哺乳动物体细胞克隆技术研究现状及其存在的问题

11 哺乳动物体细胞克隆技术研究现状及其存在的问题 马志杰1 (生命科学与技术学院遗传育种与繁殖专业 四川成都 610041) 摘要 哺乳动物体细胞克隆技术的成功是生物高新技术的重大突破 具有划时代里程碑的 作用 本文介绍了哺乳动物体细胞克隆技术的基本环节 关键技术及研究现状 并就其意义 和存在的问题作了概述 然后 对其发展前景作了展望 关键字: 哺乳动物 体细胞 重组胚胎 克隆 1997年 2月英国 Rosolin研究所的科学家 Wilmut等人宣布了克隆羊 多莉 的诞生 [1] 它是迄今世界上科学家首次用高度分化的体细胞即乳腺上皮细胞为核供体进行核移植 培养出来的哺乳动物 相对于之前的动物克隆技术而言 哺乳动物体细胞克隆是一次质的飞 跃 自 多莉 诞生以后 体细胞克隆技术发展迅速 经过5年多的时间 此项技术得到了 较大的改进 并获得了重要的理论成果与实际应用 然而 体细胞克隆技术还存在理论与技 术上的缺陷与不足 1 克隆的概念及体细胞核移植 克隆 (clone)一词源于希腊语 其含义是无性繁殖 即由一个祖先细胞分裂繁殖产 生的纯细胞系 在这个细胞系中 每个细胞的基因彼此相同 哺乳动物克隆又称核移植技术 是通过特殊的人工手段 显微操作 电融合等 对哺乳动物特定发育阶段的核供体 胚胎细 胞或体细胞 及相应的核受体 去核的原核胚或成熟的卵母细胞 进行体外重构 体外培养 胚胎移植 从而产生动物个体的过程 通过核移植产生的动物其遗传结构与细胞核供体完全 相同 在核移植过程中 所用的供体细胞若为体细胞 则称为体细胞核移植[2] 2 哺乳动物体细胞克隆技术的主要环节及其研究现状 哺乳动物体细胞克隆技术主要包括以下 5个主要环节 (1) 供体核的准备; (2) 受体细 胞质的选取; (3) 核质重组融合 激活技术; (4) 重组胚的体内或体外培养; (5) 重组胚胎的 移植 2.1供体核的准备 最早人们用青蛙肠粘膜上皮细胞的核作为供体核获得后代 Wilmut 等人以乳腺上皮细 胞为核供体在特定的实验条件下获得了克隆绵羊 多莉 实验明 在哺乳动物体细胞克 隆中 并非一切体细胞都可作为供核细胞进行核移植 胎儿成纤维细胞因在克隆前能进行基 因修饰 故目前大多数家畜的克隆都以它为供核细胞[3] 另外 输卵管及子宫上皮细胞 卵 丘细胞 颗粒细胞 耳细胞等也可作为供核细胞 一般研究认为 诱导处于不同分化期的细 胞进入静止期是体细胞克隆成功的关键之一 Campbell(1996)[4]认为 处于休眠期的体细 胞核在克隆中才能发育 并首次采用血清饥饿法使供核细胞同期化在 Go 期 结果提高了体 细胞克隆的成功率 也有科学家对此提出质疑 Cibelli 等(1998)[5]根据其克隆牛的经验指 出 饥饿过程并不是一个必要的过程 Boquest等(1999)[6]证明 在处于活跃分裂期的仔猪 胎儿成纤维细胞培养物中 有一小部分细胞处于静止期 Kubota等(2000)[7]的实验表明 1本文作者 马志杰 收稿日期 20030606 12 血清饥饿培养对核移植胚胎融合率 卵裂率及囊胚率的影响不显著 但对重组胚胎的妊娠成 功率有较大的影响 也就是说 饥饿法处理有助于重组胚胎后期的发育 因此 在当前体细 胞克隆成活率低的情况下 选用 血清饥饿法 处理供核细胞 以期获得较高的成功率 仍 是明智之举[8] 2.2受体细胞质的选取 研究人员早期曾以受精卵或去核 2-细胞胚作为受体卵 Willadsen等(1986)[9]的绵羊胚 胎细胞核移植试验说明 成熟卵母细胞比受精卵或 2-细胞胚更适合于用作核移植的受体细 胞质 