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未成熟卵母细胞体外成熟培养技术研究进展

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未成熟卵母细胞体外成熟培养技术研究进展 分类号:R711.6 密 级: 单位代码:10422 学 号:032303043 ③∥菇办誊 硕士学位论文 ShandongUniversityMaster’SThesis 论文题目: 未成熟卵母细胞体外成熟培养技术 研究进展 Title: THERESEARCHPRoGRESSOFINVITRo MATURATlONTECHNoLLGY 作 毒Y 导 合作 者 塞盐鑫 业 妲亡型堂【生殖匡堂】 师 整巫虫韭銎莲 导师 2010年5月21日 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,...
未成熟卵母细胞体外成熟培养技术研究进展
分类号:R711.6 密 级: 单位代码:10422 学 号:032303043 ③∥菇办誊 硕士学位论文 ShandongUniversityMaster’SThesis 论文目: 未成熟卵母细胞体外成熟培养技术 研究进展 Title: THERESEARCHPRoGRESSOFINVITRo MATURATlONTECHNoLLGY 作 毒Y 导 合作 者 塞盐鑫 业 妲亡型堂【生殖匡堂】 师 整巫虫韭銎莲 导师 2010年5月21日 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下, 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 彰 论文作者签名: 赶焘: 日 期: .>rio.2-,歹f 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论丈的规定,同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允 许论文被查阅和借阅;本人授权山东大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或其他 复制手段保存沦文和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名:盔塑: 导师签名: 期: 筮&!』:兰f 山东大学硕士学位论文 目 录 个案报道⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 综jlI§....................................................................................6 致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37 山东大学硕士学位论文 CoNTENTS CaseReport..................................................................................1 References..............................................................................⋯.5 Review................................................................................6 Acknowledgement.....................................................................⋯.37 2 山东大学硕十学位论文 未成熟卵母细胞体外成熟培养并形成可利用胚胎1例 专 业 硕士研究生 导 师 妇产科学 袁代东 韩双印张翠莲 【关键词】 未成熟卵;体外成熟;多囊卵巢综合征;过度刺激综合征 未成熟卵母细胞体外成熟(IVM),是不经过促排卵或应用少量的促性腺激素 (Gn),从卵巢获取未成熟卵,在体外适宜的条件行体外成熟培养,使卵母细胞 成熟并具备受精的能力。IVM是目前新兴的一种辅助生殖技术,目前主要的应 用是与其他辅助生殖技术体外受精.胚胎移植(rVF.ET)或卵胞浆内单精子注射 (ICSI)相结合治疗不孕症患者尤其适合伴有多囊卵巢综合征(PCOS)的患者;预防 过度刺激综合征(OHSS);为卵巢切除或者化疗病人保存生育能力。2009年11 月我院生殖中心开展了这项技术,2010年1月治疗了第一例患者,形成可利用 胚胎,并冷冻。这是我院生殖中心首例进行IVM治疗患者,现介绍如下。 1.临床资料 一般资料患者孙某某,女,34岁,婚后13年未避孕未孕。双方染色体检 查正常。女方行输卵管碘油造影(HSG)显示:双侧输卵管梗阻;综合月经不规律 的病史、超声检查和内分泌情况诊断女方多囊卵巢综合症(PCOS)。 2.方法 2.1预处理:门诊应用达英一35(Schering德国)三个月。 2.2临床:拟行降调节长方案促排卵。黄体中期应用GnRH.“达必佳, Ferring德国)0.1medd,14天后本院复诊,测血LH、E2、P及超声检测内膜、 卵泡,达到降调标准;予GnRH.“达必佳,Ferring德国)O.05mg/d至HCG日, 应用重组FSH(Serono瑞士)112.5IU/d启动,共用Gn14天。在应用Gn期间, 多次超声检测卵泡,查血清激素水平。在Gn的第14天,有6个卵泡>14衄, 余30个左右10衄小卵泡。患者超声检查双侧卵巢长径达50111111,考虑患者应用 Gn天数长,0HSS风险大,予HCG8000IU肌注,拟行ⅣF+IVM助孕。 