔医院(周洪为通讯作者) 随机分为8组:不戴矫治器对照3d,7d,14d和21d组; 戴矫治器3d,7d,14d和21d组,每组10只. 2,主要试剂:RNA提取试剂(TrizO1);反转录试 剂盒:(RevertAidFirstStrandeDNASynthesisKit): MBIFermentas公司;PCRMasterMix:(北京天为时 代科技有限公司);兔抗人//J,鼠/大鼠MMP一2;兔 抗人/4,鼠/大鼠MMP一9;即用型SABC试剂合; DAB显色试剂合;以上试剂购自博士德生物有 限公司. 3.矫治器的:参照Petrovic[8]使用的矫治 器并加以改良.矫治器由塑料底板,斜面导板和口 外固位臂三部分组成.斜面导板为6ram×8ram带 环片,斜面导板与上颌咬合平面成20,25度.矫治 器戴于大鼠上切牙,为防止矫治器脱落,用橡皮圈固 位于大鼠鼻上颌复合体.当大鼠闭口进行功能运动 时,下切牙咬在斜面导板上,下颌被引导前伸. 4.标本制备:分别于戴矫治器3d,7d,14d,21d断 颈处死.取实验组和对照组大鼠左侧二腹肌前腹迅 或化口腔学杂志2006年第20卷第6期 JM~demSomatolNov~mher2006,V.I20No6'619 速置于液氮罐中取实验组和对照组太鼠右侧二腹 肌前腹浸于现配的4一多聚甲醛液固定12小时,常 ,石蜡包埋.每块组织作连续切片5 规脱水.透明 张.1张作HE染色,其他4张分别作MMr2, MMP一9的免疫组化SABC法染色 5二步法RT—PCR:提取总RNA,逆转录合成 cDNA第一链,丹别按说明进行.引物设计合成: MMP2上游引物5'CTATFCTG1'CAGCAC TTTGG,3';F游引物:5'CAGAC下T'IGGTT CTCCAAc不,3',产物长度310bp.MMP一9上 游I物:5'1(GCTTCC1,CCGlGATT,3';下游 引物:5'TGIA_JG【,TcGTGTCA7'A,3',产 物长度293bp.口…tin上游引物:5.FCCTTc CTGGGTAFGGAAFC.3',下游引物:5'ACT CA1CG]'ACTCCTGC,ITG,3',产物长度300bp PCRDNA扩增按说明书进行MMI2扩增,反 应条件为:95预变睫5min,95尘性30s,55退火30s, 72延伸2rain,共35个循环.最后72.再延伸7rain. MMP一9扩增反应条什为:MMP9的退火温度 为?.其余条件同MMP2. 6免疫蛆化SABC法染色:按试剂盒说明进行 反应DAB显色渡显包.常规脱水透明封片.光 镜下阳性部位为棕黄色反应沉视物. 7图像:利用【甜像信号采集与分析系统对 大鼠二腹肌巾MMP2,MM[L9阳部位的透光 强度进行恢度值的测定.每张组织片随机选3个视 野进行测量.结果取其平均直. 8统计学处理:采用SPSS1【0统计软件对灰 度值进行方差分析及检验. 结果 1MMP2,MMP9mRNA的表达:RT PCR产物经凝腔电泳鉴定.MMP2条带大小约 31Obo.MMI9条带太小约293bp均与预期大小相 符.MMP一2,MMP一9mRNA在各实验组和对照 组均表达(图1,2) 2S,M3C法染色结果:圈3,图4分别为MMP 2在2ld的对照组与实验组免疫组化染色结果. 图5,图6分别为MMI9在21d的对照组与实验 组免疫组化染色结果.图中显示二腹肌肌纤维呈棕 黄色阳性反应.对其灰度值进行图像分析.显示对照 组与实验组染色有差异,实验组染色较强.统计结 米(表1,2) 实验组与对照组之间用独立样本成组t检验 MMp2蛋白表达水平在I4d(P<001)和2id(P <005)组有差异.实验组表达增强MMP9蛋 白表达水平在7d(P<005),14d(P<005)和21d (P<001)组均有差异.