它能使各个发育时期胚胎甚至体细胞核的重构胚胎恢复到受精卵的状态 重新编序 正常发育直到出生 近年来通常以第二次减数分裂中期卵母细胞取代原核受体 解决核受体 问题 1999 年 美国 Wisconsin-Madison大学研究人员采用绵羊 猪 猴 或大鼠的皮 肤成纤维细胞作为供核体细胞 移植到去核牛卵母细胞中获得成功[10] 卵母细胞采集后在 培养液中培养成熟至第一极体排出 进行去核处理 一般去核的方法有盲吸法 半卵法和功 能性去核法 以往很多人采用盲吸法 此法常吸去过多的受体细胞的细胞质且去核成功率只 有 60%左右 效果不佳 现在普遍采用事先给其 DNA染色的方法 去核效果可达 90%以 上 具体步骤是 事先在 HSOF 一类的培养液中 加 10%胎牛血清 (FBS) 5ìg/mlHoechst33342和 7.5ìg/ml 细胞松弛素 B 制成染色剂 将待去核卵母细胞放置在 染色液中培养 10-20 分钟 在 DNA被染色后 吸到玻璃管中的细胞核可以在紫外光下透 过管壁观察到[8] 因此 熟练的工作人员可使去核效率大大提高 丹麦的 Vajta等(2001)[11] 发明了一种新的核移植方法 基本过程为 培养的卵母细胞至成熟 涡旋去掉卵丘细胞 于 0.5%的链蛋白酶中培养 5 分钟去除卵细胞的透明带 用显微分割刀将卵母细胞平均分成两 半 紫外光下挑选不含染色体的胞质体 继续培养 2-3小时,再先后与一个细胞核供体 体 细胞 和另一个不含染色体的胞质体进行融合 形成双胞质体-体细胞三联体的重组胚胎 这一方法大大提高了卵母细胞的去核率 简化了预备工作 且实验技术要求低 预计在体细 胞核移植中将会被广泛采用 在体细胞核移植过程中 去掉卵母细胞的细胞核是核移植胚胎 发育的先决条件之一 故应尽可能地去掉卵母细胞的核 否则 发育成的胚胎染色体倍性不 对 或者两个细胞核相互干扰 影响其正常发育[8] 2.3核质重组融合 激活技术 研究人员早期主要以卵周隙注射法进行核质重组 方法是用注射针吸取供核细胞 沿去 核时的切口将供核细胞注入卵母细胞的卵周隙中 如 Onishi等(2000)用此法获得克隆猪 由于在核质重组过程中微吸管容易损坏卵膜及一部分细胞质 成功率偏低 需对重组胚融合 早前采用仙台病毒法激活核质 由于技术要求较高 已较少采用 随后多采用电融合法 将 重组胚胎置于融合小室内 使核-质集结面与电极相平行 在一定的电场强度下 施以一定 时间的矩型直流电脉冲促使其融合 近年来 人们普遍采用商业公司销售的激活剂 如离子 素 6-DMAP 钙离子载体 A23187 和钙离子酶素等或单独或混合使用进行化学激活 也 有人仍使用电脉冲激活 效果均令人满意[8, 12] 2.4重组胚的体内或体外培养 重组胚胎激活后 有体内和体外两种培养方式 体内培养是将激活的重组胚胎植入同种 或异种动物的输卵管中 经数天后检测发育正常的囊胚或桑堪胚 然后进行胚胎移植 体外 培养是将激活后的重组胚在培养液中培养至囊胚 再挑选优质的胚胎移入到同步发情的同种 雌性动物的输卵管中[12] Onishi(2000)在猪克隆胚的研究中表明 培养基的类型对胚胎的 发育有影响 并且 培养方式不同 胚胎的发育也有差异 因此 在使用先融合后激活(FBA) 13 的方式生产核移植胚胎的过程中 成熟的卵母细胞 去核卵母细胞和重构胚胎均应保持在 HSOF或以 HSOF为基质的培养液中,以期取得较高的成功率 2.5重组胚胎的移植 体细胞克隆胚胎的移植与正常的体外受精胚胎的移植没有太大差别[8] 在早期的研究 中 为了提高胚胎的发育成功率 Campbell等(1996)[4]采取了体内培养技术 后来的研究 发现 该方法不仅成本高 而且并无多大的优越性 