纳豆激酶的研究进展

Food Sele and ire inolo~y No．2，2002 一壁簦塑墨——一 l必 ⋯ 纳豆激酶的研究进展 2002阜第二期黜 滗 陈志文 徐尔尼 肖美燕 (南昌大学生命科学与食品工程学院 330047) Study on Nattokinase CHEN Zbi Wen XU Er——ni XIAO Mei——yan (College of Biological Science and Food EnDnee6ng，NanChang University，330047) Abstract：Compared with SOII1~~traditional thrombolytics nattokinase，which is found to he a strong fibdnol~tie enz~'nle is safer and lower—cost It is effective bv oral administration．and e．xpected to be a new thrombolytics Its isolation、purificatio rt and character— istlcs are introdneed in this paper The newly studies on its aclH】ty detection、stability factors and hi曲 output are also summed in this paper Key words：nattokinase，activity detection，stalfility factors，high output ； 摘要：纳豆澈酶有根强的溶血栓能力，跟传统的一 i些溶拴剂相比，具有安全性好、成本低、口服有效等 j优点，极有．q-~g开发为新一代的溶栓剂。介绍了纳豆 l澈酶的分离纯化技术、生化特性，并时纳豆澈酶的活 {性剖定方法、影响纳豆激酶稳定性的因素及提高纳 {豆澈酶酶产量的几种途径等最新研究成果进行了综 { 关键词：纳豆激酶；活性测定；稳定性因素；高产量 中图分类号 ：TS201．2 5 文献标识码：A 文章编号：1005—9989(2002)02一O066—03 0 前盲 纳豆激酶 (nattokinase)是一种在纳豆发酵过程中 由纳豆菌 (Bacillus natto)或纳豆枯草杆菌 (Bacillus subtilis natto)产生的丝氨酸蛋白酶，它可分泌到细胞 外。纳豆激酶具有很强的纤溶活性，它不但能直接作 用于纤维蛋白，而且还能激活体内纤溶酶原，从而增 加内源性纤溶酶的量与作用，因此现出较强的溶血 栓作用 ”】。人体内的血栓常引发脉管桂塞、脑血栓中 风、急性心肌梗塞等严重的心血管疾病，尤其会对中 老年人的身体健康造成很大的危害，全世界有血栓患 者 1500万．潜在的溶栓剂市场有2O亿美元。但当前的 溶栓剂，如尿激酶、链激酶、重组组织型纤溶酶原激活 剂等，存在半衰期短、副作用大、价格昂贵等种种缺 点，难以成为适用的大众药品。而纳豆激酶具有安全 性好、作用迅速、成本低、可由细菌发酵生产等优点， 故而用于开发新一代的溶栓剂或保健食品，具有极为 诱人的广阔前景 收璃 日期 ：2t}0I一10—23 作者简介：陈志文(1972一)，男，江西丰城^，在读研究生 研究方向南工业微 生曲 。 1 纳豆激酶的生产 纳豆激酶最初是从纳豆中发现的，目前生产纳豆 激酶仍采用传统的纳豆生产方式．不过进行了一定的 改进。纳豆的具体制作步骤是：太豆一浸泡过夜一煮 熟灭菌一摊凉一接入菌种发酵一蚋豆I I。将制备好的 新鲜纳豆，用无菌生理盐水浸提两次，台并提取液。此 外 ，另有一种生产纳豆激酶的方法 ，即流体发酵法 其 基本步骤为：培养基灭菌一冷却一接入菌种一发酵 液。取发酵液离心，收集上清液I I。 然后，通过液体发酵法得到的纳豆激酶上清液或 通过固体发酵法获得的纳豆激酶提取液，再经过乙醇 沉淀，去除粘性物质——主要成份是果糖和多聚各氨 酸，从而得到纳豆激酶的粗酶液。 2 纳豆激酶分离、纯化及生化特性 2．