蛋白质—多糖共价复合物

■ Food Sdence and Technology No．5，2000 2000年第五期{； f 2一 蛋白质一多穗其价复合掬 f ， 钟芳 麻建国 王璋 (无锡轻工大学食品学院 许时婴 214036) Covalent Conjugate of Proteins and Polysaccharides ZItONG Fang MA Jlan—Gno WANG Zhan~o XU S'hi—ytⅡg (Sch00l 0f Food sci．＆Techno1．，WrLxi Univ．of LiiSht Industry．，214036) Abstract： The interaction between proteins and polysacchat4des in an important charac~ristic of the blopolymer ays- tem．What increasingly received attentions of the food scientists is the covalent conjugation between the two polymers under cont~lled en~Aronmental conditions It has been noted that the conjnga~s behave a5 an~xceBent functional additive in many aspe幽 of the food processing The properties of the reaction，as well as the factors affecting the conjugation are de- scribed in this review，and some developments in the research into the application of the conjugates in improvement on pro- tein functions have also been highlighted．The results published reveM that the conjugation of proteins and polysacchafides may be an effective way to improve the fun ctions of proteins． Key words：pro~in，polysaecharide，maillard reaction，covalent c0n_ugate，food additive ：⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ 。⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ； 摘要：蛋白质和多糖在控制条件下通过 Maillard -i反应可发生一定程度的复合+而且复合物具有良好 ；的功能性。固此，该课题成为近年束国外食品科学 界的一个研究燕点。简要介绍了近年来国外在该领 i域进行的部分研究I作，包括复合反应的基本形式 和主要影响固素，复合产物时蛋白质溶解性、乳化性 i能、抗氧化性能以及抗茵性能等的影响，并指出作为 ；性能良好的多功能食品幂加剂，蛋白质与多糖的共 i价复夸物的研制和应用必特有着良好的前景。 关键词： 鱼 ；— 苎； 查 型垦生 共价键夸： !苎墨塑型 ； ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ · 一 。· ⋯ · 。⋯ 。； 中围分类号：TS201 2：TS202 3 文献标识码：A 文章编号：1005—9989(2000)05—0012—04 0 前言 蛋白质和多糖是食品体系中最重要的两类生物大分 子，是影响食品结构和质构的主要因素。一般来说，蛋白 质因能在油 一水或气 一液界面上形成嗳附层降低界面张 力而多在腔体体系中充当乳化剂，多糖则由于其良好的 增稠和持水特性而常用做稳定剂。在实际体系中两种大 分子往往共存，由于两种大分子之间的相互作用，此时体 系的稳定性和质构特征并非这两种大分子作用的简单加 和。