2.3取卵:在注射HCG后36h,行取卵手术。先用17G双腔穿刺针(COOK澳 I 山东大学硕士学位论文 大利亚)经阴道超声引导穿刺>14衄的卵泡,负压为120-140rotllHg;再穿刺小 卵泡(10咖左右),负压为80—120姗Hg。手术应用全麻,术后观察2h。 2.4精子准备:嘱男方取卵前3天不排精,取卵后即取精,采用梯度离心法处 理精液。处理后加到1020(含5%HSAQuninsSAGE美国)培养液0.5ml中混合, 置于5%C02培养箱中备用。 2.5卵母细胞的获取及处理:先行取出的>14rm的卵泡的卵泡液平铺置于 捡箩flllR(Falcon3002,美国)中,所获得卵母细胞肉眼观颗粒细胞展开,较松散, 放射冠呈放射状排列,似太阳火焰,泡膜颗粒细胞丰富,排列松散,将其归为 IVF组:获卵8枚,按常规IVF.ET进行,置于1020(含5%HSA,QuninSSAGE美 国)培养液中,4h后授精,6h后捞蛋,18h后观察受精情况,42h和66h后观察分 裂其胚胎情况。将取自lO咖左右的小卵泡的卵泡液置于预温的经肝素抗凝的 HTF.HEPES培养液中,卵泡液经过孔径为70J.tm的网筛(Falcon3002,美国)过滤, PBS(卵泡冲洗液Qunin’sSAGE美国))冲洗后,在体式镜下分离卵母细胞,肉 眼观紧密的放射冠和紧密的颗粒细胞团,紧贴于透明带外缘,细胞胞质内可见 生发泡(GV),泡膜颗粒细胞小,排列紧密,归为IVM组:获卵8枚,行IVM+ICSI, 卵子置于体外成熟培养液。 2.6IVM:配制体外成熟培养液:TCMl99(Sigma美国)+10%SPS(血清替 代品QuninsSAGE美国)+0.075IU/mlFSH(Serono瑞士)+0.15IUmlHCG (Serono瑞士)+10lag/mlEGF(Sigma美国)+10pedmlE2(Sigma美国)+ 29lamol/L丙酮酸钠(Sigma美国)+50IU/ml青霉素+50laedml链霉素。将IVM组 卵子加入到IVM培养液中,置于37。C+5%C02培养箱中培养36h。 2.7成熟观察和ICSI受精:在体外培养36h后,将IVM组的卵子取出经透 明质酸酶(HYASETM,QuninSSAGE美国)液中化学消化加机械吹打去除卵丘 细胞,去卵丘细胞后共得含有第一极体的成熟卵母细胞8枚,进行ICSI受精。 将已卵胞浆内单精子注射后的卵子移入1026(含10%SPS)培养液中,置37℃+5 %的C02培养箱中培养。 3.结果 2 山东大学硕士学位论文 3.1观察受精和评判胚胎质量: IVM组在ICSI后16h观察受精情况,40h 和64h观察分裂其胚胎情况:8枚卵子行ICSI后5枚J下常受精为2PN。IVF组: 8枚卵子正常受精7枚为2PN。按Brian.Dale评分方法评判胚胎质量:l"--2级 为优质胚胎,3级为可移植胚胎,4级为劣质胚胎(胚胎碎片>50%不适合移植)。 评定IVM组2级胚胎2枚,3级胚胎1枚。IVF组2级胚胎6枚。 3.2胚胎冷冻:取卵后72h,因患者有中度OHSS表现,将上述可移植胚胎 行程序冷冻。 4.讨论 PCOS在育龄妇女中的发病率是5.10%,在不孕症患者中占30-40%,占排 卵障碍不孕患者的75%。对PCOS患者进行常规的促排卵的过程中,经常出现 对促排卵药物不敏感,如对氯米芬抵抗而导致卵泡得不到发育或者生长时间过 长与内膜不同步,无法获得妊娠。PCOS是OHSS的高危因素,在一定剂量的 促性腺激素作用的情况下发生过激反应诱发OHSS,不仅仅影响卵子质量和受 精还会影响胚胎移植后的种植对妊娠不利,情况严重者危及患者生命。Trouson 的研究¨1证实PCOS患者来源地未成熟卵母细胞可以体外成熟最终获得妊娠, PCOS患者的IVM结局取得了不错的效果。Jroadui等的研究弘1对一组ART过 程中有OHSS风险的病人取消注射HCG,获得未成熟卵在体外培养成熟,成功 获得胚胎进行移植。本文的所报道的病例即是促排卵过程中发生卵巢过度刺激 倾向,而提前取卵行IVM+ICSI的。 相比常规的促排卵IVF,IVM不须卵巢刺激或只需小剂量的促性腺激素刺 激,在卵泡发育的早期就取卵,避免了过激反应;节省了治疗费用和就医的时 间;也适用于对促排卵药物不敏感的患者。IVM是解决PCOS患者不孕的有效 方法,而对卵泡的行穿刺抽吸配合IVM培养,改善患者的内分泌环境,有利于 进一步的治疗效果及增加了患者可利用卵母细胞的来源。但IVM仍然面临着问 题诸如,卵母细胞体外成熟率低;IVM来源地卵母细胞的胚胎发育潜能低于体 内成熟的卵母细胞【31;IVM的胚胎发育与患者子宫内膜的发育不同步【41。 在ⅣF.ET治疗中,对卵巢反应不良、卵泡发育迟缓和卵泡过多生长有发生 过度刺激可能需要取消治疗周期的患者,在超声引导下经阴道卵泡穿刺术取卵 后,对未成熟卵进行体外培养成熟后进行IVF或ICSI,选择好的胚胎进行移植, 3 山东大学硕士学位论文 是一个新备用选择。 自1991年Cha【5】等报道IVM技术取得第一例妊娠以来,IVM广泛应用于 临床,但是IVM来源的卵母细胞发育潜能却明显低于体内成熟的卵母细胞,这 提示IVM技术还有待更深一步的探索研究。 4 山东大学硕十学位论文 参考文献 【1]TrousonA,WoodC,KauscheA.Invitromaturationandthefertilizationand developmentalcompetenceofoocytesrecoveredfromuntreatedpolycysticovarian patients.FenilSteril,1994,2353—362. 