野生与杂交天麻的DNA标记鉴定

野生与杂交天麻的DNA标记鉴定 安徽农业科学,JournalofAnhuiagn.Sci.2010,38(27):14860,14916责任编辑刘月娟责 任校对李杨 野生与杂交天麻的DNA标记鉴定 王晓丽,陈祖云,王晓玲,宋聚先 (1.贵阳医学院药用植物与生药学教研室,贵州贵阳550004;2.贵州大学农学院,贵 州贵阳550025) 摘要[目的]从分子水平鉴定野生和杂交天麻.[方法]合成SSR特异引物用于天麻 基因组DNA的PCR扩增.[结果]SSR扩增重复 性好,多态性高,分辨力强,野生和杂交天麻有各自特异的DNA标记.其中,杂交天 麻均扩增出2条带,为杂合子;野生天麻只扩增出1 条带,为纯合子.[结论]该研究为野生和杂交天麻种质资源的鉴别,保护,育种提供 了一条有效的途径. 关键词种质;天麻;SSR;DNA标记 中图分类号$567文献标识码A文章编号0517—6611(2010)27—14860—01 IdentifieationofWiIdandCultivatedGastrodiaelataBLbySSRMoleeularMarker wANGXiao-lietal(DepartmentofMedicalPlantandPharmacognosy,MedicalCollegeGuiyang,Guiyang,Guizhou550oo4) AbstractIObiective}WildandcultivatedGastrodiaelataB1.werejdentifiedbySSRmolecularmarker.fMethodIDistinefiveprimers synthesizedtothePCRamplificationofthegenomicDNA.[Result]Thenumberofbandsamplifiedwastwoingenerativepropagatedindividu- alswhichwasheterozygoteandoneinwildandclonepropagatedindividualswhichwerehomozygote.fConclusion1SSRcouldeffectivelydis. tinguishheterozygoteandhomozygote,whichwouldprovideeffectivepathwayfortheidentificationandprotectionofGastrodiadataB1.germ— plasm—resourcesandselectbreeding. KeywordsGermplasms:Gastrodiaelata;SSR;MarkerofDNA GastrodiaelataB1.是《中国药典》收载名贵中药天麻的唯 一 入药品种,其块茎入药.天麻传统的原植物鉴定,性状鉴 定,显微鉴定,理化鉴定等方法,均不能准确区分野生与杂交 天麻,使天麻种质资源的鉴定,保护,开发和利用受到制约. DNA分子标记鉴定是近年发展起来的一项新技术,能从 DNA水平反映中药种质的遗传特征,具有准确性高,特异性 强的特点,不受季节,产地的影响.常用方法有2种.一是 DNA指纹(标记)鉴定,利用数个DNA区域去建立DNA指 纹图,然后比较不同药品的指纹图;二是DNA序列测定,用 作测定某DNA区域的序列,并使用生物信息分析软件校对 及排列序列,.这些数据能用于建立DNA指纹及序列资料 库,为中药DNA分子鉴定提供专业和可靠的资料.简单序 列重复(Simplesequencerepeat,SSR)分子标记的主要特点为 数量丰富(广泛分布于整个基因组),共显性标记(可鉴别出 杂合子和纯合子),试验重复性好,结果可靠等.笔者利用 SSR分子标记对采白天麻地道产区的贵州野生和栽培品种 进行研究,为野生和栽培天麻种质资源的鉴定,保护及开发 应用奠定基础". 1234567M89 1材料与方法 1.1供试材料在贵州大方县天麻有性繁殖中心采到杂交 天麻(1,2,8,9号);在贵州丽琳生物技术有限公司协助下,深 人人迹罕至的贵州山区采到野生天麻(3,4,5,6,7号).所有 样品均由贵阳医学院生药教研室鉴定. 1.2方法 1.2.1.采用改进的CTAB法提取基因组DNA. 1.2.2PCR扩增.PCR反应体系为25,ddH:O12.5, 10倍Buffer2.5txl,dNTPs(2mmol/L)2.5,Mg2(25 mmol/L)1.75Ixl,Taq酶(2u/~1)o.75,模版DNA1(20 ng),上游引物(8p~mol/L)2l,下游引物(8Ixmol/L)2. PCR反应程序为:94.0?,5min;94.0oC,lmin,58.0?,1 min,72.0?,1min,35cycles,72.0oC,5min,4.0?.琼脂糖 凝胶电泳,照相. 2结果与分析 由图1可知,扩增条带经Ge1.ProAnalyzerVersion4.5软 件识别有效,所有样品均扩增出了条带.从扩增结果可以看 出,3,4,5,6,7号野生天麻扩增出1条带,SSR位点是纯合型; 1234567M89 基金项目 作者简介 收稿日期 科技部2004BA721A33;黔科合农社字(2001)1125号;黔科 合中药专字[2003}51号. 王晓丽(1957一),女,贵州毕节人,教授,从事中草药种质资 源开发与应用研究.