Wells 等人[13]经过技术改良 发现体 外培养的核移植胚胎的囊胚率可达到正常的体外受精胚胎的水平 目前 重组胚移植到经同 期化处理的受体母畜中的程序 与常规胚胎移植相同 羊的胚胎移植采用手术法 牛的胚胎 移植采用非手术法 3 哺乳动物体细胞克隆的意义 哺乳动物体细胞克隆技术实现了动物克隆史上的重大技术突破 极大地推动了克隆技术 的发展 表现为理论价值与实际应用价值两个方面 3.1理论价值 在 多莉 诞生之前 学术界一致认为 分化了的细胞不具备全能性 胚胎各部分细胞 朝不同方向分化的过程是严格按照一定时空顺序有规律地进行的 是不可逆转的过程 即不 能由已分化了的细胞核倒逆到原来没有分化的状态 也就是所谓的细胞分化的不可逆性 然 而 多莉 的诞生确立了新的理论体系 分化了的细胞的细胞核并没有在结构上发生不可 逆的变化 一旦条件合适 便可从头开始驱动胚胎发育的整个进程 即具全能性[14] 可以 认为正是体细胞克隆技术的这一巨大突破 不仅使其迅速成为胚胎学 发育生物学 细胞生 物学 遗传学 分子生物学及生物工程学的重要研究方法之一 而且更重要的是 确立了新 的科学理论 为体细胞克隆技术的迅速发展和广泛应用提供了理论基础 3.2实际应用价值 哺乳动物体细胞克隆技术的发展 使处于徘徊阶段的胚胎细胞核移植技术迈上了一个新 台阶 具有一定的实际应用价值 第一 通过体细胞克隆技术可提高转基因动物的效率 并 且可以通过建立转基因体细胞系的方式培育出转基因动物 如在 1998年 5月 美国科学家 Cibelli 等利用牛胎儿成纤维细胞克隆出了携带转基因的 3头牛 第二 利用高效表达的转 基因动物克隆生产珍贵的医用蛋白 如英国PPL公司就曾培育出带有人基因的绵羊 能生产 AAT 蛋白 可用于囊性纤维变性疾病的治疗 第三 动物克隆有利于集约化生产 在相同 的管理和营养条件下 充分发挥动物的生产潜力 加快优良品种的繁育 以满足人们对畜产 品的需求 第四 体细胞克隆技术与 ES 细胞培养 MOET育种等现代生物技术结合 能 迅速提高优良基因及其组合在群体中的频率 扩大优良母畜的遗传贡献 从而加快育种进程 提高育种效率 第五 挽救珍稀动物 保护珍贵的遗传资源 如在 2001 年 Nature Biotechnology上报道了异种体细胞克隆濒危哺乳动物 欧洲盘羊的成功 为濒危动物的保 护提供了重要的借鉴[15] 第六 体细胞克隆技术与 ES 技术结合 也可为人类遗传疾病的 研究提供动物模型 第七 利用体细胞克隆技术可为科学实验提供遗传上完全相同的动物 从而减小因个体之间遗传背景的差异而导致的系统误差 第八 通过 基因敲除 (Gene Knock-out)技术打掉猪细胞体内的 GT 基因 借助于体细胞克隆技术 可使猪为人类再生 组织器官成为可能[16] 第九 利用体细胞克隆技术 克隆哺乳动物某些特定发育阶段的胎 儿 对人类某些顽症如帕金森氏症病实施细胞治疗 是 治疗型克隆 的广阔前景 14 4 哺乳动物体细胞克隆技术存在的问题 随着哺乳动物体细胞克隆技术的发展 利用该技术克隆出的山羊 猪 猫 兔等在最近 几年相继诞生 与此同时 体细胞克隆技术也被广泛应用于医学等领域 尽管如此 哺乳动 物体细胞克隆技术仍有待于完善 笔者认为 主要存在以下几个方面的问题 4.1缺乏基础理论支撑 哺乳动物体细胞克隆技术是一项系统工程 需要由分子遗传学 发育生物学 细胞学等 相关基础学科提供可靠的理论指导与技术支持 否则 提高体细胞克隆的成功率如建空中楼 阁 迄今为止 人们虽然在克隆技术的研究上积累了一定的经验 但有一些基本问题亟需解 决 例如 对核质融合后成熟促进因子 MPF 核膜破裂 NEBD 