内皮素拮抗剂对鼠黑素瘤细胞黑素生成影响的研究

108 史堡廑腿抖塞盔2Q鲤生2旦筮42鲞笠2翅￡丛n』旦￡婴熊Q!，＆照型BⅡ2Q螋，y丛：垒2，盥Q2 内皮素拮抗剂对鼠黑素瘤细胞黑素 生成影响的研究 吴品茹 陈向东徐慧 汪蓓青刘健航 【摘要】目的研究天然提取的内皮素拮抗剂对体外培养的B16鼠黑素瘤细胞的生物学作用。方法 比较观察了内皮素拮抗剂和甘草黄酮对体外培养的B16鼠黑索瘤细胞酪氨酸酶活性、黑素含量和细胞增 殖率的影响，以及内皮素拮抗剂对内皮素(ET一-1)引起的B16细胞酪氨酸酶活性变化的作用。结果在实 验浓度下，甘草黄酮具有浓度依赖性黑素合成抑制作用，内皮索拈抗剂对培养的B16黑素瘤细胞黑素生 成没有直接的抑制作用，但能特异性抑制内皮素对黑素瘤细胞分化和酪氨酸酶的激活作用，200IX∥mL该 拮抗剂即可显著拮抗0．5斗g／mLET一1对黑素瘤细胞的刺激增殖作用，与甘草黄酮相比，细胞毒性较小。 结论内皮素拮抗剂是一种安全的皮肤美白物质，在UVB照射后内皮素增加引起的皮肤色素沉着中，具 有广泛的应用前景。 【关键词】甘草黄酮；内皮缩血管肽类；一元酚单氧酶 EffectsofendothelinantagonistonmelanogenesisofculturedB16murinemelanomacells WU Pin-111。cHENXiang-dong,XUHui,wANGBei-qing,LIUJian—hang．DepartmentofDermatology，Shanghai NinthPeople7sHospital，ShanghaiJiaoTongUniversitYSchoolofMedcine．Shanghaj2000¨．China CorrespondingallthOf"LIUJian-hang,Email：liujianhang(园medmail．corn．cn 【Abstract】ObjectiveToevaluatethebiologicaleffectofendothelin(ET)antagonistoncultured B16murinemelanomacells．MethodsB16murinemelanomacellswereculturedinthepresenceof variousconcentrations(31．25，62．5，125，250，500Ix∥mL)ofETantagonistorlicoflavone．Then，melanoma ceilswereharvestedforthedetectionoftyrosinaseactivityandmelanincontent．Theproliferationrateof melanomacellswasmeasuredwithMTTmethod．TheefrectofETantagonistwascomparedwimthatof licoflavone．ResultsLicoflavonehadaconcentration．dependentinhibitiononmelanogenesis．TheET antagonistselectivelysuppressedtheET．inducedstimulationoftyrosinaseandeelldifferentiationofBl6 cells，buthadnodirectinhibitoryeffectonmelanogenesisinculture，andlittleinfluenceonmelanocyte viability．TheadditionofETantagonistat200“∥mLcouldsignificantlyinhibitET(0．5“g／mL)．induced melanogenesisinBl6cells．Thecytotoxityoftheantagonistwasrelativelylowerthanthatoflicoflavone． ConclusionsTheresultsSUggestthattheETantagonistiSasafeskin-whiteningingredient，andmayhavea wideapplicationperspectiveinthepreventionofendothelin—inducedskinpigmentationafterUVBirradiation． 