肺癌、乳腺癌易感性的分子流行病学研究

肺癌、乳腺癌易感性的分子流行病学研究 蒋东华 【摘要】： 前言 肺癌是最常见的恶性肿瘤，也是肿瘤死亡率中的首位死因。虽然烟草烟雾在肺癌病因学中的作用已经得到了公认，但却只有大约15％的吸烟者成为肺癌患者，提示个体间存在肺癌易感性差异。为保持基因组稳定性，细胞进化出DNA修复能力(DRC)。DNA修复是一个复杂的系统，有多条路径及多种酶参与其中，损伤形式不同则修复方式也大不相同。在哺乳动物中DNA修复方式主要有碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、错配修复(MMR)、同源重组修复(HRR)和非同源末端连接(NHEJ)。因为人体细胞常常受到内、外源性基因毒性化学物的攻击，给定时间内DNA修复系统修复损伤的程度成为关键问题。宿主细胞再复活分析(HCR)方法可检测细胞的整体DRC。HCR分析使用带有氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的质粒。该质粒被物理或化学因素破坏后，CAT就不能表达。将经处理和未经处理的质粒转染进入宿主细胞，检测CAT的表达差异。用破坏质粒／未破坏质粒基因表达的比值表示细胞的DNA修复活性。针对DNA修复系统的单核苷酸多态性(SNPs)研究很多，由于单一基因SNPs效应较弱而不适合作为肺癌易感性的标志物。而DRC检测涉及多重步骤，多个基因，将其作为肺癌易感性的标志物的意义将大于单个基因的SNPs。 目的 本研究旨在使用HCR方法检测研究对象的DRC，探讨DRC与非小细胞肺癌(NSCLC)易感性的关系，为筛检高危人群，进行肺癌一级预防提供理论依据。 方法 本研究采用病例对照研究方法，包括原发性NSCLC 107例，正常对照117例。按性别、年龄(±5岁)和吸烟状况进行频数匹配。采外周血分离淋巴细胞，存放于-80℃。用UVC(254nm)处理pCAT-control质粒，剂量分别为OJ／m~2和800J／m~2。分批次复苏淋巴细胞，植物血球凝集素(PHA)刺激下培养72h后用DEAE-葡聚糖方法转染质粒。转染后44h提取细胞裂解物存放于—80℃。解冻的细胞裂解物与~3H-氯霉素作用后，用液体闪烁计数仪检测闪光数。每个样本的DRC(％)=(受损质粒闪光数／未受损质粒闪光数)×100％。将DRC作为一个连续变量比较病例与对照差异。以对照组DRC值的中位数作为分割点，将研究对象分为DRC优和DRC差两组，估计其作用于各组织学类型的OR值。以对照组吸烟指数的中位数作为分割点，将研究对象分为轻度吸烟者和重度吸烟者两类，估计其作用于组织学类型的OR值。并估计DRC与累积吸烟量联合作用于各病理类型的OR值。 结果 1、一般性结果分析 病例与对照间性别、年龄和吸烟者以及吸烟指数均无统计学差异。对照组平均DRC为9.04％，显著高于病例组的7.73％(P＜0.001)。按性别和年龄(60岁)分层后，各层中对照组的DRC均显著高于病例组。在病例和对照中，男性的DRC均显著高于女性。在按年龄分层的比较时，对照组中低年龄组DRC显著高于高年龄组，而病例组中则未见此种差异。提示个体DRC与性别和年龄有关。按吸烟状况分为非吸烟者、戒烟者和吸烟者三层。按对照组吸烟指数中位数分为轻度吸烟者和重度吸烟者两层。各层中对照组DRC均显著高于病例组，而病例组和对照组内部则未见显著性差异。按不同组织学类型、病理分期和分化程分层后发现各层DRC均显著低于对照组。 2、DRC和累积吸烟量作用于NSCLC及其各组织类型的危险度 (1)将研究对象分为DRC优和DRC差两组，分别在不同的层次中考察其与各组织类型的危险度的关系。NSCLC及其各组织类型的危险度均与较差的DRC有关。NSCLC的OR为4.026(2.211-7.329)，腺癌的OR最低，为2.949(1.397-6.225)，其次为鳞癌5.196(2.144-12.596)，其他类型最高，为6.390(1.381-29.574)。按吸烟指数中位数分层，重度吸烟者罹患NSCLC的OR为2.227(1.284-3.860)，腺癌最低，为2.265(1.078-4.758)，其次为鳞癌，3.195(1.448-6.864)，其他类型最高，为3.800(1.019-14.169)。 (2)将研究对象按照DRC状态和累积吸烟量分为四类：DRC优+轻度吸烟组(对照组)，DRC优+重度吸烟组，DRC差+轻度吸烟组和DRC差+重度吸烟组。