【2]JaroudiK,RocaGL,AtaredA,eta1.Invlromaturationofhumanoocteysforthe patientswhoaleattheriskofhyperstimulationduringassistedreproduction.Fertil Steril.1997,68(Suppll):S4-S5. 【3]LeDuA,Kadoch玎,Bourcigaux,eta1.Invitrooocytematurationforthe treatmentofinfertilityassociated、析tllpolycysticovariansyndrome.theFemch experience[J].HumRepord,2005,20(2):420-424. 【4】MikkelsenAL.Strategiesinhumanin-vitromaturationandtheirclinical outcome.ReprodBiomedOnline,2005,10(5):593—599. [5】ChaKY,KooJJ,eta1.Pregnancyafterinvitrofertilizationofhumanfollicular oocytescollectedfromnonstimulatedcycles,theircultureinvitroandtheirtransfer inadonoroocytcprogram[J].FertilSteril,1991,55(1):109—113. 5 山东大学硕士学位论文 综述 未成熟卵母细胞体外成熟培养技术研究进展 袁代东综述张翠莲韦多审校 【摘要】卵母细胞体外成熟(IVM)培养技术已成为生殖医学研究的热 点。相对于常规的IVF技术,IVM的卵母细胞胚胎发育潜能明显低于体内成熟 卵母细胞。可能原因是现有的IVM培养系统不能完全模拟卵母细胞体内成熟环 境。最新的研究表明卵母细胞细胞胞质成熟与核成熟的同步化,对卵母细胞成 熟后的体外受精、卵裂、胚胎质量及妊娠结局至关重要。本文将对影响ⅣM的 各方面因素及最新研究文献进行总结和探讨。 关键词 卵母细胞 体外成熟 减数分裂 胞质成熟 促性腺激素 甾体激素生长因子 1935年,Pincus和Enzmanztlj观察到兔的未成熟卵母细胞在体外培养条件 下可以自发完成卵母细胞的成熟过程,自此在生殖领域引入了一个新的概念即 卵母细胞的的体外成熟(invitromaturation,IVM),后来在鼠、恒河猴和人的卵母 细胞发育中也证实了上述概念。自1991年ChatS]等报道IVM技术取得第一例妊 娠以来,IVM技术已应用于治疗多囊卵巢综合征(polycysticovary syndrome,PCOS)的不孕,预防卵巢过度刺激综合症(ovarianhyperstimulation syndrome,OHSS),并与体外受精.胚胎移植技术(invitrofertilization-embryo transfer,IVF—ET)结合治疗患有严重遗传病或者因病切除卵巢的患者。目前世界 上有多家生殖中心开展未成熟卵母细胞研究和临床应用,已有数百例IVM技术 诞生的婴儿。但是目前有大量哺乳类和人类卵母细胞体外成熟的能力和机制的 研究,但体外成熟的卵母细胞发育潜能却明显低于体内成熟的卵母细胞p’4J, 临床妊娠率低,原因主要是我们对卵母细胞成熟和获得发育潜能方面的分子机 理和生理生化过程研究不深,现有的IVM培养条件不能维持卵母细胞胞质充分 成熟。这提示IVM技术还有待更深一步的探索研究。本文就近年来IVM技术 的研究进展综述如下。 6 山东大学硕十学位论文 1.卵母细胞成熟过程和机制 卵母细胞成熟是指卵母细胞完成第一减数分裂和为随后的受精及胚胎发育 做准备的过程。包括两部分:细胞核成熟和细胞质成熟。核成熟表现为生殖泡 破裂(germinalvesicalbreakdown,GVBD)、同源染色体分离和排出第一极体到卵 周间隙,细胞周期停留在MII期等待受精。然而仅是核成熟的卵母细胞是不具 备受精以及胚胎发育的潜能的,必须同时伴有胞质的成熟。胞质的成熟是伴随 核成熟所发生的一系列细胞质的变化,包括m]ⅢAs的转录及储存,多种蛋白 质的合成、后修饰,以及细胞器的适当移位,与核成熟不同,细胞质的成 熟在光镜下没有明显的特征性的改变,但是细胞质成熟的不充分会在胚胎发育 的后期显现出来,如胚胎分裂的异常和种植率的低下。对卵母细胞的受精级之 后的胚胎发育具有重要的意义。卵母细胞体外成熟培养的目的就是为了获取更 多的MⅡ期的卵母细胞,能够发育成正常胚胎。哺乳动物中,卵母细胞的胞质 成熟是在卵泡发育最后阶段获得【5·6】的。在生理条件下,卵母细胞的细胞核成 熟和细胞质成熟是保持精确同步化的,而在IVM中细胞核与细胞质的成熟却不 能完全同步,其机制不明,这也是大多数体外成熟失败的重要原因。 成熟调控的机制非常复杂,卵母细胞的成熟过程受到内分泌、旁分泌、自 分泌多种机制的调控,卵泡刺激素(folliclestimulatinghormone,FSH)、黄体生成 素(1uteinizinghormone,LH)、第二信使cAMP、雌激素(E2)、孕激素(P)、成熟促 进物质、成熟抑制物质、生长因子EGF、VEGF、IGF等等多种调节因子参与。 1.1甾体激素的作用 在下丘脑.垂体一卵巢轴的作用下,卵泡细胞合成甾体激素并积聚于卵泡液当 中。卵冠丘复合物(oocyte.conora-cumulus.complexs,OCCCs)在整个成熟过程中都 浸泡在卵泡液中,其中卵泡液中甾体激素对卵子发育有着关键作用:卵泡液中 高浓度的雌二醇(E2)和孕酮(P)促进有受精能力的卵母细胞生长,高浓度的雄激 素(A)和高的A/E2比值与卵泡闭锁相关。优势卵泡的卵泡液中E2浓度随着卵泡发 育成熟而逐渐增加,颗粒细胞产生的E2>11.1mmol/L、E2/P>0.001是卵母细胞 成熟和优质的标志L,J。 1.2第二信使cAMP的作用 7 山东大学硕士学位论文 卵母细胞的成熟过程中,第二信使cAMP是控制卵母细胞恢复减数分裂的 关键信号分子。