一般说来，水相体系中大分子链节间的相互作用使得 蛋白质和多糖分子要么相互嗳引，要么相互排斥。相互吸 引时，一方面会增加两相界面上蛋白质嗳附层的厚度和 强度而有利于腔体的稳定，另一方面也可能会由于多糖 在吸附的蛋白之间的交联而发生絮凝使体系失去稳定 性 同样，蛋白质和多糖的相互排斥对体系稳定性的影响 杖翦日期 ：200o一03一I6 作者筒介：钟芳(I972一)，女，博士研克生，主要从事生特技术 在量品工业中的应 用斫兜 也是双重的，这种相互排斥一方面会使嗳附着蛋白质的 油滴因被固定在多糖形成的交联网状结构中不能相互靠 近而增加体系的稳定性，另一方面，这种相互排斥所带来 的蛋白质和多糖的热力学不相适性 (thermal incapability) 会使体系由于排除絮凝 (depletion flocculation)而发生相 分离uI。因此，要获得稳定性好的食品胶体就必须对蛋白 质和多糖之间的相互作用做探人细致的研究，找到具有 良好配伍性的复合乳化稳定剂。 长期以来，食品研究人员在乳化剂、稳定剂的复配方 面已做了大量的工作。研究明，在胶体体系中，蛋白质 和多糖的相互嗳引或排斥往往是由于静电力 《嗳引或排 斥】、善键、范德华力、疏水相互作用以及大分子片段之 间的热力学不相适性等扶级力引起的，这种相互作用比 较弱，所生成的复合物作为食品添加剂其功能性较差，且 很容易受温度、pH值、离子强度等的影响“ 。从 8O年代 末期开始，欧美及 日本的几个研究小组把研究的重点转 移到蛋白质一多糖的共价复合物上 。蛋白质一多糖 共价复合物的形成是基于蛋白质分子中氨基酸侧链的自 由氨基 《主要是耪氨酸侧链上的e一氨基)和多糖分子还 原末端的羟基之间的羟氨反应，即Maillard反应，复合物 作为一个既有乳化能力又有稳定能力的整体存在。这种 大分子复合物对于环境条件具有较高的适应性，与以次 级力结合的蛋白质一多糖复合物相比，其结合不受热或 pH值的变化而被破坏“· l。而且，蛋白质一多糖的共价 复合物在腔体体系中具有乳化和稳定的双重作用。复合 物的蛋白质部分可以有效地嗳附在油 一水界面上降低界 面张力，同时，共价结合的多糖分子链在吸附膜的周围形 成立体网状结构增加了膜的厚度和机械强度。就乳化性 能而言，已有报告 I指出，这种复合物优于某些小分子乳 化剂。另外，研究中 还发现在蛋白质中引人多糖形成 复合物，蛋白质的溶解度、抗氧化、抗苗性以及热稳定性 等性能都会大大改善。在这种意义上，蛋白质和多糖的 ． -f ， o c ，‘ r， j 1 、 T 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 2000年第五期 Food Science n Technology No．5，2oool 共价复合物为研究和开发新型食品孺加剂提供了一条新 的途径。本文即对在近年来这些方面所进行的研究作一 简要介绍。 1 蛋白质一多糖共价复台物的制备 蛋白质分子在水溶液中由于各种分子内作用力以及 琉水相互作用的影响总是趋于形成各种高级结构，一些反 应基团因此被包埋于结构的内部。另一方面，多糖作为碳 水化合物，由于立体效应，其化学反应具有强烈的取向性 ⋯ 。 正是这些因素的影响，蛋白质与多糖之间的化学反应 需要较为严格的条件。在脏体体系中蛋白质和多糖自发地 形成共价复合物的可能性极小。有0 表明蛋白质与经 演化氟 (CNBr)活化的多糖具有良好的反应性，但出于对 食品安全的考虑，在反应中使用CNBr显然是不合适的 从目前所报道的文献来看，蛋白质一多糖的共价复合物都 是通过控制的自发的Maillard反应来实现的。反应是在低 于蛋白质的变性温度条件下进行的，而且，反应时还需控 制反应体系的水分活度使得在较低的水分话度下蛋白质 中的氨基处于非聚集的反应状态，如此以提供反应基团进 行键合 “I。此条件下的Maillard反应速度很慢，酪蛋自是 所有被研究的蛋白质中反应速度最快的，达到理想的反应 程度大约需要 24h，其它蛋白质实现适度的?~Iaillard反应 通常需要2—3周，折叠状态或是刚性蛋白与多糖反应需 要的时间则更长_B_。一般来说。蛋白质一多糖的共价复合 物的制备包括以下几个步骤：(1)将蛋白质和多糖按一定 的比饲溶解在选定pH值的缓冲溶液里；(2)分散均匀后 进行冷冻干燥；(3)冷冻干燥好的样品在一定的温度(一般 50～60℃)和相对湿度(一般用饱和 KBr维持在 79％或饱 和 KI维持在65％的相对湿度)下反应b 】。