与对照组相比，DRC差+重度吸烟组OR最高，NSCLC的OR为7.154(2.960-17.290)，腺癌最低，为4.673(1.659-13.164)，鳞癌为7.615(2.032-28.537)，其他类型最高，为11.423(1.376-94.860)。在DRC差+轻度吸烟组中则只有鳞癌具有显著性意义，OR为4.091(1.071-15.621)。提示DRC低和累积吸烟量高是NSCLC的重要危险因素，尤其DRC低且累积吸烟量高的个体危险度最高，提示DRC与吸烟间存在交互作用。 结论 DRC低是NSCLC及其各组织学类型的重要易感因素。DRC与累积吸烟量的联合作用会增加这两个因素单独作用于NSCLC的危险度。DRC越低，累积吸烟量越大的个体肺癌易感性越高。 前言 在细胞遭受的多种损伤中，DNA双链断裂(DSBs)可能是最为严重的一种。针对DSBs修复的研究发现，组蛋白H2AX在DSBs修复过程中发挥着重要作用。在修复初期会在Ser139位点迅速发生磷酸化，生成γ-H2AX。大规模的磷酸化会形成核焦点(NF)，且γ-H2AX NF与DSBs在数量上存在一一对应的关系。 细胞受到DSBs损伤后迅速出现γ-H2AX，达到一个峰后在酶的作用下γ-H2AX会逐渐去磷酸化，NF数量逐渐消退。γ-H2AX的磷酸化-去磷酸化动力学过程与DSBs修复过程的一致性表明γ-H2AX与DSBs修复之间存在着重要的关联。损伤初期γ-H2AX出现越早，达到的峰值的时间越短，修复后残留的NF越少，则细胞修复DSBs的能力越强。组蛋白磷酸化可使DSBs周围修复因子聚集规模的扩展和保持更为容易。γ-H2AX在DSBs损伤修复中的这些作用表明其对保持基因组DNA的完整性起着重要作用。以往研究多使用免疫荧光与电脑图象分析相结合的方法检测个体细胞中γ-H2AX的表达情况，这种方法虽然比较精确但是工作量相对较大，不适合在以人群为基础的大型研究中使用。 目的 本研究是一项人群分子流行病学研究的前期实验室工作，旨在使用操作流程简单的流式细胞仪(FCM)方法分别检测X-射线照射和顺铂溶液处理后不同时点肺腺癌A549细胞系中γ-H2AX的表达量，定量反映γ-H2AX的动力学变化情况。为今后在人群研究中的应用该技术提供实验基础。 方法 使用FCM(BD公司)和Upstate公司的FCM用H2AX试剂盒进行检测。细胞传代后72h，更换新鲜培养基，置于X-线下照射。照射源能量6MV，照射视野为40cm×40cm，源皮距为100cm，剂量率为200cGy／min，照射剂量分别为2、5、10、15、20Gy。照射后于孵箱中孵育0.5、1、2、4、6、24h后上机分析。用完全DMEM培养基稀释1mg／ml顺铂母液，终浓度分别为2、4、6、8和10μg／ml。细胞传代后72h，用含不同浓度顺铂的DMEM培养基换液，培养0.5、1、2、4、6和24h后上机分析。 结果 1、X-线照射A549细胞后，γ-H2AX表达的动力学 各剂量组中0.5h时点检测到的γ-H2AX百分比为最高，说明可能在0.5h以内已经达到峰值。之后，各剂量组γ-H2AX表达的百分比都开始下降，2Gy和50y剂量组下降速度很快，而10Gy和15Gy剂量组下降相对缓慢，20Gy速度适中。随后除了156y剂量组出现了一个平台期而下降缓慢外，其他各组则迅速下降。至24h时，2Gy剂量组的表达水平低于对照组；15Gy和20Gy两组与对照组接近；而5Gy和10Gy两组却保留了相对高的残余γ-H2AX。 2、顺铂处理A549细胞后，γ-H2AX表达的动力学 各剂量组的γ-H2AX表达峰值均出现在2h-4h之间，相对X-线处理组滞后。在2μg／ml和41μg／ml剂量组从药物处理后0.5h到24h的时间范围内γ-H2AX的表达水平出现了波动但没有明显的变化。在6μg／ml处理组，γ-H2AX表达于2h左右达到峰值，6h左右已与对照组接近。而8μg／ml和10μg／ml组则在在24h时残留了较高水平的γ-H2AX。 结论 使用FCM检测γ-H2AX可以在细胞暴露于与DSBs有关因素后，作为修复过程中的敏感指标，指示相关的动力学过程，将γ-H2AX的表达准确量化。同时因为这种方法简单快速，在检测个体对治疗的敏感性方面具有临床应用潜力。 前言 乳腺癌是西方女性中常见的疾病，在白人中发病率很高，从1／8到1／12不等。过去的几十年中，随着分子生物学的迅速发展，乳腺癌的遗传易感性研究已取得很多重要进展。1990年Hall等人用DNA序列多态性方法乳腺癌家族中存在遗传连锁，乳腺癌的遗传易感性得以解释。来源于双生子、受影响个体、对侧乳腺肿瘤发生率、以及家族遗传模式等方面的研究结果也表明遗传因素在乳腺癌的发病中占据主导地位。