卵母细胞内的cAMP来自于卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞,通过 细胞间的缝隙连接(gapjunction,GP)进入卵母细胞。高浓度的cAMP可逆性抑制 卵母细胞减数分裂的恢复。在体内当Gn作用使卵丘细胞扩展,卵母细胞与周围 卵丘细胞缝隙连接减少,卵母细胞内cAMP浓度下降时,卵母细胞减数分裂恢 复。 1.3局部因子的作用 卵巢局部有着极为精细复杂的多因子调节系统,协助生殖轴调节卵泡生长 启动、募集、优势化、闭锁及排卵过程,甚至影响f;;体激素的合成。这些调节 物质随卵母细胞成熟而变化,其中促进卵母细胞成熟的物质有表皮生长因子 (epidermalgrowthfactor,EGF)、血管内皮生成因子(vascularepidermalgrowth factor,VEGF)和激活素A。 (1)EGF是一种多肽类物质,重要的卵巢局部生长因子之一。EGF与其受体 结合发挥作用,不但促进减数卵母细胞减数分裂,而且对卵母细胞胞质成熟也 有积极作用,有利于早期胚胎发育。EGF的生物活性不依赖于cAMP途径,可 能由PKC途径介导。在人类始基卵泡、初级卵泡、窦前卵泡和窦状卵泡中的卵 母细胞、卵泡膜细胞、颗粒细胞、和黄体中都可以检测到EGF受体的表达【81。 EGF不但通过卵丘细胞为中介发挥作用,还可以直接作用于卵母细胞本身,促 进卵母细胞成熟发育f91。 (2)VEGF是一种特殊的细胞分裂剂和潜在的血管分化因子。当组织中溶解氧 的浓度下降时,卵母细胞内厌氧产物堆积,pH下降,酸中毒影响减数分裂中期 纺锤体的结构和稳定性,这种变化进一步引起染色体易位和同源染色体分裂紊 乱,也使卵母细胞的非整倍体发生率增高。卵泡颗粒细胞通过旁分泌合成VEGF, 使卵泡周围及卵泡液内产生高浓度VEGEVEGF在卵母细胞减数分裂过程中参 与微血管的再生过程,调节卵子周围溶解氧的浓度,促进卵母细胞健康成长【101. (3)激活素A是肿瘤生长因子(TGF.13)家族成员,通过自分泌或旁分泌调 节卵巢功能。激活素存在于卵泡液中调节窦卵泡的微环境,促进卵母细胞的成 熟,同时抑制颗粒细胞孕酮的分泌并限制颗粒细胞的分化,刺激颗粒细胞的增 R 山东大学硕士学位论文 殖【1¨。抑制素A在体外研究中促进卵母细胞成熟尤其是促进卵母细胞胞质的成 熟,使早期胚胎发育能力增强【121。 卵母细胞体内的生长环境卵泡液内,还含有葡萄糖、丙酮酸、电解质和对卵 母细胞成熟有抑制作用的因子、抑制素、次黄嘌呤等。葡萄糖、丙酮酸是卵母 细胞体外成熟提供能量的底物。培养基中高浓度的葡萄糖可促进卵母细胞体外 成熟【131,丙酮酸对卵母细胞的核成熟十分重要【141,不含丙酮酸的培养基难以取 得较好的体外成熟率。对卵母细胞成熟有抑制作用的物质可能是为了促进卵母 细胞核成熟与胞质成熟的同步化。 2.卵母细胞的体外成熟实验室条件 卵母细胞的体外培养是一个复杂的过程有多种因素的参与,包括用促性腺 激素促排卵、卵丘细胞、培养系统及其添加物、培养时间等。培养系统是卵母 细胞体外培养的关键因素。不同的培养条件会得到不同的IVM结局,不佳的培 养条件是导致IVM培养后卵母细胞质量下降的主要原因。卵母细胞的IVM所 需条件尚未完全明确,还没有一种公认的商品化的卵母细胞IVM培养液。目前 常采用的培养基有:HTF、TCMl99、HAMF、MEME等,研究者常在培养系统 添加胎牛血清、卵泡液、促性腺激素(FSH,LH,hCG,HMG)、生长因子 (EGEVEGF,IGF)等,以期更适合卵母细胞生长发育和成熟,有利于卵母细胞 体外培养的成熟,以及之后的受精、早期胚胎发育。探索更适合卵母细胞体外 成熟的培养基也是目前研究的热点。 2.1促性腺激素 在体内生理条件下FSH、LH即存在与卵泡液中,对卵母细胞的生长发育和 成熟起着重要作用。向培养液中添jJIJFSH已得到普遍认可,卵母细胞在体外培 养中对FSH有依赖性,去除培养液中的FSH会导致小鼠卵母细胞死亡,颗粒细胞 的活性受损【151,Wright等【16】研究证实FSH在培养液中添加FSH有效减少了卵泡 闭锁。Oktay等[17】研究FSH的受体较早便可检测到,因此早卵泡阶段FSH便发挥 作用,促进早期的卵泡生长和窦形成,刺激颗粒细胞产生甾体激素,此外FSH 对维系颗粒细胞之间、颗粒细胞与卵母细胞之间的缝隙连接有非常重要的作用。 然而当FSH的浓度过大(高于1ug/mL),则会导致卵母细胞与卵丘细胞之间的 q 山东大学硕士学位论文 细胞联结过早降解,颗粒细胞黄素化,进而使卵母细胞在体外的活力下降,这说 明了IVM中合理应用FSH的重要性【1引。FSH作用于颗粒细胞使LH受体上调【191, 增强其敏感性。在体内,LH启动卵母细胞恢复减数分裂,促进卵母细胞的发育 成熟。体外培养中,LH对卵泡养结构的分化以及窦样卵泡腔的形成起着重要的 促进作用【201。有实验表明【21】LH受体mRNA表达丰富的OCCCs成熟能力高。在 培养液中加入FSH和LH,可支持卵泡生长。卵母细胞中无FSH或LH受体,FSH、 LH共同作用于颗粒细胞上的受体,从而影响卵母细胞的成熟,FSH、LH促颗粒 细胞增殖分化【221,产生有利成熟的激素、分子、生长因子,使卵母细胞生长成 熟获得潜能;FSH、LH作用于颗粒细胞,使卵母细胞与卵丘细胞间的缝隙链接 中断,阻止成熟抑制因子cAMP进入卵母细胞,卵母细胞内的cAMP水平下降, 减数分裂恢复Kj’,;FSH、LH使颗粒细胞扩张膨散,有利精子穿过、正常受精 和合子形成。 2.2甾体类激素 在卵泡的发育过程中,E2存在于卵泡液,可以使颗粒细胞增生,FSH和E2 受体增加,而增强OCCCs对促性腺激素的反应性,加速E2的产生。E2有利于维 持颗粒细胞之间的联系。E2的存在使卵母细胞获得更高的发育潜能【241。