广西轻工业
GUANGXI JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY
2011年 6月
第 6期(总第 151期) 食品与生物
近年来,随着食品安全的关注度越来越高,食品微生物学
检测也在短短的两年间更改了多个
。新的检测方法,与国
际接轨的检测技术正逐渐进入我们的国标行列。其中大肠菌群
的测定无论从原理方法、试剂材料等方面都做了较大的改动,
结果的
示方式也与 03版的标准大相径庭。然而我国由于绝
大部分的卫生标准还沿用旧标准的形式,造成在 08版的标准
发布后不久,卫生部于 2009年发出第 16号文,明确了指标以
MPN/100mL(g)为单位的,仍然按照 03 版的标准进行测定。
2010年食品安全国家标准出台后,虽然卫生部没有再发布相
关公告,但食品业界及第三方检测机构均仍然按照旧标准对以
MPN/100mL(g)为指标单位的样品进行检测,如此便造成了在
国内长时间存在着新旧检测标准共存的情况。
本文就试图通过统计数据,
GB/T4789.03- 2003的乳
糖胆盐发酵法和 GB 4789.3- 2010的 LST- BGLB发酵法进行
检测的结果差异,并就差异原因进行分析讨论。
1 实验材料
1.1 样品准备
由于微生物污染具有不均一性,考虑到实验主要评述方法
间的差异,为了将由样品而引起的误差减到最低限度,本实验拟
采用均一性较好的粉剂或液体,并且大肠菌群含量适中的样品
进行试验。但在实际工作中,卫生检验的主要对象为即食食品,
因而实验也选取了各种从市场上购买的即食食品作为样品。
根据工作经验,选择散装生牛奶、玉米粉、蔬菜粉、虾粉、植
物饮料和裹粉等 6个样品作为均一性样品,并结合即食食品,
从不同大肠菌群含量比较两个方法之间的结果差异。
1.2 培养基
GB/T4789.03- 2003:乳糖胆盐发酵培养基,伊红美兰琼
脂,乳糖发酵培养基。
GB 4789.03- 2010:月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST),煌
绿胆盐肉汤(BGLB)。
1.3 仪器
超净工作台、生化培养箱、显微镜。
2 实验原理和方法
取上述样品,按两种方法同时接种。
2.1 检验步骤
依据 GB/T4789.3- 2003《食品卫生微生物学检验大肠菌
群测定》[1],检验主要有以下步骤:
(1)接种:以无菌操作取均匀后检样 25 mL(g)放于含有
225 mL灭菌生理盐水的灭菌三角烧瓶中,经充分振摇做成 1:
10的均匀稀释样液。根据食品卫生标准要求和对样品污染情
况的判断,选择 3个稀释度,每个稀释度接种 3管,放置 36℃
±1℃的生化培养箱内培养 24±2 h。
(2)平板分离:将产气的发酵管分别划线在伊红美蓝琼脂
平板上,置 36℃±1℃的生化培养箱内培养 24±2 h。
(3)染色和证实:观察菌落形态,并做革兰染色。革兰染色
阴性的无芽胞杆菌的试管接种乳糖发酵管,置 36℃±1℃的生
化培养箱内培养 24±2 h。
(4)结果报告:凡是乳糖管产气、革兰染色阴性的无芽胞杆
菌,判定该管为大肠菌群阳性。根据大肠菌群阳性的管数,查
MPN检索表,乘以稀释倍数,报告每 100 mL(g)样品中大肠菌
群的MPN值。
2.2 测试步骤
依据 GB 4789.3- 2010《食品安全国家标准微生物学检验
大肠菌群测定》[2],测试主要有以下步骤:
(1)接种:以无菌操作取均匀后检样 25 mL(g)放于含有
225 mL灭菌生理盐水的灭菌三角烧瓶中,经充分振摇做成 1:
10的均匀稀释样液。根据食品卫生标准要求和对样品污染情
况的判断,选择 3 个稀释度,每个稀释度接种 3 管 LST,放置
36±1℃的生化培养箱内培养 48±2 h。
(2)证实:将产气的发酵管挑取一环菌液接种 BGLB管,放
置 36±1℃的生化培养箱内培养 48±2 h。
(3)结果报告:根据大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,
乘以稀释倍数,报告每 1mL(g)样品中大肠菌群的MPN值。
3 结果
乳糖法查表单位为 MPN/100g,LST 法查表单位为
MPN/g,为使两方法具有可比性,将 LST法查表结果×100。
【作者简介】梁智安(1984-),男,助理工程师,研究方向:食品微生物检测技术与食品安全分析。
食品中大肠菌群检测的新旧国标方法差异探讨
梁智安
(广州市食品工业卫生检测所,广东 广州 51 041 0)
【摘 要】 目前我国由于食品卫生标准尚未完全统一,造成国内在较长时间内对食品中大肠菌群检测的方法新旧国标并存
的情况。对不同样品分别用两种方法进行检测,进行差异分析,并就造成差异的原因进行探讨。结果表明两方法结果虽不存在明显
差异,但两结果不完全一致。
【关键词】 大肠菌群;新旧方法;差异探讨
【中图分类号】 R123.1 【文献标识码】 A 【文章编号】 1003- 2673(2011)06-21-02
21
表1 实验结果表
4 统计分析
由于MPN值是基于泊松分布的统计学概率分布,其值变
化较大,目前并没有国标或明确的规定如何对其精密度和重复
性进行计算判定。本文就试图通过以下方法,对上述检验结果
进行分析。
(1)采用常用的数学统计学 t配对检验,求证两方法之间
是否存在显著差异。假设两方法的均值的差值 u=0,分析过
程如下:
表2 t配对检验数据处理表
X=52.83,ΣX=634,ΣX2=125580
SX=S/ n姨 = ΣX2 - ΣΣ ΣX
2
/Σ Σn / n n-Σ Σ1Σ Σ姨 =
125580- 52.83
2
/1Σ Σ2 /12 12-Σ Σ1姨 =949.60
t= xΣΣ-μ/SX =0.055
设α=0.05,则 t(11)0.05=2.201
t<t(11)0.05,故 P>0.05,两方法之间不存在显著差异。
(2)有研究[3]采用采用 Log10X的形式,Log10X1- Log10X2
≤1时,则两者结果相符合。
表3 Log10X 数据分析表
分析结果显示两方法的结果均符合,没有明显差别,不存
在显著差异。
(3)由 ISO6888:3- 2003[4]可知,用 MPN法测定葡萄球菌
时,有 75%的可能性两结果的差异小于它们平均值的 1.25倍。