反应程度可通 过在470am比色进行控制Ⅲ。由于反应条件苛刻，无须特 殊的处理以终止反应，一般来说，降低温度就足以抑制这 种自发的Maillard反应的进行 】。 由Msillard反应制得的蛋白质一多糖的共价复合物， 其功能性质受蛋白质和多糖的种类、分子量及反应底物 配比和复合程度等多种因素的影响。从理论上，当多 螗的链长较短或共价结合在蛋白质分子上的多糖分子数 较少 (即复合程度不够1，形成的复台物中的多糖部分就 不能有效地增加吸附层的厚度和强度，使复合物作为脏 体稳定剂的功能减弱，且体系中未反应多糖的存在会使 体系发生排除絮凝的可能性增加；当多糖的链长太长或 结合在蛋白质分子上的多糖分子数太多时 (过度复合)， 又有可能固为复合物过于亲水或者是空间阻碍使得复合 物在油／水界面的吸附能力下降．其作为乳化剂的功能减 弱“-” 。此外，大量实验还表明，带有支链的多糖与蛋白质 的反应生成共价复合物能显著改善蛋白质的功能性质， 直链多糖嘲不然-．1。总之，应该根据实际情况对复合物功 能性质的要求，控制适宜的分子量和复合程度。 由于蛋白质一多糖的共价复合物的研究还处于起始 阶段，关于复合物结构和功能的关系以及对蛋白质和多 糖 Maillard反应动力学方面的内容目前还鲜见文献报道。 因此，无论是对多糖种类的选择还是对反应时间的控制 都还缺乏有效的理论指导，各种参数的选择和优化只能 通过实验过程中样品功能性质的跟踪检浏来实现 2 蛋白质一多糖的共价复合物的功能性质 蛋白质一多糖的共价复合物的功能性质应该说是基于 蛋白质，多糖的引入是对蛋白质的一种改性或者说是对蛋白 质功能的一种强化。由于关于复合物结构与功能性质的关系 目前尚不清楚，这里只能用一些实验的实例来加以说明。 2．1 提膏蛋白质的溶解性 蛋白质作为功能性添加剂要求具有良好的溶解性。有 很多来源广泛、价格低廉的蛋白质。如：小麦面筋蛋白、大 豆蛋白。它们在食品工业中未能得到充分和用的主要原因 是它们在水裙的溶解性较差。为此，研究人员采用了化学 改性和酶法水解等途径来提高其溶解性 “ ”)，但化学法 的不安全和酶法水解对产物乳化性能的影响都使其推广 受到限制。而且，有些蛋白的酶法水解是十分困难的，水解 产物的溶解度，尤其是在酸性条件下的溶解度的提高并不 理想。多糖与蛋白质通过 Maillard反应形成的共价复合物 申由于多糖链的弓『人，多羟基的亲水特性可使得整个分子 的溶解性能显著提高 实验表盟，随着在60℃，79％的相对 湿度条件下反应时间的延长，部分水解的面筋蛋白～糊精 复合物的溶解度逐渐增加，而且，反应3周后的复合物在 pH 2～12的范围内始终保持良好的溶解度。这种性质是 面筋蛋白与糊精的简单混合物所不具备的_5_。大豆蛋白与 多糖复合也同样可以提高蛋白质的涪解性n I。这种现象的 产生可能是由于在较高的pH时，蛋白和多糖通过次级力 形成较弱的复合物，有利于蛋白的溶解，但在较低的pH下 有可能因为蛋白处于等电点使复合物解聚，多糖不再对蛋 白的溶解度产生影响。而对于蛋白和多糖的共价复合物， 其结合不受pH的影响，因而在广泛的pH范围内都可能 因为亲水多糖的引入使蛋白的溶解度增加。 2．2 提高蛋白质的乳化能力和乳化稳定性 乳化剂是一类被广泛使用的食品孺加剂 随着经济 的发展和人类健康意识的提高，人们越来越多地希望在 食品中使用天然的乳化剂代替化学合成的小分子乳化 剂。蛋白质是具有两亲结构的有乳化能力的生物大分子， 作为一种符合要求的天然食品孺加剂有着广泛的应用领 域。但一般来说，由于大分子吸附的特点，蛋白质的表面 活性远远低于小分子乳化剂 ，即乳化能力远远低于小分 子乳化剂，而且蛋白质的乳化性能(包括乳化能力和乳化 稳定性)对体系环境变化非常敏感 I。提高蛋白质的乳化 能力、乳化稳定性以及适用范围一直是食品科学领域的 一 个研究热点。蛋白质一多糖共价复合物中两种太分子 以共价键结合，体系温度、DH值、离子强度的改变对这种 结合没有太大的影响，圆而复合物能在高离子强度、较高 及较低 pH值、高温条件下保持较高的稳定性，并具有理 想的乳化、稳定性能，大量的实验结果也说明了这一点”· 。 实验还证明，复合物的乳化性能不仅远远高于原来的 蛋白质，而且高于小分子乳化剂 }。 