1 纳豆激酶的分离、纯化 取纳豆激酶的粗酶液，经过滤、离心、盐析等步骤 分离提纯。为了得到纳豆激酶的单一酶，还必须用层 析来进一步将其分离纯化。首先，用 Sephadex G—l00 柱层析对其分离，用0 lmol／L PBS一0．2mol／L NaC1、 pH7．4缓冲液平衡洗脱，收集峰馏份，电泳检查，通常 发现会出现多条带 然后，将收集的峰馏份浓缩，再用 Sephacyls一200柱层析进一步分 离纯化 ，缓 冲液为 0．1mol／L PBS一0 5mol／L NaC1 pH7．4，最终得到的 单一吸收峰经渗析过夜后，冷冻干燥，制成酶干粉。 2．2 纳豆激酶的生化特性 由于测定方法的不同，测得的纳豆激酶分子量由 27300到 35000不等。但根据测出的纳豆激酶的基因 DNA序列，推定出纳豆激酶序列为一条由275个氨基 酸残基组成的单链多肽，并算出其准确分子量为 27728。其氨基酸序列与其它枯草杆菌蛋白酶的氨基 酸序列相比．表现出了较高的同源性；它与枯草杆茁 蛋白酶 E有 99 5％的同源性，与枯草杆菌蛋白酶 A 维普资讯 http://www.cqvip.com 越_j2002年第二期 Food Scienee and Technoloe~Nt1．2．2002 有99 3％的同源性。纳豆激酶的活眭部位在 Asp32、 Hls64、Set221，与底物结合部位在 Serl25、Leu64、 GIv127处，对纳豆激酶最敏感的底物是 Sue—Ala— Ala—Pro—P A，其次为 H—D—Val—Leu一 s—P A， 该酶对底物S一2238、S一2302也有一定活性=纳 激 酶的活性不受 5retool／L Cys的影响，但 1mmol／L DFP 和 5mmol／L Neguvon则能完全抑制该酶的活性 ，故知 其为一种丝氨酸蛋白酶。它的等电点(PI)为 8 6±0．．．一 3 纳豆激酶的活性测定 纳豆激酶的测定方法有五种：纤维蛋白平板法 、 纤维蛋白块溶解时间法 0、四肽底物法 、血清板法、酶 联免疫吸附法”1 纤维蛋白平板法：该法参照 Astrup(1952}的力法． 并进行了一定的改进。将纤维蛋白源溶液、凝血酶溶液 按一定比例倒人无菌平皿中，小心振荡摇匀 ．室温凝固 制成平板。在平板上分别点样纳豆激酶 尿激酶 ，37℃ 孵育 1 8h后，测量纳豆激酶相对于尿激酶的活性单 位。本法最常用，但易受孵育时间影响。 纤维蛋白块溶解时间法：0 下，将凝血酶 、硼酸生 理盐水缓冲液、纤维蛋白原及纳豆激酶溶液加入试管 中，强烈搅拌 ．置于 37℃恒温水浴中，从纤维蛋白形成 起开始计时，至气泡冒出停止时为止，所用时间即为纤 维蛋白溶解时间。该方法迅捷，适于粗酶的活性测定， 但精度不够，且不适合多个样品的同时测定： 四肽底物法 ：在四肽底物 Sue—Ala—Ala—Pro— Phe—PNA溶液中加入纳豆激酶酶液，37℃水浴中孵育 lmin，测定单位时间内410rma处光吸收的变化。1 rain 水解法四肽底物生成 1 L硝基苯胺的纳豆激酶量为 1u。该方法简便、迅速，但是所测得的蛋白酶活性不能 完全表示为纤溶活性。 血清板法：将血清板制成微型纤维平板，然后在每 个孔内加入不同浓度的纳豆激酶，反应开始后 4h 内，每30mln测定一次OD一，作出吸光度的减少同纳 豆激酶浓度的线性关系。这是一种改进的纤维平板法． 可同时测多个样品，简便、快捷、成本低。 酶联免疫吸附法(ELISA J：将纳豆激酶的单克隆抗 体吸附在微孔板上，BSA—PBS冲洗并封堵未被吸附的 部位，加入纳豆激酶，与单克隆抗体结合，孵育2h后， 再加入连有过氧化氢酶的多克隆抗体与两者结合=然 后加入新配制的底物，孵育 lOmin，再加人 1tool／L H SO ，测定 490nm下的光吸收值。该方法特异性强，灵 敏度高达0．1mg／mL，既可测量纳豆激酶的量，又可测 定纳豆激酶的纤溶活性，但操作复杂、成本高。 4 影响纳豆激酶稳定性的因素 对纳豆激酶稳定性产生影响的因素有：温度、pH 值、金属离子、有机物等： 温度：纳豆激酶在低于 45℃时 ，活性相对稳定；在 40℃下 ，30rnin内没有酶活性丧失；60℃以上 ，酶则迅速 变性失活：lf日反复冻融对酶活性影响不大 【反复冻融 五 次，酶活性仍可保留 95％}= 口H值：室温下 ．