我们借用此判定规则,对结果进行整理,显示本次实验的 12个
结果均未超出此标准,则两方法对结果的判定没有明显差别。
(4)以 MPN表给出的 95%置信区间范围进行评估,可以
得出两方法检测结果菌落在双方的置信区间范围内(见表 4)。
表4 95%置信区间评估表
5 讨论
大肠菌群并不是某一种菌属的名称,标准对其的定义为
“在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧
革兰氏阴性无芽胞杆菌”,它包括了埃希氏菌属、柠檬酸杆菌
属、克雷伯菌属、肠杆菌属[5],难以用确定的菌体形态、平板特征
或生化特征对其进行描述和分辨,并且大肠菌群细菌由于周围
环境的变化,可以产生生理特性上的变异,因而对其检验均存
在一定的误差。
从数据分析可知,两结果并没有明显差异,但在实验大多
数情况上,二者相差一到两管阳性管,并且可以看出,LST法的
灵敏度更高。对此,可能的原因有:
(1)新旧方法最为明显的是培养基的变化,虽然两者都建
立在乳糖发酵的基础上,但由于使用的步骤和抑菌剂不同,造
成两者在结果数据上存在差异。乳糖胆盐培养基中抑菌剂为胆
盐,有研究显示采用不同的胆盐,其抑菌效果差异明显[6]。LST
采用月桂基硫酸钠,能有效抑制非大肠菌群的生长。而且新方
法中 BGLB发酵能避免非乳糖的干扰,而且也避免了许多芽孢
杆菌等杂菌的干扰。
(2)乳糖胆盐法需经过平板分离的步骤,大肠菌在伊红美
蓝培养基中,因分解乳糖产酸,使伊红与美蓝结合而行成黑色
化合物,故菌落呈黑紫色,有时还有金属光泽。因此,检验人员
对大肠菌群菌落特征色泽和形态的熟悉程度,对检出率影响很
大。通常需要多挑可疑菌落,以避免假阴性的结果。可见,乳糖
法对人员要求比较高,而 LST法取消了平板分离步骤,减少了
由于主观性而造成的误差。
参考文献
[1]GB/T4789.3-2003,食品卫生微生物学检验大肠菌群测定[S].
[2]GB 4789.3-2010,食品安全国家标准微生物学检验大肠菌群测定[S].
[3]沈飚,汪云泉,徐君辉.M PN 原理的TEM PO 仪检测食品中大肠菌群
检测数据评定[J].检验检疫学刊,2009(3).39-40.
[4]ISO 6888:3-2003 M icrobiology offood and anim alfeeding stuffs
— H orizontalm ethod for the enum eration ofcoagulase-positive
staphylococci (Staphylococcusaureusand otherspecies)—Part3:
D etectionandM PN techniqueforlow num bers[S].
[5]李志明.食品卫生微生物学检验[M ].北京:化学工业出版社,2009.
[6]孟昭赫.食品卫生微生物学方法注解微生物学部分[M ].北京:人民卫
生出版社,1990.
���
������
���������
������
�
��
�
�
�
�
����
���������
�
����
�
��
�
�
�
�
��
�
�
��
�
��
�
�
�
�
���������������������������
��
����������������������
��
�
����������������������
�
�����������������������
�������������������������
�
����������������������
�������������������������
��������������������������
�������������������������
��������������������������
�� !������������������������
"#$�����������������������
�
���������
�
���
���������
�
���
���������
�������
�������
��������
�����������������
������������������������������
������������������������
�������
������������������������������
�������
����
������
���������
�����������������������������
�� ���������������������������
!"���������������������������
#$�����������������������������
%&�����������������������������
��'(�����������������������������
)*+�������������������������������
�
��������������� �
����������
��������������
��
�������������������������������
�
������������������������
�������������������������
��������������������������������������
�
���
������
���������
������
�
��
�����
���������
�����
�
��
�
���������
������
������
�������
������
������
����
��
�������
�
�
�������
����
�����������������
���
������
�������
����
��
���
��������
�������
���
������
������
�������
���
�
�����
����
��
�������
���
�������
�� �
��
�������
���
��������
!"�����
������
����
�����
#$�����
���
��
����
��
���
��%&�
���
��������
����
���������
'()������
����
����
�����
���
����
�
22