Chian 等通过研究发现:在含胎牛血清的培养基中加入生理剂量及超生理剂量的FSH, 能刺激卵丘细胞分泌E2,因而在刺激周期,进行IVM时可不必向培养基中添加 E2【251。类似的观点有Mingoti等[26】研究发现牛OCCCs在体外成熟中可以产生甾 体激素;Dode等【27】研究发现猪的0CCCs在成熟培养期间可以产生分泌甾体激 素,产生E2的量可以满足卵母细胞的需要。但是越来越多的研究证实E2的存在 对卵母细胞的体外成熟有着积极的作用。卵泡液中的甾体激素的存在对卵母细 胞成熟起重要的作用,在卵母细胞培养过程中加入甾体激素合成抑制剂会损害 其成熟后的受精和发育的潜能。E2和其他的甾体激素一起对卵母细胞保持减数 阻滞有重要作用【281。有研究【24,29】发现17S.E2的加入可以提高卵母细胞的桑葚 胚和囊胚的形成率,可能是E2对卵母细胞的核成熟和卵胞浆成熟同步性有益的 原因【301。瞄m等【31】在TCMl99中添加孕酮和E2,发现2lag/mLE2能提高卵母细 胞成熟率(10.4%),同时添加E2和2pg/mE的P4显著提高了卵母细胞成熟率 10 山东大学硕士学位论文 (16.6%),但同时添)JflE2和0.5|lg/mLP4时却降低了成熟率(3.4%),机制可能 是甾体激素对卵母细胞成熟的促进与添JJHE2和P4比值有关。另外有研究报道在 加入并未提高卵母细胞的成熟率和发育的潜能,甚至是有害【j引,可能与实验的 条件不相同和种属特异性相关。因此对在培养基中添加雌激素的剂量、时机, 有待进一步的研究。 2.3生长因子和激活素脚制素 EGF影响卵母细胞减数分裂成熟,促进丘细胞的膨散扩张,对减数分裂重 启和胞质成熟都有促进作用。对其作用在多种哺乳动物得到印证, EGF+TCMl99PMSG被认为是最适合牛卵母细胞体外成熟的培养液。Goud-等[9】 研究发现2ng/ml浓度的EGF明显提高无颗粒细胞附着的裸卵(denuded oocyte,DO)体外培养的成熟率。EGF作用于有丘细胞附着的卵母细胞使成熟后 的受精率明显提高。EGF不但可以促进核成熟,对胞质也有促进作用。Merlo等 pjl对猫卵母细胞进行IVM发现,当EGF为25ng/mL时,可以增加卵母细胞的卵 裂率和囊胚形成率。卵丘细胞中ECF受体含量高于卵母细胞,在EGF作用下,含 有完整卵丘细胞的OCCC,体外成熟率、受精率均明显高于裸卵,提示EGF也可 以卵丘颗粒细胞为中介促进卵母细胞减数分裂的完成。分析其机制可能是:卵 丘细胞的存在增加了卵母细胞的表面积与体积比,使更多的EGF进入卵母细胞 【9】;卵丘细胞与卵母细胞之间的缝隙连接,,利于卵母细胞代谢过程中的物质转 运【341;EGF的活性可能借助颗粒细胞诱导的旁分泌信号调节卵母细胞的成熟 【”J。另有动物研究证实TEGF可以增强体外成熟卵母细胞受精后的胚胎发育潜 能【36·381,使卵母细胞受精后形成更多的桑椹胚和囊胚。 VEGF可以由颗粒细胞产生,通过其受体(VEGFR.1和VEGFR.2)对卵母细胞 的成熟发挥作用。有研究【39'40】发现vEGF对牛卵母细胞的核成熟、胞质成熟有 促进作用,也可提高体外成熟卵母细胞受精后的卵裂率。VEGF使卵母细胞成熟、 受精和胚胎早期发育中的一种重要的调节因子,有学者认为VEGF水平与卵母细 胞质量及早期胚胎发育密切相关,可以作为卵母细胞成熟及早期胚胎发育潜能 的生物学标志之一【411。 IGF.1也可以由颗粒细胞产生,对IVM卵母细胞的核成熟,可以增加卵母 ll 山东大学硕十学位论文 细胞的成熟率,并对卵母细胞的胞质成熟有促进作用【421,对卵母细胞体外成熟 后的卵裂情况有改善。在动物实验中,IGF.1与FSH协同作用,促进卵母细胞 体外成熟【431。 激活素/抑制素通过自分泌或旁分泌调节卵巢功能,对卵母细胞的成熟及早 期胚胎发育有重要作用。从小卵泡和中等大小的卵泡中得到的COC在体外成熟 中,颗粒细胞和卵子上都有激活素A、抑制素、促卵泡生成素、激活素受体.II 蛋白的表达m】,表明这些因子都参与了卵母细胞的成熟过程。Alak等【11】在培养 基中加入激活素A100ng/mL,卵母细胞发生生发泡破裂(GVBD)和发育至MII 期的比例(91%,51%)与对照组相比有很大提高(65%,35%)。激活素A促进较 小卵泡的成熟,对排卵前卵泡的作用未知。研究m】显示激活素A并不促进卵母 细胞的成熟,结果差异大,可能与实验条件不同有关,或者是由于周期特异性 和种属特异性。 2.4能量代谢底物 能量代谢也是影响卵母细胞成熟的重要因素,卵母细胞成熟过程中糖代谢升 高,用戊糖代谢的激动剂可诱导次黄嘌呤抑制的卵母细胞成熟。糖代谢不仅与卵 母细胞的核成熟有关,还决定着细胞质成熟,糖代谢越强的卵母细胞发育率越高。 能量代谢物质的来源对卵母细胞的体外成熟培养十分重要。 大鼠卵母细胞需要丙酮酸作为能量来源,而颗粒细胞则利用葡萄糖,并可将 其转化为丙酮酸供卵母细胞使用。丙酮酸对于卵母细胞的核成熟是十分重要的, 任何没有丙酮酸的培养液都不会有好的体外成熟率【101。对于大型哺乳动物和灵 长类动物谷氨酰胺与葡萄糖和/或乳糖一起都对卵母细胞的发育很重要。谷氨酰 胺代谢需要有颗粒细胞的存在,并受到LH的激发,是卵母细胞成熟所必备的 物质。在牛卵母细胞体外成熟中,葡萄糖是必须的能量物质,可被完整的COC 代谢利用,只有裸卵或只有颗粒细胞都不能利用葡萄糖。 葡萄糖和丙酮酸是卵母细胞发育成熟的主要能量提供物质,并通过调节其他 物质的代谢,如蛋白质和脂类的合成或作为抗氧化剂影响卵母细胞成熟。在培 养液中加入高浓度的葡萄糖或者丙酮酸,可以提高卵母细胞的成熟率。但有的研 究结果却是相反,Cekleniak等【45】研究24h观察无葡萄糖的P1培养基中裸卵成 12 山东人学硕士学位论文 熟率高于含有葡萄糖的TCMl99培养基中COC的成熟率,Chang等【46】研究认 为含有丙酮酸的培养基对卵母细胞潜能有害。