在 pH4～12范围内，废酶酶活性稳 定 ；pH7～9范围内酶活性最为稳定；pH6 3～l0 8范 围内．其活性可持续近 40d之久 。带牯质(多聚爸氧 酸)的粗酶液在pH3以下仍有活陛。 金属离子：ng： 使纳豆激酶完全失活 ．而 Mg 和 co： 对废酶有明显激活作崩： 有机物 ：添加甘油 丙二醇、海藻酸钠 、牛血清蛋 白、蛋白胨和明胶等有利于保持酶活性 ，并能提高酶的 热稳定性 (明胶可提高 5倍以上)；煮沸的小麦提取液 或肉汤冷却后与纳豆激酶混合后也可明显提高该酶的 稳定性。 5 提高纳豆激酶产量的选径 由于纳豆激酶具有 目前正在使用的一些溶栓剂所 无法比拟的优点，因此，人们渴望能将其开发为新一代 的溶栓剂。但从 目前的研究情况来看．纳豆激酶的产量 还不高，难以满足需要．故而，要将其开发为实用的新 型溶栓剂，提高纳豆激酶的产量就变得非常关键 ：常用 的提高纳豆激酶产量的途径有三种：通过对野生菌种 的筛选 、诱变，挑选出产酶量高的菌种；优化纳豆的发 酵条件；通过工程技术改造纳豆激酶的基因，得到产酶 量高的工程菌。 5．1 菌种的筛选 从不同来源的 (稻草 、土壤、产酶活力高的纳 豆)之巾，筛选出各种纳豆苗．再经物理与化学因素的 诱导，从中筛选出产纳豆激酶酶量高的忧质纳 菌。据 报道，纤溶酶产生菌经紫外线与亚硝基胍复合诱变，其 纤溶酶产量较初发菌株提高了27．2％=因此通过对纳 豆菌的诱变来提高纳豆激酶 的酶活力，也应该是一种 非常有效的方法。 5．2 发酵条件的优化 5 2 1 固体发酵条件的优化 取纳豆苗接种蒸煮后 的大豆，分别置不同温度下进行发酵，24h后提取粗 酶液，测定酶活力 ，发现最适宜产酶的温度是 30℃， 其次是 37 ，后者相对酶活力为前者的 95％。取纳 豆菌分别在 30、37℃下发酵蒸煮的大豆．每 12h取样 测定酶括，发现两种温度下发酵24h，产酶量达到最 高。 虽然 30℃下酶活性略高于 37℃下的，但 37℃下产 酶早于前者，且酶活力保持时问长，因此 37℃为最佳产 酶温度，24h为最佳产酶时间 1。 5．2．2 液体发酵条件的优化 氮源：大豆渣、豆浆 、胰蛋白胨 、大豆蛋白胨作为氮 源 (2％J都能产酶。其中大豆蛋白胨作氮源时 ．产酶量 高而且发酵时间短。大豆渣作为氮源好于豆浆=胰蛋白 胨不能作为纳豆菌产纳豆激酶的氮源，而硫酸铵 、硝酸 铵等无机盐均不能维持该菌生长和产酶。 维普资讯 http://www.cqvip.com Fo0d Science and Te nofogv No．2，2002 碳源：木糖作碳源效果最好，在第 4d产酶量最 高。葡萄糖、麦芽糖、蔗糖的产酶量差异不大，葡萄糖 在第3d为产酶高峰期外．其余二者均在第4d为产酶 高峰期。果糖不能用作纳豆菌产酶的碳源。经研究发 现，当碳源含量为 2％ 、氯源含量为 3％时，纳豆菌产酶 最佳： pH值：当培养基pH值为7．0时，纳豆菌生长最 好，产酶量最高。当培养基pH值超过7 0时有沉淀产 生，酶话性急剧下降。 温度：当发酵培养基温度保持在 30~C时产酶量最 高。 接种量 ：接种 2d后 ，测定细胞量，发现当接种量 为3％时，纳豆菌生长最好：接种 4d后，测定产酶量，发 现当接种量为2％时，纳豆菌产酶量最高。无论是纳豆 菌的生长还是产酶，都以种龄为24h的菌种接种最好。 氧：无论是细胞量还是产酶量 ，都随发酵三角瓶 中培养基装量的增加而减少 ，表明溶氧量的增加有利 于细胞的生长和产酶： 5 3 基因工程技术的应用 随着对纳豆激酶了解的逐渐深人，人们 已经开始 有意识地将基因工程拄术引人到对纳豆菌产酶基因的 研究中，并取得了一定的进展。张淑梅等利用 PCR技 术，从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组DNA中扩增得 到了纳豆激酶的基因，利用基因重组技术构建 了纳豆 激酶基因的表达载体，并在大肠杆菌中进行了表达： 事先设计并合成进行 PCR扩增所需的两个引物： 引物 1：5 CGCTGAA'ITCATGGCGCAATCTGTFCCT3 ； 引物 2：5 AGGcGTcGAc1TrAT1℃TGcAGCTGc_rrG3 。 