【Keywords】Licoflavoue；Endothelins；Monophenolmonooxygenase 紫外线(uV)照射可刺激角质形成细胞合成分 泌内皮素一1(ET一1)，促进黑素细胞增殖及酪氨酸酶 的活性⋯。最近研究发现，天然提取物能拈抗内皮素 对B16黑素瘤细胞的刺激增殖作用，其机制尚不清 楚12]。本研究用体外培养的B16鼠黑素瘤细胞作模 型观察内皮素拮抗剂对B16细胞的形态，酪氨酸酶 活性，黑素含量和细胞增殖率的影响，以及对ET一1 的拮抗作用，并与天然美白物甘草黄酮及熊果苷比 较，旨在研究其皮肤脱色作用机制，为内皮素拮抗剂 作为新的美白剂应用于临床提供依据。 DOI：10．3760／cma．j．issn．0412--4030．2009．02．016 基金项目：上海一联合利华研究与发展基金(200501) 作者单位：200011上海市第几人民医院 通信作者：刘健航．Email：liujianhang@medmail．conLcn 材料与方法 ·论著· 一、试剂与仪器 RPMI1640培养液(美国Gibco公司)，左旋多 巴和ET一1购自美国Sigma公司，甘草黄酮、熊果苷 和天然提取内皮素拮抗剂(编号01i2168)均由上海 奥利实业有限公司提供，分光光度计购自上海精密 分析仪器有限公司。 二、方法 1．B16细胞培养：B16鼠黑素瘤细胞株购于中 国科学院细胞所。待细胞生长至近融合状态，经 0．25％胰蛋白酶和EDTA0．02％消化，用含有10％ FBS的RPMI1640培养液(含100U／mL青霉素， 100Ixg,／mL链霉素)传代，置C02孵箱37℃，5％ 万方数据 生堡廛瓞叠塞志2Q螋生2旦箍垒2鲞筮2期￡丛Ⅱ』旦￡四型Q!，＆b型§理2Q螋，y逊：垒2，丛Q：2 CO：，饱和湿度环境常规进行培养，每一次实验均取 自同一传代细胞，根据实验设计和培养皿规格 选定细胞初始接种浓度为105／mL左右。细胞接种 24h后，用添加测试物的新鲜培养基换液1次。继 续孵育72h后收获细胞，台盼蓝染色计数活细胞 数，然后将细胞分为2份，分别用于酪氨酸酶活性和 黑素含量测定。 2．试剂配置与实验分组：天然提取内皮素拮抗 剂贮液用生理盐水新鲜配制，甘草黄酮贮液用 DMSO新鲜配制，一20℃保存，临用时用新鲜培养 基调至终浓度。将质量浓度为1000Ixg／mL的各测 试物用倍比稀释法分别稀释为500、250、125、62．5、 31．25p。g／mL，空白对照组仅加入测试物所用相应溶 媒(DMSO或生理盐水)。 3．酪氨酸酶活性测定：参照Ando等引报道的方 法并稍加改良。收获大约107细胞，离心后PBS洗 2次，加入0．5％脱氧胆酸钠裂解细胞，将细胞裂 解物加入到含0．1％左旋多巴的0．1mol／LPBS (pH6．8)反应液中，37℃孵育20rain分光光度计测 定反应生成的多巴色素的吸光度(A舯，。)，同时用左 旋多巴的自动氧化进行校正。酪氨酸酶活性以(测 试物处理组A钾；值／细胞数)／(空白对照组‰，值／细 胞数)X100％来表示，每一处理因素重复测定3次。 4．黑素含量测定：参照文献[4]的方法，收获大 约107细胞，离心后PBS洗2次，加入200trL三蒸 水使沉淀悬浮，再加入1mL的乙醇：乙醚(1：1)混 合液室温下静置20min，3000r／min离心5min，沉 淀加入1mol／LNaOH1mE(含10％DMSO)，在80℃ 水浴中孵育30min，立即在475nIn的分光光度计 上测吸光度。黑素量以(测试物处理组A仍值／细胞 数)／(空白对照组A奶值／细胞数)X100％来表示，每 一处理因素重复测定3次。 5．M13"法测定细胞增殖率⋯：取对数生长期的 B16细胞，经消化分散制备单细胞悬液，计数，将细 胞接种至96孔细胞培养 板，接种密度为i04／：fL，液体 量200斗蚜L，过夜，待细胞 贴壁，吸去培养液，用含有 不同浓度处理因素(31．