实验组表达增强备实验 纽与实验组.对照组与对照组用单因素耐两比较方 差分析,均无差异. 目1MMP9kT—PCR脏.U诛cI.23,4,5.6.78.4}~rl21d?l2IdC.7dC7ar14dC.14dT3dC3dTr.c 2:?."鉴譬艘x40MMP2_-.为-r--dcr一"?"?dC?dT" 421I10SABC4llMM1J252J0SAIK"×40MhZP一口目6218AI3C加MMP9 ? 620?现代口腔医学杂志2006年第20卷第6期JModernSomatol,November2006,Vol20,No.6 表1MMP一2表达图象分析结果(?s.I1=10) 表2MMP一9表达图象分析结果(?S.I1=10) 讨论 本研究RT—PCR产物凝胶电泳结果显示正常 生长期大鼠二腹肌前腹MMP一2和MMP一9的 mRNA均表达,这与文献【1--3]所报道的各种骨骼肌 适应性变化中MMP一2和MMP一9的结果一致; 且在不同的观察时间里MMP一2和MMP一9的 mRNA表达量处于动态变化中,由此可推论MMP 一 2和MMP一9存在于不同种属正常骨胳肌中,不 同生长发育时间表达不同.说明MMPs在mRNA 水平参与了正常骨胳肌生长发育过程中细胞外基质 的重塑改建. 本研究免疫组织化学染色发现:在正常大鼠咀 嚼肌(二腹肌见图3,5)中,肌纤维细胞MMP一2, MMP一9均阳性表达,证明咀嚼肌在生理状态下处 于不断改建的动态平衡之中,而ECM的正常代谢 是维持咀嚼肌形态的基础.当下颌功能性前伸后, 这种平衡被打破.当戴功能性矫治器,MMP一9(图 6)于7d,14d,21d;MMP一2(图4)于14d,2ld阳性表 达增强,表明MMP一2,MMP一9参与咀嚼肌重塑 改建过程,影响ECM的代谢.这与文献[]所报 道的各种骨骼肌适应性变化中MMP一2和MMP一 9的结果一致.而MMP一9的变化比MMP一2的 早,这是由于MMP一9和早期修复事件有关,而 MMP一2在延迟的重塑过程中起重要作用[. 本实验从mRNA和蛋白表达水平证明MMPs 参与了正常咀嚼肌和下颌前伸过程的适应性变化, 从分子水平报道了MMPs参与了咀嚼肌中的适应 性变化,为功能性矫治器引起咀嚼肌适应性改建的 分子机制提供了理论依据. 总之,MMPs在骨骼肌(咀嚼肌)细胞外基质代 谢过程中起着重要作用.肌肉适应性改建的可能因 素可归于多种复杂的蛋白水解过程.目前对这类复 杂调控机制的认识还很肤浅.进一步研究MMPs 在功能矫治器前伸下颌过程中咀嚼肌改建的作用, 以期探讨咀嚼肌适应性变化的分子机制. 参考文献 1SchoserBG,131otmerD.MatrixmetalloproteinasesMMP一2,MMP 一 7andMMP一9indenervatedhumanmuscle.Neuroreport,1999, 10(13):2795—2797. 2BalcerzakD,QuerengesserL.DixonWT.eta1.Coordinate expressionofmatrix—degradingproteinasesandtheiractivatorsand inhibitorsinbovineskeletalmuscle.JAnimSci,2001,79(1):94— 107. 3KherifS,DehaupasM,LafumaC,eta1.Matrixmetalloproteinasea MMP一2andMMP一9indenervatedmuscleandinjurednerve. 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(本文编辑王植三)(收稿日期2006一O3—06) (修回日期2006一O6—20)