四川鸽毛滴虫病调查和鸽毛滴虫体外保存方法

192 西 南 农 业 学 报 Southwest China Journal of Ag cultural Sciences 2009年22卷 1期 V0】．22 No．1 文章编号：1001—4829(2009)01—0192—05 四川鸽毛滴虫病调查和鸽毛滴虫体外保存方法 黄名英 ，廖党金 ，傅安静。 (1．西南民族大学动物科技学院，四川 成都 610066；2四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066；3成都农业科技职业学院 四川 成都 611130) 摘 要：采用随机抽样和镜捡虫体法，调查了3个养鸽场和2个市场上的鸽毛滴虫病，在 17 000只肉鸽中，随机抽查 1980只，鸽毛 滴虫病感染率为75．12％，感染率的范围为34．4-4％ ～94．o0％；信鸽5O只，毛滴虫病的感染率为0％。为探索鸽毛滴虫的保存 方法，就保存温度、保存液种类、保存液的pH值、保存液中的鸽毛滴虫密度、冷冻保护剂等对鸽毛滴虫的影响进行了测定，结果表 明，保存溶液为生理盐水或 pH7．2的PBS液、温度为28cc左右、溶液pH为7．2、保存液中的鸽毛滴虫密度为显微镜以10×40倍下 每个视野5O个 一200个虫体为佳。 关键词：鸽；鸽毛滴虫；保存方法 中图分类号：$858．39 文献标识码：A Investigation of Trichomonas columbae Disease for pigeon in Sichuan Province and Research on in Vitro Preservative M ethod of columbae Body HUANG Ming—ying ．一。LIAO Dang-jin“ ，FU An-jing (1．Southwestern University for Nationalites，Sichuan Chengdu 610066，China；2．Sichuan Academy of Animal Sciences，Siehuan Chengdu 610066，China；3．Chengdu Vocational Academy of Agricultural Science＆Technology，Siehuan Chengdu 611130，China) Abstract：The epidemic situations of Tr／chomonas columbae disease at 3 pigeon farms were investigated using the method of examining worm under microscope．A total number of 2030 pigeons randomLy selected from 17 000 were examined．The results showed the infective rate was 75．12％ and the range ofinfective ratewere 34．44％ -94．00％ atthe3 pigeonfarms in Siehuan province．To obtmn a in vitro preserva- tire method，temperature，kind and pH of preservative liquid，density of columbae body in liquid and coolant affecting the parasite were measured．Th e results were that the in vitro preservative condition of columbae Was the solution ofO．9％ sodium chloride or pH7．2 PBS． thetemperatureof about28"C．the pH of7．2 andthe density of columbae bodyinliquid of50—200 bodies perfield ofmicroscopewith 10×40 times． Key words：Pigeon；Trichomonas columbae；in Vitro preservative method 鸽毛滴虫病是由鸽毛滴虫(Trichomonas colum— bae)寄生于鸽体内引起，根据其寄生部位不同分为 咽喉型和内脏型。Riroha(1878)首次在鸽的小肠中 发现，国内外资料报告，约有80％的鸽带虫，成鸽多 数呈带虫者，幼鸽病状明显 。