通讯作者,副教授,从事植物种质资 源与保护方面的研究,E—mail:wx1596@126.COrn. 2010.O6.】7 l,2,8,9号杂交天麻扩增出2条带,SSR位点是杂合型.这是 因为天麻为自花授粉植物,在野生条件下生长的天麻只能靠自 交繁殖,纯合型基因保持不变;通过人工授粉杂交栽培的天麻, 由于不同的基因型遗传到子代,杂交后的基因为杂合型. (下转第14916页) 14916安徽农业科学2O1O王E 水平.这明覆盖有利于提高根系的保水力. i 槲 蓬蕾 富 06243048 时间Ti{【e"h 图1不同水分胁迫处理对菠萝根系保水力的影响 Fig.1Waterholdingcapacityofpineapplerootsunderwater stress 2.4不同处理对菠萝根系活力的影晌覆盖处理菠萝根系 活力为0.063g/(g?h),对照处理菠萝根系活力为0.049 g/(g?h);与对照相比,覆盖处理菠萝根系活力增幅达 28.57%. 3小结 研究表明,覆盖栽培提高了菠萝的根系活力,保水力,体 积和干重,有利于根系的生长.同时,覆盖栽培有利于菠萝 地上部发育,菠萝株高,株鲜重和株干重均大于对照. 参考文献 [1]邵艳军,山仑.植物耐旱视师开究进展[J].中国生态农业,2006,14 (4):16—20. [2]员学锋,吴普特,汪有科.地膜覆盖保墒灌溉的土壤水,热以及作物效 应研究[J].灌溉排水,20O6,25(1):25—29. [3]蔡昆争,骆世明,方祥.水稻覆膜旱作对根叶性状,土壤养分和土壤微 生物活性的影响[J].生态,2OO6,26(6):1903—1911. [4]高俊反.植物生理学实验技术[M].北京:高等教育出版社,1990. [5]赵爱芬,黄学文_春小麦根系生长动态研究[J].华北农,1993,8 (1):88—93. (上接第14860页) 试验能将供试品分离开来,其中最大片段为520bp,最 小片段为320bp.与各对应片段比较,各供试品相应DNA 片段迁移率基本相同.该试验采用琼脂糖电泳的优点如下: ?制备方便,操作简单;?电泳后的样品可直接用紫外检测; ?电泳后区带易染色,样品易洗脱,便于定量分析.此外,还 可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行天麻的SSR检测研究,进一 步提高分辨率.' 3讨论 自古以来,人们认为天麻是"天生神麻","天麻会走种 下没有".原因是天麻种子细小,无胚乳,只有胚,从种子到 箭麻都生长在地下.在整个生长发育过程中,天麻种子萌发 需要小菇属萌发菌提供营养,种子萌发后形成的原球茎,米 麻及白麻必须有密环菌的侵入提供营养,天麻才能生长发 育.天麻野生种质具有中药天麻可持续发展的较完整的原 始基因,是不可多得的育种好材料.尽管野生天麻生长在 人迹罕至的地方,但野生天麻资源的任意采挖严重,所存数 量极少.目前市售天麻绝大部分为栽培或仿野生林下栽培 天麻,其中有大部分为杂交天麻.SSR分子标记对野生天麻 与杂交天麻表现出了很好的鉴别能力,为保护天麻种质资 源,确保天麻的可持续发展提供依据. 参考文献 [1]庄元春,庄诚,税丕先.天麻与伪品大理菊的生药学鉴定[J].吉林中医 药,2oo4(12):1. [2]王富丽,罗跃娥,刘斌.天麻的真伪鉴定[J].时珍国医国药,2o04(8): 5?. [3]李宗菊,熊丽,桂敏,等.非洲菊基因组DNA提取及IS—SR—PCR扩增 模板浓度优化[J]云南植物研究,2o04(4):439—444. [4]MEDRAOU1L,ATERM,BENCHABIBO,eta1.EvaluationofgeneticVat- iabilityofsorghum(Sorgh~blcolorL.Moench)innorthwesternMorocco byISSRandRAPDmarke~[J].CRBiologies,20O7,330(11):789. [5]王晓丽,王晓玲,王晓多.天麻亲本材料的分己[J].贵州农业科学, 2o10.38(2):10—12. 科技写作规范——标点符号标点符号按照1990年国家语言文字工作委员会等公布的《标点符号的用法》执行, 每个标点占一格(破折号占两格).外文中的标点符号按照外文的规范和习惯.外文字母,阿拉伯数字,百分号等并列时,其 问用",",不用顿号",".注意破折号"——",范围号"一"和连字符"一"的不同用法.破折号又称两字线或双连划,占两个字 身位置;范围号又称一字线或全身划,占一个字身位置,连字符又称半字线或对开划,占半个字身位置.破折号可作文中的 补充性说明(如注释,插入语等),或用于公式或图表的说明文字中.范围号用于表示从某某到某某.例如20—30?,70%一 90%,1949--1986年(本刊文中范围号写成"一",参考文献范围号用"一".连字符用于连接词组,或用于连接化合物名称与 其前面的符号或位序,或用于公式,表格,插图,插,型号,样本等的编号.外文中的破折号(Dash)的字身与in宽,俗称nl Dash,其用法与中文中的破折号相当.外文的连接符俗称哈芬(hyphen).其中,对开哈芬的字身为m字身的一半,相当于中 文中范围号的用法;三开哈芬的字身为m字母的1/3,相当于中文中的连字符的用法. 65432lO nnnmn