蜂胶抑菌作用的研究

定幅 蓍姻 1999年第六期 0 纷 6 ，7， 蜂胶抑菌舴用的研究 扬垫拦 哟 唐明翔 李丽 罗立涛 (石河子大学工学院食品科学系 832003) 摘要 ：改进 了传统的蜂胶抗茵物质的提取方击 和工艺．吊不同的有机溶卉4和工艺抽提蜂肢中的 押茵有娃成份，姑果表明：DEP击的得率较高、押 茵效果好 ；用 DEP法提取的蜂腔作抑茵作 甩的研 究表明：一定浓度的蜂腔提取袖对常见食品微生 特有一定的抑制作甩，且押 茵强度与提取方法有 关，押 茵娃果与化学防扁荆相当。 关量词苎垦．；押茵 堕曼型． 酋育 雇 狮 蜂腔是蜜蜂从植物幼牟及树千上采集的树脂 上嘎蒜的分泌物、蜂蜡等加工而成的一种具有芳香气味 的不透明腔状固体，颜色呈现黄褐色或灰褐色．昧微苦． 不溶于永，溶于乙醚、乙醇等．具有较强的防腐、抗菌、消 炎、护肤、促进机体免疫功扼等作用，可做为防腐剂、保鲜 剂、护肤剂、抗氧化剂应用于食品、化工、轻工、医药等领 域。且前，所甩蜂腔制剂多为乙醇拎最物(CEP)．抗苗话性 不高。鉴于此，我们在提取溶剂、工艺等方面进行了实验 性探讨 ，箭成了DEP、EEP、氯仿 、乙酸乙酯提取法蜂脏削 荆．并对蟑腔的抑菌作用进住了研究．目的在于确定得率 高抑菌效果好的提取方法，并将蜂膛的抑菌防腐作用应 用于食品贮藏、保衅中．发挥其天然、安全、廉价、营养的 优势 ．为开发出一种新型的保鲜防腐剂提供理论基础。 1 和设备 l_1 材料 1 l_1 供试菌种 细菌 ：金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢 杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌；真菌：毛霉、黑根霉、尖孢镰 刀苗、黑曲霉、青霉 ；酵母：啤酒酵母 、异常汉逊 氏酵母、 假墼酵母。 1 1．2 原料 蜂腔 (新疆农垦科学 院提供)，二氯甲 烷、氯仿、乙醇(分析纯 )，乙酸乙醇、0 1％多苗灵、0．3％ 特克多、0 1％苯甲酸钠 、0．2％山梨酸(化学纯)。 】_2 主要设备 HY34恒温培养箱、HF一3恒温干燥箱、HH一2水 褡锅、热回流装置、SW—cJ一2FD超净工作台。 2 筛选溶剂和提取工艺 33 2 1 DEP提取涪 选用具有中等极性的有机溶剂二氯甲烷作溶媒。取 一 定量经拎藏、粉碎的蜂腔，加于定量的二氯甲烷中，45 ℃热回流 2h后过滤．50℃回收溶剂。再用 95％乙醇热回 流 2h后过滤、去蜡．B5℃回收溶剂后得抽提物 DEP。 2．2 EEP提取法 用 95％乙醇为溶媒 ，加入定量经玲藏、粉碎后的蜂 腔，在 85℃热回流 2h．过滤，85—9o℃挥发回收溶剂 ，得 蜂腔提取物 EEP。 2．3 CEP提取法 用 95％乙醇为溶媒 ，加入定量经拎藏、粉碎后的蜂 腔．常温浸渍．并不时振动摇匀，3d后．用滤纸过滤，挥 发去溶剂 ，得提取物 CEP。 2．4 氯仿摄取法 选 用氧仿为溶媒 ，取定量经冷藏 、粉碎后的蜂腔 ．加 于定量的氯仿中．65'=C热回流 2h后过滤。65—75℃回收 溶剂后过滤，得抽提物 。 2 5 乙酸乙酯提取涪 选 用乙酸乙醋为溶媒 ，取定量经冷 藏、粉碎后的蜂 腔，加于定量的乙酸乙酯中，80℃热回流 2h后过滤。 8D一85℃回收溶剂后过滤 ．得抽提物。 3 蜂胶抑菌作用的试验 3．1 准备 3．1．