鸽毛滴虫病任何品 种、年龄的鸽均可感染。肉鸽年龄愈小感染率越 高 J，其中乳鸽感染率高达91．2％，青年鸽感染率 为77．5％，成年鸽感染率最低为43．9％，平均感染 率为70．9％IS]。秦建华(2001) 报道乳鸽的死亡 收稿日期：2008—03—20 基金项目：国家农业科技成果转化资金项 目([2005]380) 作者简介：黄名英(1977一)，女，硕士研究生，专业预防兽医，{ 为通讯作者。 率可达30％ 一8O％。信鸽发病多为 3O～50日龄 幼鸽，发病率达 50．2％，成年鸽未见有明显症 状 J。张爱民(2002)[61对石家庄各大型鸽场的调 查诊断中发现鸽毛滴虫的感染率在 8O％以上。鸽 毛滴虫对成年鸽的致死率较低，主要危害是降低生 长速度、产蛋率等产生性能；对成年信鸽影响其飞翔 速度、高度及飞翔耐力等。我国几乎每一个省、市、 自治区的养鸽地几乎都有该病流行，自古以来，四川 省就有养信鸽的爱好，近年来，随着人们生活水平的 提高，肉鸽已成为四川人们的美餐，全省养有大量肉 鸽，但是，鸽毛滴虫病在四川的流行情况尚无报告。 随着对鸽毛滴虫病的研究深人，在进行药物筛 选、免疫学等研究时，体外保存鸽毛滴虫可以为这些 I期 黄名英等：四川鸽毛滴虫病调套和鸽毛滴虫体外保存方法 研究工作提供方便。但是，鸽毛滴虫的体外保存条 件和方法研究报告罕见，国内尚未见报告。 1 材料与方法 1．1 材料 鸽：肉鸽和信鸽，肉鸽分 6月龄以上的成年鸽、1 ～ 6月龄的青年鸽和 1月龄内的乳鸽。 鸽毛滴虫：剪开刚剖杀病鸽的口腔、喉头和食 道，将粘膜和病变部位一起取下放人玻璃平皿中，加 人少量生理盐水稀释，用灭菌剪刀将病料完全剪碎， 吹打充分混匀，用无菌滴管取一滴混匀后的组织液 于载玻片上，盖上盖玻片后，在显微镜下确认其为鸽 毛滴虫，然后吸取 1滴加到保存液中，使其在显微镜 10×40倍下每个视野中的虫体数量为 50—100左 右，虫体活力为“+++”，立即用于保存条件试验。 1．2 方法 1．2．1 鸽毛滴虫病诊断 取沾有生理盐水的棉签 擦拭病鸽食道粘膜上的干酪样物，涂抹在滴有生理 盐水的玻片上，加盖玻片镜检，看见鸽毛滴虫虫体即 可确诊。 1．2．2 鸽毛滴虫病病情程度 分有典型症状和非 典型床症状，前者为严重，后者较轻微。 典型症状：病鸽表现为食欲降低或废绝，呼吸困 难，有的鼻孔周围有黄色或淡黄色分泌物，眼结膜，粘 膜发绀，腹泻，拉黄绿色粪便，镜检可看见大量虫体。 非典型症状：带虫鸽以镜检虫体数量分为多、 中、少虫体，即以棉花签轻轻刮取1次，在1 mL生理 盐水冲洗涤，然后在显微镜 10×40倍的每个视野 下，虫体数量在 100个以上为多、25～100为中、25 个以下为少。 1．2．3 毛滴虫的成活率和活力 在保存液中的鸽 毛滴虫虫体，每隔12 h镜检 1次，并记录虫体的成 活率和活力。 虫体活力：根据虫体的活动能力，将虫体活力分 为4个等级：没有运动的虫体为“一”；虫体作原地 摆动或转圈运动，活动能力较弱，记为“+”；虫体不 断地作“S”形前进，但速度较慢，运动能力较强，记 为“++”；虫体向前移动迅速，运动能力很强，记为 “ + + + ” 。 虫体成活率：在显微镜下，随机观察和记录虫 体，其成活率计算按以下公式： 虫体成活率 = x 100％。 1．2．4 鸽毛滴虫的保存条件 温度。在3个无菌 瓶中分别加入生理盐水l mL，再加 1滴备好的鸽毛 滴虫液，分别置于 5、1O℃、室温(约 28℃，以下相 同)下保存，每隔12 h观察 1次虫体的成活率和活 力，重复3次。 保存液：在 1 mL无菌生理盐水、1 mL pH7．2的 PBS液、1 mL 1％甘油 +pH7．2的 PBS液、1 mL 1 ％甘油 +0．5％葡萄糖 +pH7．2的 PBS液、1 mL 0． 2％葡萄糖 +0．79％NaC1 5种保存液中分别加备好 的毛滴虫液1滴后混匀 ，置室温下保存，每隔 12 h观 察1次鸽毛滴虫虫体的成活率和活力，重复3次。 pH值：在 1 mL无菌 pH6．2、pH7．2、pH8．2的3 种PBS液中分别加入备好的鸽毛滴虫液 1滴后混 匀，置室温下保存，每隔 12 h观察一次虫体的成活 率和活力，重复3次。 虫体密度：在5个无菌瓶中，分别加人 0．25、0． 5、1．0、2．0、4．0 mL的无菌生理盐水，再向每瓶中加 人 1滴备好的鸽毛滴虫液，充分混匀后放在室温下 保存，在 10×40倍镜下观察，使每个瓶中的虫体密 度在视野下约为400、200、100、50、25个，然后置室 温下保存，每隔 12 h镜检 1次鸽毛滴虫的成活率和 活力。 冷冻保护剂：将含 1O％甘油【8 J、1O％二甲亚 砜、0．