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猪前体脂肪细胞的原代培养农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2005,13 (5):649~653 *基金项目：国家自然科学基金项目(No.30471239)资助。屈长青:男，1972年生，博士研究生。 **通讯作者。Authorforcorrespondence.Tel：029-87092430E-mail:. 收稿日期：2004-08-26 接受日期：2004-11-09 ·研究论文· 猪前体脂肪细胞的原代培养* 屈长青张国华陈粉粉赵丽丽杨公社** (西北农林科技大学动...

农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology 2005,13 (5):649~653 *基金项目：国家自然科学基金项目(No.30471239)资助。屈长青:男，1972年生，博士研究生。 **通讯作者。Authorforcorrespondence.Tel：029-87092430E-mail:. 收稿日期：2004-08-26 接受日期：2004-11-09 ·研究

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· 猪前体脂肪细胞的原代培养* 屈长青张国华陈粉粉赵丽丽杨公社** (西北农林科技大学动物脂肪沉积与肌肉发育实验室，杨凌712100) 摘要:建立猪前体脂肪细胞原代培养

方法

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,研究猪脂肪组织增生的生物学特征。选用出生7d的仔猪脂肪组织,采用原代消化细胞培养法培养出棱形细胞，该细胞成分均一、生长旺盛和充脂率高。经形态学动态变化观察、MTT比色法、生长曲线及油红O染色提取法测定,

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是功能活跃的前体脂肪细胞,并在体外重现了其增殖的全过程。关键词:猪;前体脂肪细胞;细胞培养;脂肪组织 PrimaryCultureofPorcinePreadipocyte QUChang-Qing ZHANGGuo-Hua CHENFen-Fen ZHAOLi-LiYANGGong-She** (LaboratoryofAnimalFatDepositionandMuscleDevelopment, NorthwestSci-techUniversityofAgricultureandForestry,Yangling712100,China) Aprimaryporcinepreadipocyteculturemethodforunderstandingthepropertiesofhyperplasiaofpigadiposetissue wasestablished.The7-dayoldcrossbredpigwaspurchasedandadiposetissuewasremovedwithsterileinstrumentsfromthedorsal neck,shoulderandbackregions.Usingprimarycellculturemethod,isolatedpreadipocytewerecultured.Thecellswerehighlyhomo- geneousandproliferative,andhadahighdifferentiationrate.Theirdynamicmorphologicalchanges,MTT,growthcurveandextract- ingstainedintracytoplasmiclipidwithoilredO,allverifiedtheirpreadipocyteidentity.Undercontrolledconditions,thepreadipocytes replayedtheirhyperplasiaprocessinvitro.Inyoungpigadiposetissue,therewerepreadipocytesthatcoulddifferentiateintomature adipocytes. porcine;preadipocyte;cellculture;adiposetissue 早在20世纪60年代初，国外即有人开始从事脂肪细胞培养的实验工作。前体脂肪细胞的体外培养不仅能完整地认识脂肪组织发生和增生的全过程，并且可以直接观察各种因素对这个过程的调控。目前，已建立起人(王竹晨等，2001)和牛(Asoetal., 1995，夏成等，2004)前体脂肪细胞原代培养模型，但尚未有研究猪前体脂肪细胞培养体系的报道。猪具有肥胖的自然属性，是肥胖程度最高的肉用家畜，尤其是我国地方品种猪的主要缺点是沉积脂肪能力强，瘦肉率平均只在 40%左右，严重影响其经济价值和肉用品质。因此，摸索建立猪前体脂肪细胞培养体系，研究其脂肪沉积与组织发育机理，具有重要的理论与实践意义。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 脂肪组织采自本校试验农场种猪场 7日龄杂种(!杜洛克!"长白)仔猪颈部、肩胛及背部皮下。 1.1.2 试剂 DMEM培养基和!型胶原酶购自 Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；牛血清白蛋白购自Amersco公司；其它试剂均为分析纯，购自西安试剂厂；培养瓶购自Korning公司。 1.1.3 培养基及主要试剂的配制完全培养基：按说明取 DMEM培养粉 5g，NaHCO31.83g，HEPES 1.2g，加入胎牛血清使其体积分数为 10%，四蒸水农业生物技术学报 2005年定容至500mL。消化液：!型胶原酶100mg，牛血清白蛋白 1.0g溶于 100mL的磷酸缓冲盐溶液 (PBS)中。红细胞裂解液：1.7117gNH4Cl，充分溶解于100mL的PBS中。上述溶液均经调整pH值至 7.2!7.4，0.22"m微孔滤膜正压过滤除菌,分装后置"20#保存。MTT(四唑盐)溶液：250mgMTT，放小烧杯中，加50mLPBS(0.01mol/L，pH=7.4)在电磁搅拌机上搅拌30min，用0.22"m的微孔滤器除菌，分装，4$保存。油红O工作液：4.2g油红O溶于1 200mL异丙醇中，室温静置过夜,分析滤纸过滤后收集滤液，并加入900mL三蒸水，于4%再次静置过夜后过滤2次即可于室温贮存备用。 1.1.4 仪器 CO2培养箱，倒置显微镜，酶联免疫检测仪，紫外分光光度计等。 1.2 方法 1.2.1 猪前体脂肪细胞的原代培养无菌状态下取仔猪颈部、肩胛及背部皮下脂肪组织，用含高浓度青霉素(300U/mL)+链霉素(300ng/mL)的PBS缓冲液浸泡、冲洗2次。用眼科剪和镊子去除脂肪组织块

