脑出血后血脑屏障损伤的病理生理机制

文章编号: 1002- 0217( 2005) 01- 0072- 03 收稿日期: 2003�12�26 作者简介:孟庆伟,男, 1976年生,硕士,现在山东省济宁市中区人民 医院心内科工作, 272100� 脑出血后血脑屏障损伤的病理生理机制 孟庆伟综述,吴家幂审校 (皖南医学院附属弋矶山医院 � 神经内科,安徽 � 芜湖 � 241001) 关键词:脑出血; 血脑屏障;脑水肿 中图分类号: R 322� 81; R 743�3 文献标识码: A 脑出血( intracerebr al hemorrhage, ICH)是指非外伤性脑 实质出血,其致残率、病死率均较高。脑水肿是脑出血后的 继发性病理生理变化,其中包括脑出血后血脑屏障遭到破坏 产生的血管源性脑水肿,研究脑出血后血脑屏障破坏的病理 生理机制,将有助于对脑出血后血脑屏障的破坏因素进行干 预,减轻脑出血后的继发性损害。 1 � 血脑屏障的结构及功能 血脑屏障( Blood�brain barrier, BBB)是位于脑组织和血 液之间的一个复杂的细胞系统,它由中枢神经系统毛细血管 内皮细胞、毛细血管基底膜、星形胶质细胞终足构成。脑血 管内皮细胞依靠紧密连接构成连续密封的网,是大分子物质 经内皮细胞间转运的屏障。由星形胶质细胞的足突组成的 一层坚韧的胶质膜覆盖了脑毛细血管周围 85% 左右的面 积。星形胶质细胞对于 BBB 的完整性有诱导和维持的作 用。基底膜主要是由�型胶原和纤维蛋白构成,它能起到支 持作用,防止由于静水压和渗透压改变引起的血管变形。在 生理状态下 BBB 严格控制水溶性物质如小分子的电解质进 入脑组织, 而仅有脂溶性的物质才能通过 BBB 弥散入脑组 织。病理情况下 BBB 受到破坏, 血液的成分,包括电解质和 血浆蛋白可经开放的 BBB进入脑组织[ 1, 2]。 2 � BBB与脑出血脑水肿的关系 根据 BBB 是否受到损伤, 脑水肿分为血管源性脑水肿 和细胞毒性脑水肿,前者 BBB 受到损伤,水肿液中 Na+ 、K+ 与血浆较为一致,水分积留部位在细胞间质, 脑细胞形态无 明显变化; 而细胞毒性脑水肿则表现为神经元、毛细血管周 围突起和星形胶质细胞胞体肿胀, 细胞外间隙无扩大, 水肿 液为血浆超滤液,只有水分和 Na+ 。脑出血后, 水肿产生迅 速,在脑出血后 1~ 2 小时即可出现, 进行性加重, 48 小时达 到高峰,持续 4~ 5 d 开始吸收[ 3, 4]。血肿的占位效应引起周 围组织的机械性损伤,溢出血管的血液成分本身引起的化学 毒性反应及渗透压增高、缺血再灌注损伤、BBB 的通透性增 加都是水肿的原因。缺血、炎症及各种化学物质毒性作用等 多种原因引起 BBB 破坏通透性增加, 血管源性脑水肿出现 于血肿周围区,并且血管调节功能紊乱, 脑水肿增加,加重细 胞损伤和死亡[ 4~ 6]。 3 � 脑出血后损伤 BBB 的因素 3. 1� 缺血因素 � 脑出血后, 血肿周围及远隔区产生继发性 缺血。缺血致使缺血区 BBB 损伤, BBB 通透性增加, 而 BBB 的损伤对脑水肿的发生和发展起着重要的作用。Nath 等在 大鼠自体动脉血注入尾状核制作出血模型的研究中发现,血 肿产生后 1 分钟,尾状核及远隔的前额皮质区脑血流下降到 很低水平, 10 分钟后,此区脑血流开始增加。同时也发现缺 血的程度与注入的血量有关。在 3 小时后已没有明显的持 续缺血表现, N ath 认为虽然起始的缺血效应显示短暂性和 自限性,但都可导致持续的脑组织生化和结构改变,从而引 起后发的 BBB 的破坏和脑水肿[ 7]。Yang 等证实, ICH 1 小 时后,出血侧局部脑血流量( rCBF)下降至正常的 50% , 而对 侧区为 73% , 4小时后恢复至正常, 48 小时后出血侧的脑血 流再次下降至 48% , 对侧则无变化[ 8]。