维普资讯 http://www.cqvip.com Food Science and Technology No．5，2000 2000年第五期：； 另外值得一提的是有些共价复合物经加热到 100℃ 预处理后，不仅没有产生不溶性物质，而且其乳化性能 还有所提高。卵清蛋白与糊精 、血浆蛋白与半乳甘露 聚搪⋯ 复合物都具有这种性质。复合物的高温稳定性保 证了乳化体系在杀菌和其它高温处理过程中不被破坏。 此外，对蛋白质一多搪共价复合物的乳化性能的研究 中还发现 J，复合物的乳化性能与多搪的链长以及蛋白质 分子上结合的多糖分子数有关。具有理想乳化性能的蛋白 质一多糖复合物中应有足够的多糖结合以提高复合物的 溶解度和提供空间位阻，同时应保持复合物中蛋白质分子 侧链具有一定的疏水性．以便复合物能快速且紧密地吸 附在油／水界面上。溶菌酶一半乳甘露聚糖(cM)共价复 合物的乳化性能实验表明 ，随着多糖分子量的增加，复 合物的乳化能力提高。当复合物的分子量介于 3500— 6000时，其乳化能力虽较溶菌酶有所提高，但乳化稳定性 却非常差；而当分子量介于6000—12000时，复合物的乳 化能力显著提高，并且具有良好的乳化稳定性；当分子量 进一步增加到24000，即每个溶菌酶分子上共价连接两个 GM分子时，复合物的乳化性能提高程度更大。这种情况 可能是由于在较低分子量时，多糖和蛋白质的复合产物不 能提供足够强的空间稳定作用 ，所以显示了较差的乳化稳 定性。随着分子量的增加，乳化剂形成的保护层厚度增加， 乳化稳定性也逐步改善。在所有关于复合物乳化性能研究 的报道中，溶菌酶与多搪的复合物表现出最优的乳化能力 和乳化稳定性川。通过溶菌酶和q一乳清蛋白这两种具有 相似三维结构的同系物蛋白与半乳甘露聚糖形成的复合 物的乳化性能的比较发现，溶菌酶分子中所带正电荷产生 的静电排斥对复合物优异的乳化性能是十分有益的。 多糖链长还影响复合物的热稳定性，当蛋白分子上共 价结合的多糖链长超过一定的范围，蛋白质受热展开时，长 链多搪的位阻效应就会阻止展开的蛋白分子聚集，从而使 得复合物在高温下保持较好的乳化性能。多糖链太短，位阻 效应就不明显，也就不能有效地提高复合物的热稳定性。对 于溶菌酶而言，复合的多糖分子分子量应在几千以上 】。 不同配比的反应底物同样也会影响到复合物的乳化 性能。大豆分离蛋白与海藻酸盐复合时 ，当大豆蛋白与 多糖的比例为4：1时，复合物的乳化性能明显上升，但这 个比例变为 10：1后，产物乳化性能几乎没有什幺改变。 2．3 增加蛋白质的抗氧化性 蛋白质的功能性质之一是在食品体系中的抗氧化 性。蛋白质的抗氧化性能主要是由于其中含硫氨基酸残 基上巯基的存在。多搪复合对蛋白质抗氧化能力的提高 主要是由于：(1)多糖与蛋白质共价结合后，蛋白质分子 结椅中的巯基暴露出来，而巯基是具有阻断氧化 自由基 反应的基园；{2)复合物是具有良好乳化性能的两亲大分 子，在油／水界面上复合物中的蛋白质部分与油滴表面紧 密吸附，有利于暴露的琉基有效的清除自由基i i。卵清蛋 白 (OVA)是一种天然抗氧化剂，其抗氧化能力比合成抗 氧化剂丁基羟基苯甲醚(BHA)和丁基羟基甲苯(BHT)差， 但研究发现舍成抗氧化捐对动物肝脏有害并有致癌作用 ll ”i ，因此有必要开发新型天然抗氧化剂来取代之。为提 高OVA的抗氧化性，在一些实验中采用了通过Maillard 反应在OVA上共价引入多糖的方法 ，对比OVA、OVA与 DX(糊精)的混合物和 OVA与DX的共价复合物对甲基亚 油酸的相对氧化速度的影响，结果表明，较之OVA单独作 用的体系，OVA与DX的共存显著提高了抗氧化能力。有意 义的是 OVA与 DX的结合状态显示了对抗氧化性的不同 影响．以过氧化值 (PO~)为指标时，o、 A—口x共价复合物 的抗氧化性是其相同剂量的简单混合物的 1．4～1．9倍；而 以硫代巴比妥酸值 (皿A)作为指标时，其抗氧化性则增至 1．8～2．4倍 】。复合物作为一种天然、安全的抗氧化剂同 时又如前所述具有良好的乳化性能，因此，在含油胶俸食品 中可作为双功能添加荆使用 】。 2．4 细菌的滋长是引起食物腐败变质的主要原因。为了延 长食品的货架寿命，需要在食品中添加有救的防腐剂。溶菌 酶是一种对 Cram一阳性苗有很好抑制效果的酶类，但对于 外膜主要成分为脂多糖的Cram一阴性菌则不起作用 。