1 苗悬液的制备 将细菌用牛肉膏蛋 白胨培养 基 、真菌用麦芽汁培养基、酵母用马斡薯培养基活化后 ， 分别用灭菌生理盐水配制成含菌数 10 107个／mL的 菌悬液备用 3 1、2 将厚度为 l_5mm的滤纸用打孔机打成直径为 6mm圆片，并将滤纸片干热灭菌。 3．1 3 平板的制备 将 配制好的各供试苗适用的灭 菌培养基拎却至 50～60℃．倾注于干热灭菌的培养皿 内，制成平板待用。 3．1 4 蜂腔渡的配制 将 DEP、EEP、CEP、氯仿 、乙酸 乙醇法提取出的蜂胶用 95％乙醇配制成含蜂腔 l_6％、 0．8％、0．4％ 、0．2％、0．1％、0 05％的蜂胶乙醇液。对 照实验用 95％乙醇、n 85％无菌生理盐水。 鼹 ， ， 维普资讯 http://www.cqvip.com · 34 · 3．2 抑菌实验方法 3．2．1 将滤纸片分别浸在 DEP、EEP、CEP、氯仿、乙酸 乙酯法提取蜂肢所配成的蜂肢液及无菌生理盐水、95％ 乙醇液中 15rain后 ，取出在无菌条件下风干。 3．2 2 用灭菌吸管吸取 0．2mL各供试菌液加到每个 灭菌平板上，然后用灭菌玻璃刮铲涂布均匀。 3．2．3 将 风干后的滤纸片技在每 个涂有菌液的平板 上，等距离放 3片，每个处理做 3次重复。 3 2 4 把每个处理后的培养皿放在与各供试菌相适 宜的温度下倒置培养 ：细菌 37℃，24h；酵母 、霉菌 28℃， 48h。并测定抑苗圈直径大小。 4 结果与分析 4 1 95％乙醇及 0．85％的无菌生理盐水无抑菌圈 ， 可知 95％乙醇及 0．85％无菌生理盐水对嵌生物无抑翩 作用。 4．2 不同提取方法的抑菌效果 表 1 同提取方法抑菌效果比较 注 ：以各提取港 O 4％ 均抑盛圈 ” 柏 直径 一 由表 1可知筛选溶剂和提 取工艺的试验结果表 明：DEP和氯仿法提取蜂肢的得率最高 ，得率稍低的是 J9鲫年第六期 璺 篮逝 EEP和 DEP；从抑菌效果 比较来看，DEF'法抑菌效果最 好，说明用 DEP提取法制成的蜂肢 ，其中含有更多的抑 菌有效成份，其中的机理还有待于研究。所以我们选用 DEP法作为蜂肢制荆的提取方法。 由表 2可知，比较 DEP提取法的不同浓度的蜂胶 乙醇液对各供试苗的抑制效果 ，除太肠杆菌 (G )外 ， 1 6％ 、O 8％、O 4％的蜂腔浓度均有较强的抑菌作用， 且随浓度 的增高 ，抑苗圈直径增大。当浓度降至 0 1％ 和 0．05％时 ，对 各菌种 的抑制作 用有 不同程度的降 低。蜂肢液对大肠杆菌无抑制作用，说明蜂肢对革兰氏 阳性苗作用强，而对革兰氏明性菌无明显抑制作用It 由表 2可知 ，蜂肢液对各微生物抑制强弱的顺序 为 ：细菌：金黄色葡萄球菌>蜡状芽孢杆菌>枯划杆 菌>太肠杆菌；真菌 ：毛霉>黑根霉>尖孢镰刀菌>黑 曲霉>青霉；酵母 ：啤酒酵母>异常汉逊氏酵母>假丝 酵母。 表 2 不同浓度蜂胶提取液抑茁匿直径 (单位：咄 在最低抑苗浓度 MIC值测定中 ，由表 2可看出 ， DEP对金霉、金黄色葡萄球菌的 MIC值小于 0．05％；青 霉、假丝酵母的MK值为0．2％；其余的为0．1％。这为 夸后确定蜂肢制剂对各种菌所采用的最小剂量提 供了 理论依据。 4．3 由表 3可知 ：蜂肢制剂同各化学防腐剂的抑菌效 果进行 比较 ，抑菌效果相 当，可以用蜂胶代替化学防腐 剂应用于食品贮藏加工中。 4．4 综上所述通过对蜂胶提取工艺的确定和蜂胶抑 菌作用的研究，证明蜂腔具有一定的抑苗防腐作用，作 为天然保鲜防腐剂代替化学防腐剂 ，是完垒可行的，为 (下转第 32再l 维普资讯 http://www.cqvip.com ·32 · fA8pergiIlus Oryzae)菌株制备的真菌 n一淀粉酶，该酶 水解直链淀粉和支链淀粉中 1，4一n一葡萄糖苷键 。 