表

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面可见的血管与肌肉，最后剪成1mm3大小的碎块。用胶原酶在37&水浴振荡锅中消化1h；消化结束后用等体积的完全培养液中和消化液，消化物一次通过孔径为100和25"m的尼龙筛，收取过滤液，离心10min(2000r/min)。弃上清液，加入红细胞裂解液，吹打均匀，室温静置10min。离心5min(2 000r/min)，弃上清液；再用完全培养液重悬细胞，再离心洗1’2次。然后，将消化分离出的细胞稀释，吹打均匀，以1!105个/cm2密度种于六孔培养板中。置于培养箱(37(，饱和湿度，5%CO2)培养，24h后换液，以除去未贴壁的细胞，之后每2)3天换1次液。 1.2.2 MTT比色法检测将细胞悬液按每孔 103*104个细胞接种于96孔培养板中(0天)，每孔容积200"L，培养板移入CO2培养箱中，37+、5% CO2及饱和湿度下培养，自第1天起，每隔2d，在同一时间取8孔，在每孔中加20"LMTT溶液，37 ,继续培养4h后终止培养，吸去孔内溶液，每孔再加 150"LDMSO，震荡 10min，选择波长 490nm，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。 1.2.3 细胞生长曲线绘制等量接种至24个培养瓶内，随机分成8组，每组3瓶，每2d检测一组中每个瓶中的细胞总数，取3个瓶的均值，如此至第8 组结束。细胞计数参照司徒镇强和吴军正(2004)方法。 1.2.4 油红O染色提取法测定细胞内的脂肪含量接种方法同1.2.2，根据Ramirez-Zacarias等(1992) 的方法测定1-10d细胞内脂肪含量。细胞用体积分数10%甲醛的等渗盐缓冲液固定1h后，蒸馏水漂洗。吸取油红O工作液10mL，使培养面向下浸染，2h后倒掉瓶内的油红O工作液，蒸馏水漂洗培养瓶数次，直至完全漂洗干净。将已染色的培养瓶置于32.烘箱内蒸发掉瓶内的水分后即加入1mL异丙醇，萃取出的染液即刻用吸管吸出，于分光光度计 510nm波长处测吸光度。 2 结果 2.1 原代培养的猪前体脂肪细胞的形态学观察经胶原酶消化后的原代培养细胞6h开始有少量成纤维细胞样细胞散在贴壁，未贴壁细胞为球形。培养24h，换液除去未贴壁细胞后，贴壁细胞大部分为短梭形或不规则的三角形(图1)。随着培养时间的延长，到第4天，部分贴壁细胞内出现松散的小脂滴。细胞内脂肪颗粒大小不一、数量不等，形态很不一致(图2)，脂肪细胞体积较大，细胞膜较薄，膜轮廓不光滑，凹凸不平有皱折。随着培养时间的延长，细胞内脂滴逐渐增大，脂滴融合，细胞核位于边缘(图 3)。当细胞密度进一步增大时，甚至出现重叠生长，细胞因营养和代谢物的影响，发生密度抑制，细胞大量汇合后生长停止，充脂细胞呈堆积状，脂滴由明亮变为灰暗，也有部分细胞脱落，浮于培养液内。图1.培养24h后细胞形态 Fig.1.Morphologyof24hcellsculturedinvitro 细胞呈三角形或多角形 !!200)。 Showingstretchedfibroblast-likeortrianglecellphenotypes(!200). 2.2 MTT比色法检测细胞活率用酶联检测仪在490nm波长处检测其光吸收值(A)，可间接反映活细胞数量(表1)。 650 第5期屈长青等:猪前体脂肪细胞的原代培养由表1可以看出，在第1!3天，细胞增殖较为缓慢，而第5"9天细胞增殖速度较快，之后，细胞增殖速度再次降低。图2.培养4d后细胞形态 Fig.2.Morphologyof4dcellsculturedinvitro 细胞内出现松散的脂滴(!200)。 Showingsmalllipiddropletincytoplasm!!200). 图3.培养7d后细胞形态 Fig.3.Morphologyof7dcellsculturedinvitro 示小脂滴融合成大脂滴(!400)。 somesmalllipiddropletfusingincytoplasm(!400). 表1MTT比色测光吸收值 Table1TheabsorptionofpreadipocyteinMTTassay 2.3 猪前体脂肪细胞的生长曲线细胞生长曲线的测定可利用细胞计数进行。细胞倍增时间的计算依下列公式求得： TD=t(log2/logNt#logN0) TD为细胞倍增时间，t为培养时间，N0为接种细胞数，Nt为培养t小时后的细胞数。前体脂肪细胞生长曲线近似S型，符合原代细胞的正常生长增殖规律，即经历潜伏期和指数生长期并有进入平台期的趋势。根据生长曲线，前体脂肪细胞的倍增时间为62.6h(图4)，前体脂肪细胞接种后潜伏期约为40h左右，培养5d后前体脂肪细胞增加了3倍。