福林酚法福林酚法
Folin酚法测定蛋白酶活力
(2009-06-16 18:03:47)
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标签: 分类: 专业学习
生物
蛋白酶活力测定
folin酚法
原理
杂谈
一、原理
采用福林-酚试剂法。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物),由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等),可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物,在一定pH值和温度条件下,同酶液反应,经一段时间后终止酶促反应,经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上...
福林酚法
Folin酚法测定蛋白酶活力
(2009-06-16 18:03:47)
转载
标签: 分类: 专业学习
生物
蛋白酶活力测定
folin酚法
原理
杂谈
一、原理
采用福林-酚试剂法。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物),由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等),可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物,在一定pH值和温度条件下,同酶液反应,经一段时间后终止酶促反应,经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液,用Na2CO3碱化,再加入福林-酚试剂显色,蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定,从而计算出蛋白酶的活力。 二、 试剂
1) 福林-酚试剂
向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(NaWO•2HO)、25g钼酸钠及700mL222
的去离子水,再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL,充分混合后,接上回流冷凝管,以小火回流10h,结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴液溴,再继续沸腾15min,以驱除过量的溴,冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色,需再重复滴加溴水的步骤),加去离子水定容至1000mL,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中,贮于冰箱中可长期保存备用。此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。
2) 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液
精确称取TCA65.4g,加去离子水定容至1000mL。
3) 0.4mo1/L碳酸钠溶液
精确称取无水碳酸钠42.4g,加去离于水溶解后,定容至1000mL。
4) pH值3,6醋酸缓冲液
精确取NaAc•3HO16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合,用去离子水稀释定2
容至1000mL。
5) 2%酪蛋白底物缓冲液
a) 测试酸性蛋白酶缓冲液
精确称取酪蛋白20g,加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制),在水浴中加热溶解,然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。当日配用或置于冰箱中保存。
b) 测试中性蛋白酶缓冲液
精确称取酪蛋白20g,置于1000mL三角瓶中,加入0.2mol/L Na2HPO4溶液(去离子水配制)610mL,在沸水浴中搅拌使其溶解,冷却后过滤,加入0.2mol/L Na2HPO4
溶液(去离子水配制)390mL,用去离子水定容至1000mL,即成pH7.0、2%酪蛋白溶液。当天配用或置于冰箱中保存。
6) 100μg/mL酪氨酸溶液
精确称取100mg酪氨酸,逐步加入0.lmol/L盐酸溶解后,用去离于水定容至100mL放入冰箱中保存,临用时用去离子水稀释10倍。
三、操作步骤
1. 酪氨酸
曲线的绘制
取18支试管分成6组(每组3支,平行样),编号,按
1分别加入标准酪氨酸、去离子水、0.4mol/L的碳酸钠和福林-酚试剂,混匀后,放入40?水浴保温20min,然后在721型分光光度计上进行比色测定(波长660nm),以浓度为0μg/mL酪氨酸溶液做空白对照。
管号 标准酪氨酸 去离子水 Na2CO3 福林一酚试剂 酪氨酸含量
(100μg/mL) (mL) (mL) (mL) (μg/mL) 1 0 1.0 5 1 0 2 0.2 0.8 5 1 20 3 0.4 0.6 5 1 40 4 0.6 0.4 5 1 60 5 0.8 0.2 5 1 80 6 1.0 0 5 1 100
2. 样品酶活的测定
酶液适当稀释。取4支试管编号(1号为空白对照),分别加入酶液1mL,1号管立即加入0.4mol/L TCA溶液2mL,使酶失活,另3支样品加入lmL pH 7.0、浓度为2%酪蛋白底物缓冲液(如测酸性蛋白酶活力加pH3.6、2%酪蛋白底物缓冲液),迅速混匀,并立即放入40?恒温水浴准确计时,保温10min后,立即加入0.4mol/LTCA溶液2mL,终止反应,同时向1号空白管中加入1mL2%酪蛋白底物缓冲液,摇匀,继续置于水浴中保温20min,取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物,然后取各试管滤液1mL,分别移入另4支试管中,再加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL和己稀释的福林-酚试剂1mL,摇匀,保温显色20min后,进行比色测定(波长660nm)。对照标准曲线,计算酪氨酸含量。
四、蛋白酶活力计算
蛋白酶活性定义:在一定pH值(pH3.6或7.0)和40?温度条件下,每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。
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