研 究发现，若采用十二烷基硫酸钠(SDS)、十二醇硫酸钠等表 面活性剂打开细菌的外膜，溶茵酶就能破坏 Gram一阴性 菌。因此，如果将溶菌酶改性成为具有两亲结构的太分子并 同时保持其溶菌活性，就可能拓宽其抗菌范围。 如前所述，蛋白质一多糖共价复合物有很好的乳化 性能和耐热性能。如果将溶菌酶与多搪进行适度的共价 复合，就有可能利用其良好的表面牾性辩解细菌外嚷， 从而使溶菌酶产生抗 Gram一阴性菌的作用。同时，由于 复合物良好的热稳定性使其可在较高的温度下保有杀 菌活性，因而它对 Cram一阳性菌的作用是物理力，即热 对 Cram一阳性菌结构和活性的破坏以及复合物中溶菌 话性作用的联合。这一设想已被实验证实，溶菌酶 一葡 聚糖复合物在50℃的条件下对 5种 Gram一阴性菌进行 作用的结果发现有 4种可在20mln以后垒被杀死，只有 克氏杆菌r勋neuo'~nlae)还保持着约 1％的存活率”】。鉴 于溶菌酶～ 葡聚糖共价复合物对 Gram一阴性菌 和 Cram一阳性菌的双重挠菌效果以及在复舍物形成过程 中未使用任何添加剂的情况．可以认为它是一种极具应 用前景的防腐剂。 从以上的实例可以推测，赊溶菌酶外，多糖还可以与 其它多种酶复合以提高酶的稳定性、改善酶的活性或使 酶具有其自身所不具备的性能。 3 结语 以上仅介绍了四种关于多糖的弓【入对蛋白质功能性质 影响的实例，其它关于复合物对蛋白质改性的应用还很多， 倒如，使用半乳甘露聚糖与大豆蛋白的共价键合可以基本 上掩蔽蛋白中原有的抗原结构，从而有救地减轻大豆蛋白 的过敏性，其效果甚至优于使用转氨酶和凝乳蛋白酶对蛋 白的处理 Itg]~总之，这些实验结果指出了蛋白质一多糖的 共价复合物是一种性质优良的多功能食品添加剂。另一方 面，它们是由蛋白质和多糖两种天然生物大分子在没有任 何化学试剂参与下经由Maillard反应制得，是一种 “绿色 维普资讯 http://www.cqvip.com 岱淞 2000年第五期 Food Science and Technoloev No．5．2。()o 食品添加剂，符合现代社会对天然食品与日俱增的要求，因 而有着广泛的应用前景。当然，由于对蛋白质一多糖复合物 的研究只有近十年的时同，对反应机理的认识、对反应条件 的选择和对反应程度的控制等基础理论方面还有待于大量 的工作 。尤其是工业规模反应过程的和控制，以及 反应产物作为功能性添加剂在具体体系中的应用，更是一 块尚未开垦的处女地。但是我们相信随着研究的深人，这些 问题会得到逐步解决，蛋白质一多糖共价复合物的功能性 质还会不断键发现，新的和更为有效的复合方法会不断获 得，使这类大分子复合物最终真正成为广泛运用于工业的、 商品化的食品添加剂。 参考文献： [I】DiekiⅡs0n E，McClements D Advances in Food Co1． 10jds．Blackie Academic＆ Professiona1．1996．91～99 [2】Tolsteguzov V B．Vainermann E s Investigation 0f tl1e Interaction Between Certain Protein an d Acid Pohfl~tc． eharldes in an Aqueous Medium．Nab~ang， 1975， 19 (1)：45～60 [3】Kato A，Sasaki Y．et a1．Functional Protein—Poly ． charidConjugatePrepared by ControlledDry—heating of Ovalbumin—Dexmm Mixtu,~,．A c Bio1 Chem．1990． 54l1)：107—112 [4】Nakamura S，Koheyashi et a1．Role of Charge 0f Lyso~yme in the Excellent Emulstrying Properties of 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的包装、名称和食品不符。比如，名为巧克力饼干，实际 上是普通饼干中加入了色素等等。 (宁夏银川市司法局 李文成) 维普资讯 http://www.cqvip.com