25、 62．5、125、250、500txg／mL 5种浓度)的新鲜培养基换 液1次，空白对照组仅加 入培养液和相应溶媒．继 续培养72h，药物处理结 束时，每孑L加5g，LMTF20“L，继续置CO：孵箱培 养4h，然后吸去培养液，每孔加入200“LDMSO， 充分振摇培养板，用酶标仪测定每孔吸光度A伽。 值，细胞增殖率以测试物处理组A√空白对照组 ‰X100％表示。 6．内皮素拮抗试验：B16细胞培养传代，取同一 传代细胞，接种至6孔细胞培养板，接种密度为10野L， 分两组。A组：待细胞贴壁后，吸去培养液，分别用含 0．5ILLg／mL内皮素的新鲜培养基，0．5Ixg／mL内皮素 200p．g／mL内皮素拮抗剂的混和培养液和0．5斗g／mL 内皮素200斗g／mL熊果苷的混和培养液换液，培养 48h后，按前述方法对各组进行酪氨酸酶活性测 定。B组：待细胞贴壁后，吸去培养液，用含0．5Ixg／mL 内皮素的新鲜培养基换液，24h后分别用含0．5Ixg／mL 内皮素的新鲜培养基，200Ixg／mL内皮素拮抗剂的 培养基和200斗g／mL熊果苷的培养基换液，继续培 养24h后按前述方法对各组进行酪氨酸酶活性测 定。空白对照组加入培养液和相应溶媒。 7．统计方法：数据均以孑±s表示，采用单因素 方差分析和配对t检验，统计过程使用SPSSl1．0 统计软件完成。 结 果 1．对鼠B16细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的 影响：结果见表l。甘草黄酮显示有剂量依赖性抑 制黑素生成和抑制酪氨酸酶活性的作用(P< 0．05)，内皮素拮抗剂在实验浓度对培养的B16鼠 黑素瘤细胞黑素合成和酪氨酸酶活性无明显抑制 作用(P>0，05o 2．对鼠B16细胞增殖的影响：用MrrI’比色法 测5种不同浓度内皮素拮抗剂和甘草黄酮对体外培 养B16细胞增殖率的影响，结果见表2。31．25。 500Ixg／mL内皮素拮抗剂对细胞增殖率无明显抑制 作用(P>0．05)。甘草黄酮随测试物浓度的增加，对细 表1内皮素拮抗剂和甘草黄酮对B16鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶活性 和黑素含量的影响(五±s，％) Ixg／mL 注：n=30酪氨酸酶活性和黑素含量以处理组占对照组A值的百分比表示；空白对照组相应值设定 为100％；与对照组相比，’P<0．05，_P0．05o 4．单独加入内皮素0．5斗咖L作用24h，细胞数 量较空白组明显增多(图2)，再加入拮抗剂200斗g／mL 作用24h后，仍能显示酪氨酸酶活性降低(P<0．05， 表3，B组)，说明即使先加入内皮素一段时间后再 加拮抗剂，拮抗剂仍能对抗内皮素对酪氨酸酶活性 的激活作用，使细胞酪氨酸酶活性恢复至空白对照 水平左右。 讨 论 国外㈣报道的天然提取内皮素拮抗剂来自春黄 菊素，而本实验中拮抗剂来自水生生物。通过受体竞 争性抑制作用拮抗ET一1介导的信号传导及酪氨酸 酶活性升高，对UVB照射引起的色素沉着有明显的 抑制作用。从自然成分中分离天然黑素生成调节剂 逐渐引起人们的关注并应用于临床。近年来有研究 万方数据 空堡鏖腿科塞志2Q螋生2旦筮垒2鲞筮2翅￡丛Ⅱ』旦￡型噬Ql，E出氆§理2Q螋，yQ!：垒2，盟Q。2 显示，中药甘草中提取的黄酮类物质对酪氨酸酶活 性有较强抑制作用【7】，可明显抑制黑素生成。本实 验用内皮素拮抗剂系天然水生生物中提取的寡肽， 与天然提取甘草黄酮作比较，研究发现：甘草黄酮 可以直接作用于培养的B16鼠黑素瘤细胞。呈浓度 依赖性抑制其酪氨酸酶活性和黑素生成。浓度超过 125I-Lg／mL呈现细胞毒性，500斗咖L时细胞全部 死亡。内皮素拮抗剂在实验浓度对黑素瘤细胞增殖 无明显抑制作用，与甘草黄酮相比，细胞毒性较小。 实验结果显示：内皮素拮抗剂对体外培养的 B16鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素合成无明显 直接作用，但该内皮素拮抗剂200Ixg,／mL即可拮抗 0．