因此对于人类体外成熟过程中的 能量代谢还有待进一步研究。 2.5血清及卵泡液 卵母细胞可在纯卵泡液中体外发育成熟,有研究在ⅣM培养基中添加卵泡 液发挥其对卵母细胞体外成熟的促进作用。而卵泡液中甾体类激素、生长因子、 电解质等成份在卵泡发育的不同时期有很大的变化,成熟促进物质、成熟抑制 物质不同阶段作用此消彼长,研究证实【47】较大卵泡来源的卵泡液更多得含促进 成熟的因子,有利于卵母细胞的核成熟。 培养液中经常添加血清,以前主要是脐带血清及胎牛血清,由于担心血液 制品的污染,现多采用患者本人的血清。相比加入HSA,加入血清的培养基中 的卵母细胞获得了更高的成熟率和种植率,可能由于血清中含有多种生长因子 的原因。卵泡液、血清成份复杂,不利于研究各个因素对卵母细胞体外发育成 熟的影响。 2.6卵丘细胞 用于IVM中的卵母细胞,目前普遍认为卵冠丘复合物优于裸卵。卵丘细胞 在不同的物种卵母细胞早期发育及成熟过程中发挥重大作用。卵丘细胞能够增 加卵母细胞内谷胱甘肽(GSH)含量,GSH的水平高的卵母细胞可获得高的发育潜 能【481。卵丘细胞与卵母细胞形成缝隙连接(gapjunction,GP),GP构筑了了卵 母细胞与卵丘细胞之间物质和信息交流的通道。颗粒细胞中的一些小分子营养 物质(如单糖、氨基酸、小分子多肽)可被转运到卵母细胞供其生长,一些激 素、离子和信号分子(女IcAMP、Ca2+、三磷酸肌醇等)在细胞之间交流,对促 进卵母细胞减数分裂恢复,维持颗粒细胞增殖,防止过早分化很重要作用。卵 丘细胞还能控制皮质颗粒(CG)释放,对阻止多精受精有一定作用。 Simon等【49】研究缝隙连接主要成分Cx-37基因缺失小鼠卵母细胞不能发育 成熟。另外卵丘细胞可以增大卵母细胞表面积/体积之比,使进入卵母细胞的小 分子物质增加【9】。同时卵丘细胞表面有多种激素、生长因子受体(如FSH、LH、 EGF等),可以介导其对卵母细胞成熟的调节作用。卵丘细胞自身还可以合成 13 山东大学硕七学位论文 IGF.2、激活素A、抑制素A等调控卵母细胞的成熟。 2.7体外培养的环境 目前的IVM,一般在37。C和5%C02或者37"(2和5%C02+5%02+90%N2三 种混合气体中进行,培养系统中的C02。不仅仅可以平衡培养液,而且还有助 于细胞代谢中的丙酮酸转换成草酰乙酸,对卵母细胞成熟有利【501。而大气压力 下的氧浓度对哺乳动物的胚胎发育有害【51,521,原因可能是由于产生的氧自由基 (reactiveoxygenspecies,ROS)【53】,在含有高葡萄糖浓度的培养液中,高的氧浓度 产生ROS,消耗卵母细胞胞质内的谷胱甘肽(GSH),而GSH与卵母细胞的发育 潜能相关。Hashimoto等【”】研究认为低氧条件(5%C02+5%02+90%N2)下,牛的 卵母细胞可以产生少的ROS,而使得牛卵母细胞获得更好的潜能。但是有的研 究【55'561认为20%02更有利于牛卵母细胞成熟。对人和其他哺乳动物卵母细胞 成熟的最是氧浓度有待进一步确证。 2.8培养的时间 对于卵母细胞最佳的体外成熟的时间,尚没有定论。体外培养成熟时间越 长,达到MII期的卵母细胞越多,但卵母细胞的成熟不同步,很大一部分在培 养24h后即成熟,统一在48h后受精,这一部分卵已经在到达MII期超过20d,时, 可能会错过最佳受精时机,出现皮质颗粒的过早释放以及透明带硬化。而透明 带化使得卵子受精和囊胚孵出障碍。Cha等u1认为未成熟卵体外培养30.48h,成 熟率、受精率较高。msmith等156J的研究将成熟时间从36h减少至28h,两组的 成熟率、受精率、临床妊娠率无明显差异,且28h培养可避免夜间加班,有利于 工作安排。正常在体内成熟的卵母细胞是在LH分泌高峰的刺激下才完成的,卵 丘细胞、透明带、细胞质和细胞核发生一系列连续性的结构和分子方面的变化, 卵泡细胞扩散,卵泡破裂引起排卵。在体内,细胞核与细胞质的成熟基本是同步 的;而在体外,卵子的发育潜能往往因二者的不同步而受阻。有人提出通过阻滞 GVBD,使各卵母细胞发育同步化,核成熟与胞质成熟同步化。Smitz等【6J认为 卵母细胞的成熟能力在卵母细胞发育的最后阶段建立,且依赖于mRNA的储存。 因此延长IVM时间(GVBD之前)可提高必备的转录和翻译过程。 14 山东大学硕士学位论文 2.9卵母细胞核成熟与胞质成熟的同步化 人出生以后,卵母细胞保持阻滞在减数分裂的双线期(diplotenestage),此 阻滞作用的产生是由①卵母细胞与周围的颗粒细胞建立的相互联系使颗粒细胞 提供卵母细胞cAMP,使其保持在较高的水平②存在于卵泡液中的对减数分裂有 抑制作用的因子,如次黄嘌呤,体内成熟的阻滞作用保证了核成熟与胞质成熟 保持最佳的同步性。卵母细胞生长的过程中卵母细胞体积增大约50倍,伴随着 转录和翻译的进行,合成mRNA和蛋白质,为减数成熟和下一步的胚胎发育做 准备。在体内,卵母细胞对Gn反应重启减数分裂,达到MII期,而自窦卵泡 的GV期卵母细胞在体外可自发恢复减数分裂进展至MII期。这些体外成熟的 卵母细胞其受精、发育至桑葚胚和囊胚的能力远低于体内成熟的卵母细胞p1。 大体上,体外成熟卵母细胞低发育潜能的原因可归于①体外成熟培养条件的缺 陷②核成熟与胞质成熟的不同步【57'581。 卵母细胞行体外成熟培养时,存在两个不同步:①卵母细胞核成熟与胞质 成熟的不同步。体外成熟的卵母细胞核成熟早于胞质成熟,不完全成熟的胞质 中不能有力支持受精及进一步的胚胎发育。体内成熟过程中,卵泡中GV期卵 母细胞在卵母细胞发育的最后阶段获得减数分裂的潜能。这一阶段卵母细胞的 变化包括了GV染色质聚集,胞质中微管结构形成【591,转录并储存删[州A【60,61】, 合成并蓄积蛋白质【621,及翻译后的修饰[63】和超微结构的改变【641,为之后卵母细 胞成熟和受精、早期胚胎发育做准备。自窦卵泡中取出GV期的卵母细胞中断 了这一胞质的准备过程,使体外成熟的卵母细胞胞质缺陷。