前体脂肪细胞接种后的第3$8天是前体脂肪细胞的指数增殖期，第9天后前体脂肪细胞的生长进入平台期。图4.前体脂肪细胞生长曲线 Fig.4.Growthcurveofpreadipocytesculturedinvitro 2.4 油红O染色法测定细胞内脂肪含量第10天的脂肪细胞经油红O染色苏木精复染后，成熟脂肪细胞胞质内脂滴呈橙红色，胞核为蓝色 (图5)。脂滴大小不一，胞核位于细胞一侧，核/浆比例变小。图5.第10天用油红O染色 Fig.5.OilredOstainingof10dcellsculturedinvitro 示胞内脂滴(红色)，细胞核用苏木精复染(蓝色)!!400)。 lipiddropletswerestainedredandnucleiwerestainedbluewith hematoxylin!!400). 培养时间/d 光吸收值 Culturetime A490 1 3 5 7 9 11 13 0.114"0.006 0.145"0.003 0.377"0.022 0.529"0.032 0.767"0.026 0.785"0.037 0.793"0.019 651 农业生物技术学报 2005年图6显示，随着分化的进行，细胞脂肪含量呈增加的趋势：在分化的前2d,因没有脂滴生成,油红 O没有着色，OD值为0；第3天,部分细胞内出现小脂滴,被油红O染成橙红色；6d后积聚量明显增多,与形态学观察结果相吻合。图6.前体脂肪细胞分化过程中细胞内脂肪含量的变化 Fig.6.Cytoplasmicfatcontentchangesinpreadipocyte differentiation 3 讨论 3.1 脂肪细胞分离培养体系迄今为止，研究脂肪细胞的培养体系大体分为两大类，一类是特殊的前体脂肪细胞系，如3T3-L1、 3T3-F442A及ob17系列等，适用于研究脂类代谢调节因素；另一类是从个体脂肪组织中分离的血管基质组分(stromalvascularfraction,SVF)。即将切下的脂肪组织用胶原酶消化后，离心，收取沉淀部分 (SVF)；起初SVF细胞胞浆内并无脂肪颗粒，但在形成单层汇合后，可积聚大量的脂滴。证明SVF内含有前脂肪细胞，具有增殖和向成熟脂肪细胞分化的性能(Vanetal.,1976)。在以后的许多研究中，常把 SVF作为前体脂肪细胞进行研究。原代培养可以更好的反映细胞的在体特性，因此，前体脂肪细胞的原代培养是研究脂肪组织的理想模型。孙超(2001)、王竹晨等(2001)和夏成等(2004)用相似的分离方法分别从鼠、人和牛等动物脂肪组织中培养出前体脂肪细胞，但目前尚未见到有关猪前体脂肪细胞原代培养的报道。成功分离培养前体脂肪细胞涉及的因素较多，各个实验室选用的方法与培养基各不相同，如消化时间，王竹晨等(2001)用的是37!消化15h，而夏成等 (2004)用的是37"消化1.5h；培养基有采用 DMEM和F12按1!1比例配制，也有用M199。本实验室通过对比，发现猪的前体脂肪细胞的分离，采用 37#，消化1h，培养基采用DMEM培养效果较为理想。细胞分离时所选择的离心力也各不相同，夏成等(2004)采用的是2500r/min，而王竹晨等(2001)和孙超(2001)采用的是1000r/min。本实验室经过比较发现，当离心力大于2500r/min时，细胞碎片增多，而小于1500r/min时，分离的细胞数相对较少，这可能是由于种属差异，细胞体积与大小不同所致，因此本实验采用2000r/min进行分离的。此外，细胞接种密度与首次换液时间对猪前体脂肪细胞原代培养也有影响。我们采用1"104的接种密度与24h 首次换液(主要为了除去未贴壁的细胞)的方法，效果较好。 3.2 原代培养猪前体脂肪细胞的生长特性前体脂肪细胞的原代培养可再现其增殖与分化过程，即生长停顿-生长再续-细胞分化的连续过程。生长停顿是必要的第一步，此后这些细胞至少进行1次以上的再分裂，才继续向成熟脂肪细胞分化。我们观察到细胞贴壁后经过一段时间的潜伏期后开始生长，到第4天，这些贴壁的细胞内出现许多松散的脂滴，随着时间的延长，细胞内脂滴增大，相互融合，这与 Akambi等(1994)和 Ding等(1999)的报道相一致。细胞的生长曲线是细胞生长基本规律的重要表现。猪前体脂肪细胞在体外培养第3天时大量增殖，第9天时细胞增殖速度逐渐下降进入平台期，前体脂肪细胞生长曲线近似S型，基本符合原代细胞的正常生长增殖规律。细胞活力的检测方法应用较多的是染料排除法，如台盼蓝染色法和伊红染色法，但存在主观因素影响较多、时间不宜过长等缺点，而MTT比色法具有灵敏度高、重复性好、操作简便、无放射性污染等特点，与细胞计数有良好的相关性，因此广泛用于检测细胞活力和观察细胞生长等方面。