5％葡萄糖的生理盐水 1 mL分别加入无菌瓶 中，设不加冷冻保护剂的对照，然后再向每瓶中加入 1滴备好的鸽毛滴虫液，置5℃冰箱中保存，每隔12 h观察一次虫体的活率和活力。 2 结果与 2．1 四川鸽毛滴虫病调查情况 调查工作分别在成都、乐山、德阳、绵阳、遂宁的 专业鸽场进行，并在市场抽查商品肉鸽。共调查了 17 000只鸽子，抽查了2030只，结果见表 1。鸽毛 滴虫病的感染率为 34．44％ 一94．00％，肉鸽的感 染率为77．O2％，其中，成年鸽的毛滴虫病感染率为 86．17％，青年鸽的毛滴虫病感染率为73．77％，乳 鸽的毛滴虫病感染率为 62．29％，市场商品鸽的毛 滴虫病感染率为79．80％。调查的信鸽仅有5O只， 毛滴虫病的感染率为0％。所有鸽的平均感染率为 75．12 ％ 。 2．2 鸽毛滴虫的体外保存条件 2．2．1 温度对虫体保存的影响 生理盐水中的鸽 毛滴虫，在5、10℃、室温下，其成活率和虫体的活力 结果见表2。在5℃下，保存2 d，有80％的虫体成 活，并且虫体的活动能力为“+++”，但48 h后虫 体迅速死亡，且死亡虫体的活动能力也急剧下降，即 生理盐水中的鸽毛滴虫在5℃下能够保存2 d。在 1O℃下，保存24 h后，虫体的成活率开始下降，36 h 194 西 南 农 业 学 报 22卷 表 2 温度对鸽毛滴虫体外保存的影响 Table 2 The effeet ofthetemperature onthe preservation ofTr／chomonaz co／umbaein vitro 12 24 36 48 6O 72 84 96 108 l2O + + + + + + + + + + + + + + 99 99 40 1O O O + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 后的成活率下降更明显，即生理盐水中的鸽毛滴虫 在 1O℃下最长保存 1．5 d。在室温下，保存24 h后 第84h后虫体成活率仍然达5O％，并运动能力为 “ + + + ” ，84 h后虫体成活率急剧下降，并且活虫 虫体的成活率开始下降，但下降的速度相对较慢，至 体的活力也显著下降，即生理盐水中的鸽毛滴虫在 表3 鸽毛滴虫在不同溶液中的保存时间 Table 3 The preservationtime ofTrichomonas columbae 12 24 36 48 6O 72 84 96 108 + + + + + + 十 + + + + + + + + + + + + 120 0 一 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 0 + + + + + + + + + + + 99 99 l0 1 0 O + + + + + 十 一 一 砑 面 菠丽 油 pH7．2的PBS液、1％甘油+o．5％葡萄糖+pH7．2的PBS液、0．2％葡 萄糖 +O．79％NaC1。 ∞ ∞ ∞ ∞ m 0 0 鲫 m 0 0 ∞ ● O m 5 O O ∞ 加 ∞ ∞ m 0 0 如 ∞ ∞ 如 m 0 1期 黄名英等：四川鸽毛滴虫病调查和鸽毛滴虫体外保存方法 表 4 鸽毛滴虫在pH 6．2、7．2、8．2的 PBS液中活率和活力的变化 Table 4 The change of the survival rate and vitality of Tr／chomonas columbae in PBS at pH 6．2，7．2 and 8．2 室温下保存时间 3．5 d较好。结果比较表明，生理 盐水中的鸽毛滴虫置室温下保存较好。 2．2．2 不同成分保存液对虫体的影响 鸽毛滴虫 分别在生理盐水、pH7．2的 PBS液、1％甘油 + pH7．2的PBS液、l％甘油 +0．5％葡萄糖 +pH7．2 中，在室温下的鸽毛滴虫的存活时间见表 3。在生 理盐水和PBS液中保存84 h，50％的鸽毛滴虫的活 力为“++”，而在甘油 +PBS液、甘油 +葡萄糖 + PBS液、葡萄糖 +0．79％NaC1中保存 36h，鸽毛滴 虫的活率活力大大降低，这表明鸽毛滴虫适于在生 的PBS液、0．2％葡萄糖+O．79％NaC1 5种保存液 理盐水和pH7．2的PBS液中保存。 表5 不同量的保存液对虫体活率和活力的影响 Table 5 The effect ofthe preservation onthe survival rate and vitality ofTr／chomonas columbae 表6 在甘油、二甲亚砜、葡萄糖中虫体的活率和活力(5℃) Table 6 The the survival rate and vitality of Tr／chomonas columbae in the glycerol，dimethyl sulfoxide and glucose at 5℃ 西 南 农 业 学 报 22卷 2．