②各卵母细胞发育 的不同步。行体外成熟的GV期的卵母细胞取自大小不等的卵泡,处于发育的 不同阶段,卵子大小不同,卵丘细胞数目也不同,胞质中转录、合成、微管结 构组织情况也不同【65,66】,这也使得体外成熟中部分卵母细胞培养24h达到MII 期,部分36h成熟。 卵母细胞成熟是一个复杂的过程,外部因素对卵母细胞的内在质量有很大 影响,改善培养条件或可提高卵母细胞的发育潜能。有学者提出仿体内的减数 阻滞过程,先将取出的卵母细胞行预培养,推迟核成熟的过程,为胞质成熟提 供充裕的时间【671,使核成熟与胞质成熟更好得同步协调进行【681。 15 山东大学硕士学位论文 多种物质对卵母细胞的减数分裂有抑制作用,如可以提高细胞内cAMP水 平的药物、一些蛋白合成或磷酸化的抑制剂、卵泡液等等。这些用来阻滞卵母 细胞减数分裂的物质,必须满足两个条件:有效性和无害性。有效性是指在应 用减数抑制剂的预培养要有效阻滞卵母细胞在GV期。Carig等[69】在成熟培养 液中分别添加抑制剂:联丁酰基.cAMP(dibutyrylcAMP)、3一异丁基甲基黄嘌呤 (isobutylmethylxanthine,IBMX)、二联吡啶酮(milrinone,MR),在CEOs组卵母 细胞的自发成熟无明显影降低,在裸卵组(DO)IBMX和MR显著降低卵母细胞 的成熟率,而db-cAMP降低作用不明显。这无法满足研究对多种培养模式的需 求,有效性欠缺。无害性,是指添加抑制剂阻滞卵细胞减数的预培养不能造成 卵母细胞的退化增加,并且去除抑制因素后,卵母细胞减数成熟、受精和接下 来的胚胎发育不能受到不利影响。cAMP途径是体内卵母细胞减数阻滞的主要 机制。多种药物以不同方式作用于cAMP途径,阻滞减数分裂延长GVBD前的 培养时I'a-]170,71】。Anderiesz等【68】应用蛋白磷酸化抑制剂二甲基氨基嘌呤 (6-dimethylaminopurine,DMAP),有效抑制了卵母细胞的GVBD,并且其抑制作用 也可以完全去除,但DMAP的添加改变了鼠卵母细胞核成熟的动力学,并对卵母 细胞受精后的早期胚胎发育有不利作用,因此不能作为预培养抑制剂。其他选 择性更高的cAMP依赖激酶抑制剂如roscovitine和butyrolactoneI已被证明对 牛卵母细胞无毒害作用,Hashimoto等V纠的实验中培养基中加入FBS和在低氧 浓度下经BL.I减数分裂阻滞预培养,还可以有效提高卵母细胞发育潜能。这 些广谱或选择性更高的激酶或者磷酸化抑制剂是否会对胚胎发育相关的激酶的 活性有干扰作用,尚存疑问。 阻滞减数分裂推迟核成熟,保持卵母细胞内的cAMP于高水平可以算是有 效的方法u川,也是更加与体内机制相近的方法。去除阻滞因素后,卵母细胞的 成熟可以完全恢复不会对以后胚胎发育有不利影响u⋯。 卵母细胞发育的最后阶段与成熟促进因子(MPF)和有丝分裂原激活蛋白激 酶(mitogen.activatedproteinkinase,MAPK)的激活有关。MAPK在卵母细胞成熟 中可以促进GVBD,其作用的发挥通过增加MPF的活性。而cAMP可抑制MPF 活性,使MPF处于非活性状态,并抑制MPF亚单位cyclinB的表达,从而阻 16 山东大学硕士学位论文 滞卵母细胞减数分裂。cAMP水平下降,MPF活性增强,减数分裂重启。cAMP 是调节卵母细胞恢复减数分裂的关键分子。cAMP合成由腺苷酸环化酶 (adenylatecyclase)催化,由磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDEs)介导分解为 5'-AMP。PDEs是一个大的蛋白家族,至少11种基因型存在于哺乳动物中¨“, 部分PDEs的基因型还分为多种亚型和同型异构。其中两种基因型的PDEs同工 酶在卵泡中细胞特异性的表达,PDE4主要分布于颗粒细胞中代谢其中的cAMP, 卵母细胞中的主要表达是PDE3A【73’701。在卵母细胞减数分裂恢复之前,PDE3A 活性达到峰值,Richard等uu的研究表明在鼠CEOs体外培养中,PDE3A活性 在调节卵母细胞成熟中重要机制之一:在hCG作用后或自体内取出2h后, PDE3A的活性升高。两种情况下,PDE3A活性增升高都会介导卵母细胞减数分 裂的恢复。PDE的抑制剂阻滞卵母细胞的减数分裂,不论在体内还是体外。选 择性的PDE3A的抑制剂加入到培养基,应用于减数阻滞预培养,其对取出的 GV期卵母细胞的减数阻滞有效性非常高,在动物实验研究中,在含有 PDE3.I(Org9935)的培养基中预培养24h明显提高了鼠卵母细胞的受精率,较未 经预培养的卵母细胞,胞质质量得到改善,核仁周围型(surroundnucleolus,SN) 比例显著升高,对早期胚胎发育、 r78】。Nogueria等【79】将 PDE3.I应用于人卵母细胞的体外成熟,在24h预培养中添加PDE3.I(Org9935), 有效阻滞卵母细胞的减数进程,使预培养组的98%的卵母细胞停滞于GV期, 对卵母细胞的成熟率有改善,尤其对颗粒细胞紧密的CEOs。含PDE3.I的预培 养并未显著提高卵母细胞成熟后的受精率和优质胚胎率,但是扩展了可利用的 成熟卵母细胞的来源。这些结果显示应用PDE3.I控制卵母细胞核成熟,对卵母 细胞核成熟与胞质成熟的同步性起到了作用,但体外成熟的预培养也遇到了问 题,就是卵母细胞与周围丘细胞的缝隙连接的保持。 在卵母细胞体外成熟培养中,相当~部分卵母细胞在经过24h或48h的预 培养后会部分裸露,甚至变成裸卵,而且卵母细胞与丘细胞的联系会变得稀疏, 简单机械吹打即可去除颗粒细胞uo。。在成熟过程中,卵母细胞与丘细胞的相互 联系会影响卵母细胞的胞质成熟和之后胚胎发育的潜能,卵母细胞与丘细胞之 间的联系持久,可以使卵母细胞获得较高的发育潜能【80,81】。