Mayer 等对 23 例 ICH 后 18 小时、72 小时患者进行动态观察 CT、SPECT 检查 发现, ICH 后最初几小时周围缺血就很明显, ICH 血肿体积 没有变化,而平均水肿体积增加 36% , 血流量容积平均下降 55% ,且 CT 水肿区多与 SPECT 灌注缺损区正相关, 证明病 变周围缺血是造成脑水肿的重要原因之一[ 9]。 3. 2� 炎症反应与细胞因子 � 近年来研究和动物实验均已 证实脑出血后炎症反应的存在, 且较非出血性脑损伤更加明 显[ 6, 10]。Chao等研究表明在脑出血血肿周围及血肿内部发 生炎症反应,并且有中性粒细胞、巨噬细胞移行至血管外,小 胶质细胞激活[ 11]。且动物实验也证实 ,脑出血后 1~ 7 d,有 大量的多形核白细胞、单核细胞在血肿周围浸润[ 12]。Xue 等研究鼠皮质内脑出血模型时发现, 脑出血后 48 小时中性 粒细胞粘附于血管壁或从毛细血管和小静脉内游出[ 6]。渗 出的中性粒白细胞能够释放各种细胞因子, 如肿瘤坏死因子 ( TNF��)、白细胞介素�6( IL�6)、干扰素( IFN��)及氧自由基 等,破坏 BBB,加重脑水肿和脑损伤; 同时可以阻塞微血管, 引起局灶性缺血。Ott L 等将多种炎性细胞因子注入实验动 物脑组织内,发现炎性细胞因子能增加 BBB的通透性, 引起 脑水肿,减少血肿细胞因子的活力或阻断细胞因子信号系 统,能够减轻脑水肿[ 13]。脑出血后,血肿周围脑组织有多种 细胞因子的表达参与炎症反应, 如 T NF��、IL�1、IL�6 等。 TNF��对毛细血管有直接毒性作用, 导致微小血管痉挛, 增 加毛细血管通透性, 开放血脑屏障, 加重外周白细胞浸润及 脑水肿; Zhu认为 TNF��增强脑内皮细胞中的一氧化氮毒 性,从而增加毛细血管通透性, 导致血管性脑水肿[ 14]。IL� 1�作用于血管内皮细胞使之表达 ICAM�1、选择素 E 等, 从 而介导炎症反应, 增加毛细血管通透性, 使 BBB 开放, 导致 血管性脑水肿。Bolton 等在年轻 ( 3 周)大鼠纹状体注入 IL� 1�, 能引起中性粒细胞趋集相关的 BBB 通透性增加[ 15]。电 镜观察发现,内皮细胞仍保持完整,但紧密连结蛋白、闭锁蛋 白、闭锁小带已丧失。脑出血后血肿周围细胞因子的表达相 互影响,协同加剧 BBB 的损伤。 �72�� � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 皖南医学院学报 2005年第 24卷第 1期 3. 3 � 血肿成分 3. 3. 1 � 凝血酶 � 许多研究表明, 凝血酶和脑水肿的形成过 程直接相关。凝血酶引起脑出血后脑水肿的机制与其细胞 毒性和破坏 BBB 有关。有学者在研究中发现, 脑组织中注 入凝血酶后可以破坏 BBB, 还能够破坏脑细胞[ 4, 16]。Lee等 发现,颅内血肿发生 24 小时后受伤同侧脑组织的 BBB 通透 性明显增高,而对动物注入凝血酶后, 可引起同样的 BBB 破 坏,则提示凝血酶在颅内血肿时对 BBB 的破坏有直接的作 用[ 4]。在 C6胶质瘤的培养液中加入凝血酶 ,应用同位素标 记��氨基异丁酸(��aminoisobatyric acid, AIB)测定 BBB 通透 性,发现凝血酶注入后 24 小时 BBB 的通透性明显增加[ 16]。 2000年, Bartha等应用 RT�PCR 技术发现大鼠毛细血管内 皮细胞存在凝血酶受体�蛋白酶激活受体( protease�activated r eceptor, PAR) ,包括 PAR�1 和 PAR�3 两种受体。有试验表 明,将人脑毛细血管内皮细胞进行体外培养, 在培养液中加 入凝血酶后, 观察到内皮细胞发生收缩, 体积变小, 呈三角 形,细胞间隙增大, 收缩的程度呈剂量依赖性,去除凝血酶后 30 分钟 细胞形态恢复正常。凝血酶可能通过激活凝血酶受 体使毛细血管内皮细胞发生收缩, 细胞间隙增大, 紧密连接 开放, 从而 BBB 的通透性增加[ 17]。且超微结构研究表明, 凝血酶以剂量依赖方式增加毛细血管内皮细胞的通透性, 可 使脑血管内皮细胞产生明显的形态学改变。此外,凝血酶可 引起炎症反应造成对 BBB的间接损害。 