5Ixg／mLET一1对黑素瘤细胞的刺激增殖作用， 48h测定酪氨酸酶活性与空白对照组相比，无明显 变化(P>0．05)，显示具有特异性抑制ET一1对黑素 细胞分化和酪氨酸酶的激活作用，提示拮抗剂可能 取代内皮素与其受体结合，从而阻断受体耦联信号 传导。本实验中，0．5斗咖LET—l作用24h后，再加 入200txg／mL拮抗剂作用24h，酪氨酸酶活性与空 白对照组相比，未见明显升高(P>0．05)，提示拮抗 剂与ET—l受体的结合能力可能比ET—l与其受体 结合能力更强，使内皮素从结合部位解离，切断信号 传导途经，活化的基因失活。传统美白剂熊果苷，能 抑制黑素生成，安全性好LS-9]，临床应用广泛，但在本 实验中对内皮素无明显拮抗作用。内皮素拮抗剂并 非全新产物，在高血压等心血管疾病应用方面历史 悠久，但需要指出的是并非任何一种内皮素拮抗剂 都能抑制黑素细胞的增殖[2】，其原因尚未明确。 通过本实验的研究证实，内皮素拮抗剂与甘草’ 黄酮和熊果苷在抑制黑素生成的作用机制上存在差 异。甘草黄酮可直接抑制黑素细胞增殖及黑素产生， 高浓度有细胞毒性。而内皮素拮抗剂则通过拮抗作 用，抑制由于ET一1增加所促发的黑素细胞增殖及 黑素产生的增多。熊果苷安全性好，但对内皮素无明 显拮抗作用。本实验中的天然提取内皮素拮抗剂对 B16细胞本身无杀伤作用，细胞毒性小，是一种安全 有效的皮肤美白剂，在UV照射或其他原因引起的 由于ET—l增高导致的皮肤色素增加性疾病中，可 能具有应用前景。 参考文献 [1]杨希川，叶庆佾，徐小珂，等．UVB对角质形成细胞表达内皮索 ．1的调节作用．中华皮肤科杂志，2000，33(1)：46．47． [2]江志洁．朱育新．吴奇英，等．黑素形成机理的新概念及复合美 白剂的应用．环球科技，1998，2l(4)：138—140． [3]AndoH，Itoh八MishimaY，eta1．Correlationbetweenthenumber ofmalanosomes，tyrosinasemRNAlevels，andtyrosinaseactivity in culturedmurinemelanomacellsin responsetovarious melanogenesisregulatoryagents．JCellPhysiol，1995，163(3)： 608-614． [4]HaSK,KoketsuM，LeeKeta1．Inhibitionoftyrosinaseactivity byN，N—unsubstitutedselenoureaderivatives．BiolPharmBull， 2005．28(5)：838．840． [5]KimYJ，NoJK,LeeJH，eta1．4,4'-Dihydroxybiphenylasanew potenttyrosinaseinhibitor．BiolPhannBull，2005。28(2)：323— 327． [6]lmokawaG，KobayashiT，MiyagishiM，eta1．Theroleofendo- thelin一1inepidermalhyperpigrnentationandsignalingmechanisms ofmitogenesisandmelanogenesis．PigmentCellRes，1997，10 (4)：218-228． [7]马晶波。黄岚，冯树芳．等．甘草黄酮对黑素细胞生物学作用的 比较．中华皮肤科杂志，2003．36(10)：586—588． [8]SolanoF，BrigantiS，PicardoM，cta1．Hypopigmentingagents： anupdatedreviewOilbiological，chemicalandclinicalaspects． PigmentCellRes，2006，19(6)：550—571． [9]雷铁池，朱文元，夏明玉，等．甘草酸、熊果苷及氢醌对小鼠黑素 瘤细胞黑素生成影响的比较研究．临床皮肤科杂志。2000，29 (2)：69—72． (收稿日期：2008．