本实验用此法间接反应了活细胞数量在不同培养时间的变化,与前体脂肪细胞生长曲线基本符合。油红O染色提取法可简便、快速地对体外培养的前脂肪细胞分化率进行定量，其准确性和敏感性与测定前脂肪细胞分化过程中的标志酶GPDH相似(Ramirez-Zacariasetal.,1992)，因此常用来作为对体外培养的前脂肪细胞进行鉴定。我们采用油红O 染色提取法进行研究，发现前脂肪细胞在培养第3 天即开始有脂滴的积聚，6d后积聚量明显增多,与形态学上的观察结果相吻合。本实验的脂肪组织采自7日龄仔猪，在前体脂 652 第5期屈长青等:猪前体脂肪细胞的原代培养肪细胞的原代培养中加入10%的胎牛血清，观察到活跃的新生脂肪细胞。此过程并未加入胰岛素等分化诱导液，也能观察到自动分化现象，但分化程度不高，而且呈现出一种堆集现象。可能是由于分离的前体脂肪细胞有部分处于分化后期，在培养条件下继续分化，并分泌有关的激素，通过旁分泌途径来加速或促进周围细胞的分化进程，其具体机制有待进一步研究。参考文献 AkambiKA,BrodieAE,svryawanAandHuCY.Effectof ageonthedifferentiationofporcineadiposestromal-vascvlar cellsinculture. JournalofAnimalScience, 1994, 72: 2828~2835 AsoH,AbeHandNakajimaA.Preadipocyteclonallinefrom bovine intramuscular adipose tissue. Biochemical BiophysicalResearchCommunications,1995,213:369~375 DingST, McNeelRLandMersmannHJ. Expressionof porcineadipocytetranscripts: Tissuedistributionand differentiation in vitro and in vivo. Comparative BiochemistryandPhysiologyPartB,1999,123:307~318 Ramirez-ZacariasJL,Castro-MunozledoFandKuri-Harcuch W.Quantitationofadiposeconversionandtriglyceridesby staining intracytoplasmic lipids with oil red O. Histochemistry,1992,97:493!497 SiTuZQ(司徒镇强)andWuJZ(吴军正).CellCulture.Xian: WorldPublishingCo,Ltd,2004.(inChinese) VanRL,BaylissCEandRoncariDAK.Cytologicaland enzymologicalcharacterization ofadulthumanadipocyte precursorsinculture.TheJournalofClinicalInvestigation, 1976,58(9):699"704 SunC(孙超).Regulationofmicepreadipocytes’proliferation anddifferentiationbyECM componentsand cAMP. DissertationofNorthwestA&FUniversity(西北农林科技大学)ph.Dtheses,2001.(inChineses) XiaC(夏成),WangZ(王哲)，ZhuSL(朱淑玲)，ZhangC(张才) andZhangHY(张洪友).Cultureofcalfpreadipocyteand establishmentofitsproliferationanddifferentiationmodel. ChineseJournalofVeterinaryScienceandTechnology(中国 #$%),2004,34:26~30(inChineseswithEnglishabstract) WangZC(王竹晨)，LiuJZ(刘建中)，LiY(李燕)，YangDZ (杨冬梓)andKuangJQ(邝健全).Primarycultureofhuman preadipocyte.AcademicJournalofSunYat-SenUniversity ofMedicalScience(中山医科大学学报)，2001,22:443~447 (inChineseswithEnglishabstract) 653

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