纳豆菌培养过夜后，将纳豆菌菌液在4℃下离心，再收 集菌体，并提取其基因组DNA。首先，对目的基因进行 PCR扩增：以基因组 DNA为模板 ，进行 PCR扩增，反 应进行了35个循环，得到扩增产物。其次，对 目的基因 进行克隆：将 PCR扩增产物与质粒 pUC19分别用 E coRI／SalI双酶切，纯化后按 2：1比例连接，之后转 化感受态 E．coli JM103细胞 ，筛选阳性重组子 ，提取该 重组子质粒 DNA，用 E．coR I／Sal I进行酶切鉴定。最 后，构建表达载体并鉴定表达产物：从 pUC19一NK质 粒上切下纳豆激酶基因，将其与经过 E．coR I／Sal I双 酶切的pRIT2T质粒DNA按 2：1比例混合，加T4 DNA 连接酶连接，再转化感受态 E．coli N4830细胞，筛选阳 性重组子 ，提取其质粒 ，用 E．coR I／SalI进行酶切鉴 定。阳性重组子培养过夜，次 日接种于 SOB培养液中。 培养并离心，收集菌体，用 IxSDS裂解液裂解，SDS— PAGE法鉴定表达产物。结果表明，表达蛋白占菌体总 蛋白的 15．2％ 此外，人们还研究了通过改造纳豆激酶的基因，从 而改变纳豆激酶的分子结构，来进一步提高纳豆激酶 2002年第二期金i 的酶活力、热稳定性，并延长其半衰期。比如通过定点 突变的方法，改变了纳豆激酶的氨基酸拘成，并引人双 硫键，使纳豆激酶的半衰期提高了2～3倍、热稳定性 提高了4．5~C、催化效率提高了2～6倍： 6 纳豆激酶的应用前景 自日本的须见洋行于 1987年从日本的传统食品 纳豆中发现纳豆激酶以来，人们已经对纳豆激酶进行 了广泛的研究，分离出了纯酶，测出 r纳豆激酶的氨基 酸顺序及其基因序列，对其生化特性有了详尽的了 解。人们还进一步对纳豆激酶的药理进行了研究，在对 鼠的十二指肠给药纳豆激酶的实验中，发现纳豆激酶 可以被 鼠的消化道吸收，并在鼠的体内产生了溶栓效 应 ；在对其他动物的实验中也表现出了相似的溶栓效 果。进一步作了人的口服纳豆激酶实验，同样表现出了 良好的溶栓效果，它不但能直接作用于纤维蛋白．而且 还能激活体内的纤溶酶原。跟传统的溶栓剂相比较，纳 豆激酶具有许多优点，具体表现在：纳豆激酶是通过食 品发酵得到，安全可靠：纳豆激酶分子量小，其粗酶液 在 pH3 0下仍有一定活性 ，故可通过消化道直接吸收； 另外可以通过液体发酵获得，成本较低。因此 ，纳豆激 酶作为良好的溶栓剂，具有广阔的开发前景。日前．在 溶栓剂的开发方面，已有人作了纳豆激酶的中试研究。 由于纳豆激酶蕴藏着巨大的市场价值 ，引起了人 们的广泛兴趣，在对与纳豆相似的一些食品进行的研 究中，发现在韩国的发酵大豆酱、中国的豆豉以及其他 一 些豆制品中，都有类似的酶存在 因此，找们完全可 以从本国资源出发，开发出适合我国人民口味的纳豆 激酶类保健食品。 参考文献： [1] Yoshikzzu Yuk[，Tomwo NAKAGAWA Mitsugu FLJITA．et al A sandwich enzyme—linked ⋯ 删 肿 蚰rbent ashy for Nattokinase BiosciBioteehBloche咀199屯58f2)：366～370 【2】 鞠洪荣 纳豆的保健与制作方法 中国酿造，2000．11 【6)：6—8 [3] 李荣苹，李晶，赵晓祥．等．一株具有纤溶活性的枯草轩 茵蛋白激酶的研究 ．生物技术，1996，6 L31：21～231．5 (5)：46～49 【4】 须见洋行，中岛仲佳，田谷直俊 血栓溶解酵素十 y 寺十活性测定法 1993，88(6)：482—486 [5] 三 足悟，竹内尚^ 纤溶活性干持一)蛋白盾造法 日 奉心开特许公报 ，1994，153：977 【6】 原敏置．田氛成于，里山性哉 7 口7 壬简便}血 栓溶解酵素活性测定法 日车食品化学科学搏套志I 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