3. 3. 2 � 血小板和白细胞 � 脑出血后血液溢出血管外, 血肿 成分中的血小板和白细胞释放多种生物活性物质, 诸如 T NF��、白三烯( LT3)、白细胞介素( ILS)等, 破坏 BBB, 能促 进和加重脑水肿的发生和发展。血小板释放的 5�羟色胺和 血小板来源的生长因子,能破坏 BBB,增加血管通透性, 导致 血管收缩[ 6]。 3. 3. 3 � 红细胞 � 红细胞在迟发性脑水肿形成中起着重要的 作用。Xi等将红细胞或溶解红细胞注入大鼠基底节, 结果 注入溶解红细胞后 24 小时时使 BBB 通透性明显增加, 并出 现明显的血管源性脑水肿;而注入完整红细胞后第 3天才出 现明显的 BBB 通透性增加, 且对脑血流无明显影响[ 18, 19]。 由此可见, 红细胞溶解引起 BBB 通透性明显增加在迟发性 脑水肿中起着重要的作用,红细胞的溶解与补体系统激活有 关,补体系统激活后形成膜攻击复合体从而导致红细胞溶解 和炎症反应,引起脑水肿[ 20]。 3. 3. 4 � 基质金属蛋白酶 � 基质金属蛋白酶( matrix metallo� proteinases, MMPs)是一组降解细胞外基质的锌依赖酶, 存在 正常人体内,参与多种病理生理过程, 包括血管再生、肿瘤浸 润及转移、炎症反应等。其中 MMP�2、MMP�9 的细胞外基 质底物包括�型、�型胶原、纤维连结蛋白、弹性蛋白和变性 的基质胶原。1997 年, Rosenberg 应用胶原酶注入基底节制 作的脑出血模型中发现,脑出血后水肿在 24 小时达到高峰, 且应用酶谱分析法测得此时的 MMP�9 表达最强, 由于细胞 外基质的降解,细胞基底膜的完整性遭到破坏, 使 BBB 的通 透性增加, 促进和加重脑水肿, 于脑出血后 6 小时应用合成 的基质金属蛋白酶抑制剂 BB�1101 后显著减轻脑水肿[ 21]。 3. 3. 5 � 氧自由基 � 有研究发现: 脑出血后脂质过氧化物 ( LPO)在 4 小时升高, 而 BBB 改变和脑含水量增加则在 12 小时,随着 LPO 继续升高, BBB的通透性增加和脑含水量也 增加。于 3 d 后 LPO下降, BBB 的 通透性和含水量也开始 下降。说明脑出血后自由基反应增强, 导致 BBB 损害, 产生 脑水肿。Imaizumi等研究认为, 引起 BBB 通透性改变的羟 自由基,是产生脑出血后脑水肿的重要原因[ 22]。氧自由基 可通过激活磷质酶等多种途径影响 BBB 的通透性。 3. 4� 补体对 BBB 的影响 � 动物实验中发现: 自体动脉血注 入基底节后 24小时, 血肿周围补体 C9、C3d等升高, 其中 C9 含量增加 6 倍,最为明显; 于 72 小时后达高峰, 与脑水肿高 峰一致,同时发现 Clusterin(机体产生的膜攻击复合物抑制 剂)在同侧基底节的含量也比正常增加了 2 倍, 而在注入的 自体血中加入补体激活抑制剂 N�acety lhepar in 能明显减轻 脑水肿的形成[ 20]。脑出血后 C9 及 Cluster in 大量增加都支 持补体系统的激活和膜攻击复合物的形成。膜攻击复合物 不但能插入红细胞膜形成孔洞, 最终导致红细胞溶解和血红 蛋白的释放,也能插入神经细胞膜引起神经元坏死,并可通 过损害内皮细胞导致 BBB 渗漏。补体激活抑制剂对脑出血 后脑水肿形成的阻滞作用, 也进一步证明了补体激活是脑出 血后脑水肿形成的一个主要因素。 综上所述, BBB 作为机体维持中枢神经系统内环境稳 定的结构基础,在脑出血后脑水肿的形成和发展过程中占有 重要地位。BBB 的破坏是多种因素作用的结果。保护 BBB、 保持其完整性必将减轻脑出血后脑水肿的程度。且在试验 阶段已经发现有多种减轻破坏 BBB 完整性的因素, 从而减 轻了 BBB的通透性、减轻了脑水肿的程度。对于脑出血后 BBB 的研究, 将有助于深入探讨脑出血的病理生理过程, 从 而为优化临床治疗提供理论依据。对脑出血后脑水肿 的治疗产生重要的临床意义。 参考文献: [ 1] � Kimelberg HK. 