Fungainz1于 5 5、56—58~C糖化 ，开始时 ，生成大量 的麦芽三糖 ．随着水解 时间的延长 ，麦芽糖逐渐增多 ， 控制好真菌酶的剂量和糖化时间，既使太分子糊精含 量减至量 低限度 ，叉要保证 麦芽 三糖 含量 占主导地 位 ，可制得 DE值 38左右 ，熬温 120℃左右的麦芽低聚 糖浆 。 2 2 3．3 Cerefio是一种纯化的细菌 B一葡聚酶制剂 ， 此酶是一种葡聚糖 内酶 ，能使 (1，4一B一葡聚糖 、1，3— 13一葡檗糖)分解为 3—5个葡萄糖单位的低集糖 ，此酶 除具 13一葡聚糖酶活力外，还有 n一淀粉酶活力，类似 于工业上大家熟悉的由枯草杆菌得 出的淀粉酶制剂 利用 Cetelfo酶与 1‰普鲁兰酶台并糖化 ，糖化 4—6h， DE值达 38后 ，延长糖化时问．DE基本保持不变 ，糖化 10—12h过滤速度与上述两酶相比，明显增快，产品为 无色透明粘稠液体。熬温达 125—130~C。 2．2．4 糖化液中所含杂质 ，经括性炭脱色去除后，尚 有一部分盐类及胶体物质和离子型色素 ，需要用离子交 换的方法去除 ．离子交换树脂具有离子交换 和吸附作 用。对于麦芽低聚糖 ，为了保证糖浆的熬煮温度 ，离交 至关重要，对于阳 阴_÷阳一 阴串联二级交换离交系 统，离交糖液出柱 pH控制在 4．5—5．0之间，电导达 0 0001s／m，保证杂质离子基本击除干净 。 3 质量 三 种 n一淀 粉 酶 系 做 出 的 麦 芽 低 聚 糖 按 ZBX31004—87液体葡萄糖及其试验方法 ，产品为 无色透明粘稠液体 ，121感低甜眯，熬温在 120~C以上。 取上述三种糖化剂生产出的糖浆样品进行高效液 相色谱分析，色谱图如图 1、图2、图 3。 蹴如 图 1 一淀粉酶 +1‰普鲁兰酶糖化试样色谱图 4 结论 4．1 用三种 n一淀粉酶系在高麦芽糖T-Z路线基础 上，成功地用碎米为原料 ，工业化试制出麦芽低聚糖。 1999年第六期 图2 真菌酶 +1％o普鲁兰酶糖化试样色谱图 = C I { j ：¨_ U： ‘／L ：一一 图 3 Cereflo 13一葡聚糖酶 +1‰普鲁兰酶糖化试样色谱图 三种酶系做出的产品，DE值、色泽、熬温都达到预想的 要求，经高效液相色谱分析 ．成品中麦芽三糖、四糖、五 糖、六糖占 50以上，尤其是三糖含量较高。 4 2 由于 DE值较低 ，前二种酶系糖化液过滤相对困 难 ，使用 Cereflo酶 ．既可使用其 中的 n一淀粉酶的作 用，叉可使 13一葡聚糖获得彻底降解 ，从而增强了糖化 液的过滤性能，提高了工作效率。 参考文献： 【1l张力田．淀粉糖 轻工业出版社 ．1981 (上接 第 34页) 今后蜂腔在食品贮藏加工 中的应用提供了理论依据。 参考文献： lJI夏 平开 养蜂厦蜂产品加工 ．新疆科技卫生出版 社 ．1993 251—338 [2]胡江疆 蜂胶提取物对细茵作用的 实验研究 蜜 蜂杂志，1990，(10)：3～5 【3]王南舟 蜂胶中抗茵活性糖质的提取厦其 呲c的 测定 ，蜜蜂杂志，I989，(10)：8—10 f4l董金甫，等 ．萘多醉 (TPP)对 8种垩t痛酋重低押制 浓度的研 究．食品科 学，1995，l6(1)：6 12 维普资讯 http://www.cqvip.com