2．3 pH对虫体的影响 不同3种 pH值条件 下，鸽毛滴虫的成活率和活力见表 4。在 pH7．2的 PBS中保存72 h，有 30、％虫体的活力为“+”，；在 pH6．2中保存48 h，有3o％的虫体活力为“++”；在 pH8．2中保存24h，仅有10％的虫体的活力为“++”， 这表明鸽毛滴虫保存的溶液pH为中性较好。 2．2．4 虫体密度对虫体保存的影响 在同一保存 液中，不同虫体密度对鸽毛滴虫保存时间的结果见 表 5，保存84 h之前，5种虫体密度的成活率和活力 差异不明显，但保存84 h后，这5种虫体密度的成 活率和活力明显下降，这表明不同虫体密度对鸽毛 滴虫的保存影响不明显。但是，在试验过程中，鸽毛 滴虫的密度过低或过高都不便于观察和计数虫体， 故采用在显微镜的10×40倍下，每个视野中为 50—2o0个虫体较好。 2．2．5 冷冻保护剂对虫体存活的影响 用10％甘 油、l0％二甲亚砜、0．5％葡萄糖作冷冻保护剂，对 鸽毛滴虫保存时间见表6。在5℃下，在有甘油、二 甲亚砜或葡萄糖的生理盐水中保存 36 h后，鸽毛滴 虫的成活率和活力下降的速度快于生理盐水，而保 存48 h后，4种溶液中的鸽毛滴虫成活率和活力都 迅速下降，这表明在5℃下，冷冻保护剂对鸽毛滴虫 不能起到保护作用，相反降低了其虫体的成活率和 活力。 3 结论与讨论 3．1 四川鸽毛滴虫病的危害及防治 在被调查的四川养鸽场，鸽毛滴虫病的感染率 为34．44％ 一94．0o％，平均感染率为75．12％，这 表明鸽毛滴虫感染情况很严重，即鸽毛滴虫病是四 川养鸽防治的主要疾病之一。许多资料报告该病很 难根除，应以平时预防为主。其防治措施：加强管 理，补充营养；隔离病鸽，采用相应药物防治；预防应 从成年鸽起，成年鸽和乳鸽兼治 引¨。 3．2 鸽毛滴虫的体外保存条件 虫体在5、lO℃、室温3个温度条件下，室温保 存条件下的虫体的活率、活力优于另外两个温度。 另外，阴道毛滴虫在超低温下保存，其效果令人满 意 J，但鸽毛滴虫是否适合在超低温保存，待进一 步研究。 在生理盐水、pH7．2的 PBS液、1％甘油 + pH7．2的PBS液、l％甘油+0．5％葡萄糖+pH7．2 的PBS液、0．2％葡萄糖+0．79％NaC1 5种保存液 中，从表3中显示在几种液体中，鸽毛滴虫在生理盐 水或 pH7．2的PBS液中的保存效果较好。 pH对虫体的存活时间有很大的影响，碱性条件 不利于虫体的保存，而在中性条件下保存时间更长。 鸽毛滴虫的虫体密度对保存没有明显的影响， 但是在试验中观察，一般采用在显微镜 10×40倍 下，每个视野中有5O一200个虫体的密度为宜。 病料保存在5℃左右时，保护剂对鸽毛滴虫的 成活率和活力具有明显降低。二甲亚砜本身有抑制 核酸酶的作用，在其浓度低时，不足以将核酸酶的作 用完全抑制，使部分DNA降解，引起死亡，只有在二 甲基亚砜达到一定浓度，有效地将核酸酶抑制住，才 能得到较好的保虫效果。甘油分子量比较小，能对 虫体的膜起保护作用，只要浓度适当，甘油对虫体的 保存是有益的 J。 以上表明，鸽毛滴虫在体外保存的最佳条件：温 度为室温(约28℃)、保存溶液为生理盐水或 pH7． 2的PBS液、溶液的pH值为中性、保存液中的鸽毛 滴虫密度为显微镜为 10×40倍下每个视野 5O一 200个虫体。 3．3 鸽毛滴虫的虫株 鸽感染毛滴虫后表现出典型或非典型的症状， 病变是否出现、死亡的严重与否，其中，虫株的毒力 是影响因素之一¨¨ ，但鸽毛滴虫的体外保存时间是 否与虫株有关，待进一步观察。 参考文献： [1]邱深本，罗映霞，李 胜，等．鸽毛滴虫病的综合防治[J]．养禽与 禽病防治，2003(9)：39． [2]陈宗椿，陈应江，陈仁桃，等．鸽毛滴虫的防治(J]．广东畜牧兽医 科技。1994，19(4)：13． [3]陈仁桃，王玉龙，陈仁余，等．肉鸽毛滴虫的感染及防治[J]．浙江 畜牧兽医，1995(1)：45 [4]秦建华，赵月兰，田希荣．肉鸽毛滴虫病的发生与防治[J]．当代 畜牧，2001(1)：21 [5]严斯刚．鸽毛滴虫病的诊断与防治[J]．养禽与禽病防治。2000 (3)：37． [6]张爱民．鸽场如何防治毛滴虫病[J]．养禽与禽病防治，2002(1)： 27． [7]秦建华，赵月兰，张明勇．不同保存洗衣服对堆型艾美耳球虫早 熟减毒株子孢子活力的影响[J]．中国兽医寄生虫病，1996，4 (4)：14—16． [8]廖 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