和早熟染色体凝集 PCC 在基因组重构过程中的作用机制尚不清楚 另外 动物克隆中的种属及细胞间差异的原因 核供体和卵细胞的选材 核质比的选择 重组胚胎的激活方式等仍有待探讨 这一系列问题 需要细胞学 分子生物学 分子遗传学 发育生物学等多种学科的紧密结合才能解决 之所 以当前体细胞克隆成功率低 其部分原因也许是缺乏相关的基础学科在理论方面的支撑 与 体细胞克隆相关的基础学科的研究与发展 在一定程度上决定了该技术的进一步发展与完 善 4.2体细胞克隆技术的程序不够完善 为了提高哺乳动物体细胞克隆的成功率 研究人员在以往研究的基础上作了较大的技术 调整 例如 用血清饥饿法诱导处于不同分裂周期的体细胞进入 Go 期[4] 用第二次减数分 裂中期的卵母细胞取代原核期受精卵作为核受体 解决核受体问题 用电融合法或直接注射 法代替病毒融合 获得更高的融合率[17] 用较完善的体外培养系统免除中间受体培养过程 等等[18] 然而 体细胞克隆技术存在技术上的缺陷 主要表现在克隆的动物胚胎成活率低 在妊娠的前三分之一阶段大量死亡 这种情况在不同动物之间极为相似[8] Wilmut 1997 [1] 采用乳腺上皮细胞 胎儿成纤维细胞体内培养 胎儿成纤维细胞体外培养克隆绵羊 胚 胎成活率(至分娩)分别为 3.4% 5.9% 16.6% 目前还不甚明了胚胎早期死亡的原因 也许与供体细胞培养体系中缺少某种因子造成细胞核不能完整地重构发育过程有关 也许与 受体细胞的去核技术有关 也有可能是胚胎的体内或体外培养系统有缺陷 或者是兼而有之 造成胚胎 胎儿或胎盘发育过程某一阶段中基因表达模式不正常 引起妊娠失败 有人认为 尿囊液过多是造成胚胎早期死亡的原因[13] 但造成胚胎成活率低的原因 目前尚不清楚 然而 胚胎成活率低至少反映了一个问题 体细胞克隆技术的程序仍不够完善 在提高体细 胞核移植胚胎的成活率问题上 掌握体细胞克隆技术各环节的来龙去脉 完善其技术显 得日益重要 5 哺乳动物体细胞克隆技术的应用前景展望 哺乳动物体细胞克隆技术仍处于发展阶段 在一定程度上存在技术缺陷 需要不断地改 进 但就其发展前景而言 十分广阔 首先 体细胞克隆技术可被广泛的运用于畜牧业生产 提高畜禽个体的生产性能并加速优良品种的繁育 第二 由于某些濒危物种的个体数量少而 无法保证大量克隆的需要 所以异种体细胞克隆技术将作为挽救濒危物种的主要手段在今后 被利用 另外 哺乳动物体细胞克隆技术在医学领域中具有更为广阔的应用前景[16] 1 将体细胞克隆与转基因技术相结合 开发出各种转基因动物及产品为人类服务 2 基因 打靶方法与体细胞克隆技术相结合 生产人体的内脏器官 用于人体内衰老或发生病变的器 官移植 这些工作将成为今后生物学家对体细胞克隆技术研究的热点 有人利用 克隆人 15 可能引发的伦理 道德等问题对体细胞克隆技术进行无端的阻挠与抨击 那是很片面的认识 体细胞克隆技术作为一项生物高新技术 能否朝着良性方向发展关键在于人们能否正确而合 理的应用它 或者说 克隆人 可能引发的一些伦理 道德等问题与体细胞克隆技术本身 无必然的联系 而与人们利用该技术的动机有关 所以 我们不能只凭此消极影响来否定它 的应用价值 应该对它有一个正确的认识 一方面 应加快该技术的研究 实现更广泛的应 用价值 另一方面 呼吁各国政府立法禁止克隆人实验或制定国际公约禁止克隆人 使哺乳 动物体细胞克隆技术在有关的法律范围内朝着理性方向发展 造福于人类 可以预言 体细 胞克隆技术将会在新的世纪不断完善并得到更为广泛的应用 参考资料 1. 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