03-03) (本文编辑：吴晓初) 中华医学会2009年全国皮肤性病学术年会征文通知 为进一步推动学科发展，逐步与国际接轨，中华医学会皮肤性病学分会研究决定，2009年全国学术年会定于2009年6月 1l一14日在天津召开。本次会议属中华医学会一类学术会议，为配合继续医学教育工作，会议仍将举办知识更新讲座，讲座征 文将以自由撰稿和定向约稿形式进行。现将会议征文有关事项通知如下： 一、征文内容：有关皮肤性病的基础研究、临床研究及病例报告。特别欢迎有大课题的博士生导师在某研究领域的成果做中 心发言。 二、征文要求：①本次大会只接受电子投稿：交流的论文提交论文摘要(800—1000字以内)；知识更新讲座：论文摘要、全文 (3500字以内)各一份。②格式及内容要求：文稿顺序为题目、单位、邮编、作者姓名、摘要。摘要内容力求科学性强。数据可靠，重 点突出，文字精炼(请自留底稿)。③凡已在全国性学术会议上或公开发行的刊物上发表过的论文，不予受理。④电子稿件请发送 至：CCDV2009@126．corn 三、截稿日期：2009年3月31日(以当地邮戳为准)。 中华医学会学术会务部、中华医学会皮肤性病学分会 万方数据 内皮素拮抗剂对鼠黑素瘤细胞黑素生成影响的研究 作者： 吴品茹， 陈向东， 徐慧， 汪蓓青， 刘健航， WU Pin-ru， CHEN Xiang-dong， XU Hui ， WANG Bei-qing， LIU Jian-hang 作者单位： 上海市第九人民医院,200011 刊名： 中华皮肤科杂志 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF DERMATOLOGY 年，卷(期)： 2009,42(2) 参考文献(9条) 1.Ha SK;Koketsu M;Lee K Inhibition of tyrosinase activity by N,N-unsubstituted selenourea derivatives[外文期刊] 2005(05) 2.Imokawa G;Kobayashi T;Miyagishi M The role of endothelin-1 in epidermal hyperpigrnentation and signaling mechanisms of mitogenesis and melanogenesis 1997(04) 3.Kim Y J;No JK;Lee JH 4,4'-Dihydroxybiphenyl as a new potent tyrosinase inhibitor[外文期刊] 2005(02) 4.雷铁池;朱文元;夏明玉 甘草酸、熊果苷及氢醌对小鼠黑素瘤细胞黑素生成影响的比较研究[期刊论文]-临床皮肤 科杂志 2000(02) 5.Solano F;Briganti S;Picardo M Hypopigmenting agents:an updated review on biological,chemical and clinical aspects[外文期刊] 2006(06) 6.马晶波;黄岚;冯树芳 甘草黄酮对黑素细胞生物学作用的比较[期刊论文]-中华皮肤科杂志 2003(10) 7.Ando H;Itoh A;Mishima Y Correlation between the number of malanosomes,tyrosinase mRNA levels,and tyrosinase activity in cultured murine melanoma cells in response to various melanogenesis regulatory agents[外文期刊] 1995(03) 8.江志洁;朱育新;吴奇英 黑素形成机理的新概念及复合美白剂的应用 1998(04) 9.杨希川;叶庆佾;徐小珂 UVB对角质形成细胞表达内皮索-1的调节作用[期刊论文]-中华皮肤科杂志 2000(01) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zhpf200902012.aspx