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J Neurosci Let t , 2000, 283: 230- 232. �73�皖南医学院学报 2005年第 24卷第 1期 � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 文章编号: 1002- 0217( 2005) 01- 0074- 03 收稿日期: 2004�03�22 作者简介:张 � 越,男, 1972年生, 2002级硕士研究生;梅善宗,男,副 教授,硕士生导师 � 微量口腔粘膜脱落细胞检材 STR位点的法医学检测分型 张 � 越综述, 梅善宗审校 (皖南医学院 � 法医系, 安徽 � 芜湖 � 241001) 关键词:生物学检材; 口腔粘膜;脱落细胞; DNA ;短串联重复 序列;法医学 中图分类号: R 394� 2; R 89 文献标识码: A 微量生物性检材的 DNA 多态性检测分型是法医物证学 研究热点和难点。随着 STR�PCR技术出现, 除了血痕、混合 斑等微量检材,指纹、汗渍、头屑等特殊极微量生物性检材已 经进入法医学科研应用领域。口腔粘膜脱落细胞多为有核 的鳞状上皮细胞,含有完整的二倍体的核 DNA 基因组,利用 该类细胞检测其 DNA 进行法医学个体识别, 是目前国内外 开展的一项新技术[ 1~ 6]。 1 � STR位点概述 短串联重复序列( short tandem repeat, STR)是可变串联 重复序列的一种类型, STR的重复序列单位多为2~ 6 bp,多 态片段长度 400 bp 以下。人类基因组 DNA 中 STR位点含 量丰富,估计有 20 万~ 40 万个, 每隔 6 ~ 10 kbp 就出现一 个,其中约有一半具有遗传多态性。STR 基因座遗传一般 遵循 Mendel遗传规律, 呈等位共显性遗传, 部分 STR 位点 存在基因连锁遗传。在群体遗传中, STR 位点多态性一般 符合 Hardy�Weinberg 平衡定律。STR位点以其基因组内基 因座多、多态片段短、等位基因多态性好等特点,在各种生物 性检材中, 只要保存了靶 DNA 片段 , STR 位点就可能扩增 成功。STR�PCR分型技术有 DNA 指纹技术无法替代的优 越性, 以其快捷、高效、和检材要求相对不高等特点, 逐步成 为第二代 DNA 多态性分型技术的核心, 成为司法鉴定实验 室微量生物性检材 DNA 多态性检测方法[ 1]。多位点复合扩 增技术提高了 STR 的效率和精度, 16 位点 STR复合扩增 技术的个人识别的分辨力可以达到 1 � 10- 17水平, 可以获得 个体特异的 DNA指纹图。荧光定量 PCR( FQ�PCR)技术等 的出现, 可以把对微量生物性检材定量分析提升到确定 DNA 基因组拷贝数水平。STR 分型与荧光技术、毛细电泳 技术的结合,扩展了 STR 的适用范围, 提高了 ST R 分型的 效率和个人识别率, STR 分型已成为个人识别的金标准 [ 3]。 2 � 口腔粘膜上皮及脱落细胞检材 人类口腔粘膜的组织学结构为上皮层和固有层两层, 无 粘膜肌层。口腔粘膜的上皮为复层鳞状上皮, 具有代谢旺 盛、更新快、易脱落的特点。它由多层细胞组成, 基底层具有 旺盛分裂能力, 最表层的角化层已衰老退化, 不断脱落。角 化层细胞可以自然脱落到唾液中, 也在外力作用下剥落到载 体上。这些脱落口腔细胞虽然细胞核固缩, 但同样具有完整 人类的基因组 DNA序列, 与其他(如 :血液中的白细胞、肝脏 细胞等)组织细胞一致含有相同的高度多态性 STR 位点, 从 而成为法医学 DNA多态性检测分型的生物性检材。各类口 腔上皮脱落细胞检材所含的细胞量较少 , DNA 的含量常为 [ 11] Chao Gong, Julian T, Hof f and Richard FK. 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