虽然大量研究表明BRCA1基因与乳腺癌发病密切相关，但是由于一种因子的单一效应并不明显，它不可能解释大部分危险度，几种因子的联合作用模型似乎能更好地解释乳腺癌的危险度。对于乳腺癌来讲，遗传倾向性可能主要来源于几个不同位点上遗传变异的联合效应。Kammerer等人为了确认影响乳腺癌危险度的遗传变异，分析了定位于16，000个基因上超过25，000个单核苷酸。研究指出，染色体19p13.2-19p13.3上细胞间粘附分子(ICAM)基因座位上的几个单核苷酸多态(SNPs)变异与乳腺癌危险度升高有关。本研究以Kammerer等人的研究为基础，分析加拿大多伦多地区高加索妇女中ICAM5基因的SNPs位点与乳腺癌危险度之间的关系，以及ICAM5基因SNPs与BRCA1基因相互作用对乳腺癌危险度的影响。 目的 探讨ICAM5基因SNPs与乳腺癌危险度之间的关系，以及这些SNPs与BRCA1基因相互作用对乳腺癌危险度的影响。 方法 研究对象为1034名女性乳腺癌病例和1091名非恶性肿瘤患者对照。使用Gentra DNA提取试剂盒从外周血标本中提取基因组DNA。采用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱检测技术(MALDI-TOF)对ICAM5基因的三个SNPs进行检测分型。以等位基因和基因型频率为基础，使用x~2检验异质性，运用个体基因型进行关联分析。用x~2检验评估病例组和对照组之间ICAM5基因SNPs分布的差异以及BRCA1携带者各SNPs分布与非携带者是否具有差异。用logistic回归模型调整潜在的混杂因素后，用OR值和95％可信区间测量ICAM5基因SNPs与乳腺癌危险度之间的关联强度以及ICAM5基因与BRCA1相互作用对乳腺癌危险度的影响。 结果 rs1056538位点携带C等位基因对个体患乳腺癌具有保护作用(OR_(CT)=0.3423，95％CI：0.2351-0.4982；OR_(CC)=0.5943，95％CI：0.3899-0.9058)，而rs2228615AG和rs281439GG基因型个体则有较高的危险度发生乳腺癌(OR_(rs2228615AG)=2.6771，95％CI：1.4938-4.7976；OR_(rs281439GG)=1.9845，95％CI：1.0287-3.8285)。对于携带BRCA1突变的个体，与全部研究对象所得的结果相比，rs1056538位点携带C等位基因的保护作用更为明显(OR_(CT)=0.2797，95％CI：0.1984-0.3321：OR_(CC)=0.4983，95％CI：0.3942-0.7211)，rs2228615位点携带G等位基因的危险度更高(OR_(AG)=3.3369，95％CI：1.9195-5.8009；OR_(GG)=2.0289，95％CI：1.1704-3.5170)，而rs281439GG基因型危险度改变不大。 结论 ICAM5基因SNPs与乳腺癌危险度有关。ICAM5基因与BRCA1基因间存在相互作用，影响了乳腺癌的危险度。 【关键词】：DNA修复 肺癌 易感性 DNA断裂 DNA修复 组蛋白H2AX 乳腺肿瘤 细胞粘附分子 BRCA1 多态性 【学位授予单位】：中国医科大学 【学位级别】：博士 【学位授予年份】：2007 【分类号】：R734.2;R737.9 【目录】： · 一、摘要6-23 · 中文论著摘要6-13 · 英文论著摘要13-23 · 二、英文缩略语23-24 · 三、论文24-77 · 论文一 DNA修复能力与非小细胞肺癌危险度24-43 · 前言24-25 · 材料与方法25-32 · 结果32-35 · 讨论35-39 · 结论39-40 · 参考文献40-43 · 论文二 A549细胞系外暴露损伤后γ-H2AX表达的动力学研究43-70 · 前言43-45 · 材料与方法45-47 · 结果47-63 · 讨论63-68 · 结论68 · 参考文献68-70 · 论文三 ICAM5基因多态性与 BRCA1相互作用对乳腺癌危险度的影响70-77 · 前言70 · 材料与方法70-72 · 结果72-74 · 讨论74-75 · 结论75 · 参考文献75-77 · 四、本研究创新性的自我评价77-78 · 五、附录78-93 · 综述78-91 · 在学期间科研成绩91 · 在学期间参加培训及学术交流活动91-92 · 致谢92-93 · 个人简介93