研究者不断调整培 17 山东大学硕士学位论文 养条件,尽力维持卵母细胞与丘细胞的联系,以有利于卵母细胞成熟,获得好 的培养结果。 培养条件的缺陷,不足以支持整个预培养中卵母细胞与丘细胞之间的联系。 向培养基添加特定生长因子、酶类和其他分子,更加与体内环境相近,使其适 应卵母细胞体外成熟及减数阻滞中发育需要。Vanhoutte等【82】将卵母细胞置于 不同浓度凝胶培养基中,通过这种三维培养系统对CEOs培养,取得不错的效 果。之前研究【78】中,相当一部分卵母细胞(占预培养组中近65%,对照组62%) 在体外培养24.48h后部分裸露的情况,三维预培养(3D.PMC)24h后,不到40% 的卵母细胞在自凝胶培养基中取出再体外成熟培养24h中自发裸露。3D—PMC 对卵母细胞与丘细胞之间缝隙链接的维持起到了非常显著的作用。动物实验中, 鼠卵母细胞在经过3D.PMC后其卵裂率相比于2D.PMC组与体外对照组,有显 著改善。在人卵母细胞的体外成熟试验中,卵母细胞经3D.PMC其成熟率、受 精率、卵裂率虽无明显的升高,但其扩展了可利用卵母细胞的来源,并对ICSI 后三天胚胎的质量相对于体外自然成熟卵母细胞组有改善。 另外一种维持卵母细胞与丘细胞缝隙链接可行的方法为用其他的途径保持 细胞内的高的cAMP水平。预培养中将卵母细胞暴露在PDE3.I可使得卵母细胞 内cAMP浓度升高【831。数个研究【82,84】已证明升高的细胞内的cAMP水平对卵 母细胞与丘细胞间缝隙链接的相互交流联系有促进作用,而这一作用在腺苷酸 环化酶激动剂与PDE3.I联合作用增强【80,85,86】。 目前为止的研究,体外成熟组的卵母细胞的情况仍然逊于体内对照组,体 外培养条件的改善不能纠正所有的发育所需的缺陷。这就需要对卵母细胞成熟 机制更深一步的研究来改善培养条件,使体外培养更接近体内环境,获得好的 培养结果。 3.临床方案 3.1促排卵激素的应用 IVM周期是否使用外源性的促性腺激素进行超排卵,近年来也受到学者的广 泛关注。Mikkelsen等【87】对实验组自第3天开始予FSHl50IU,连续使用3d,卵子 18 山东大学硕士学位论文 成熟率、受精率、妊娠率与对照组并无明显差异。而在另一个试验【88]中对pcos 患者应用同样的方式注射FSH,显著提高了成熟率和妊娠率。与之一致,Chian 等【89】的研究PCOS患者在获取未成熟卵母细胞前应用hCG,可以缩短卵母细胞体 外成熟所需的时间,提高卵母细胞成熟及发育的潜能,还能提高妊娠率。目前的大 部分被实验室进行卵母细胞培养来源于刺激周期,有研究【90,91】认为经FSH处理, 所回收的卵母细胞在体外发育的能力是不同的。少量的FSH促进妇女卵巢内卵 泡的生长发育,获取未成熟卵母细胞,在体外有较强的发育能力,形成胚胎移植后 临床妊娠率较高。另外研究指出,未经激素处理的未成熟卵母细胞经IVM后也可 获得健康婴儿出生,FSH*U激对于IVM或许可以提高卵母细胞的成熟率,但对接 下来的胚胎发育没有益处【92,93】。对于FSH,有上述不同结果可能由于作用时机、 作用剂量或者实验室培养条件不同,使得结果不同,需进一步研究。但Schramm 等[K】研究发现,未经激素处理的患者获取的不成熟卵母细胞常有染色体退化现 象,可能与卵泡闭锁有关。Suikk撕等【91】在卵泡直径<10姗时给予小剂量FSH (37.2IU),平均获卵数11.5,获卵数高于自然周期。因此应用FSH即使不提高 可利用的胚胎率,但由于获卵总数上的增多对卵母细胞体外成熟发育也是有利 的,也是有价值的,可以提高总的可利用胚胎的数目。 对于hCG,Chian等【94】的研究在取卵前予hCG10000IU,可以提高PCOS 患者卵母细胞体外成熟率和临床妊娠率,认为对hCG的使用不仅提高了成熟率, 还加快了成熟进程。Gulekli等【95】发现10000IU即可以提高体外成熟率,提高剂 量至20000IU成熟率并未相应增加。注射hCG可以诱导LH峰的出现,准备子 宫内膜,使子宫内膜与胚胎同步发展【961。 3.2取卵的时机 取卵的时机一致被认为会影响IVM的最终结局,目前对此问题还存在分歧。 有研究【97,98】认为增生期收集的卵母细胞体外成熟率高于分泌期收集的卵母细 胞,故趋向于增生期取卵。Mikkelsen等【99】通过监测E2和抑制素A的血清浓度来 确定取卵日,当其浓度较月经第三天的基础水平分别升高100%和80%时,未成 熟卵的成熟率、妊娠率显著提高。 19 山东大学硕十学位论文 成熟卵母细胞的直径是反映其是否具有恢复减数分裂,发育成熟潜能的重 要指标,卵母细胞直径小于105lam的只有1/3恢复减数分裂,而直径大于105lam 的有2/3可恢复减数分裂和完成成熟卜1。研究表明,人类卵子在继续减数分裂和 完成IVM的能力上存在卵泡大小依赖性,在未发生卵泡优势化前,随着卵母细 胞直径的增大,其恢复和完成减数分裂的能力也逐步提高;但也有研究发现当 主卵泡达14ram时取卵,所获卵子的成熟率和受精率均大大下降。目前自然周期 或者小剂量刺激周期卵母细胞体外成熟培养时,要在早、中卵泡期行卵泡监测, 在卵泡直径≤10聊,尚未发生优势化时取卵,认为卵泡优势化以后,部分卵泡虽 然无形态学改变但是已启动了退化程序,降低IVM的成熟率。 Cobo等【100】研究发现在月经规律的患者中主导卵泡≤10咖组与>10衄组相 比,成熟率、受精率无明显差异,但是前一组卵母细胞受精后可利用胚胎率高 于后一组。但也有研究【101】认为卵母细胞发育潜能并未受卵泡优势化的影响。 所以深入了解卵子发育的调节机制对提高IVM成功率有重要意义。 3.3内膜的准备 目前研究者普遍认为在黄体期支持治疗对IVF.ET的妊娠结局可产生有利 的影响。在临床工作中,如何提高临床妊娠率和胚胎种植率一直是研究的
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