啤酒酵母浓度实时在线检测的研究（一）

，，=7 ． 1 — 9 — 99~ ． ． — — — — — — 园园圄函 2 e『I』 啤酒酵母浓度实时在线检测方法的研究(一) 啤滔醯日 璐母 像t1定 ．三 俊妻育 (山东轻工业学院 自动化系 HaI-s H． (丹麦嘉士伯啤酒技术研 究中心。DK 济南 ‘2501001 v 、 一 2506 Valby Denmark) STUDIES 0F 0N —LINE AND IN —SITU DETECTING METH0D 0F BEER YEAST C0NCENTRAT10N f I) WANG Yi-jun FAN Yu f Delmrtment ofElecm：cat Engineering Sha,~long CoElege 魄 m Induso％ Mn 250100, Ham 阻 ，Cadsberg Technological Development，Gande Cadsberg 10,Dk一2500 Vafby, ,genm~k) Ab~ract：This pape r c0眦㈣ a device a越 Bmethodwhichmonitor yeast㈣ Ⅱh吐 on line蚰 din ． fe~nentarion啪 The presence of mie~bial cells would aff~t the dJeieetricM prope rli~ of mic~bial suspensions At radio—frequencies , the intrinsic ㈣ssi electrical Pm m of o suspensions gtre completely specified by its conductivity and p一 _廿 i At radio—frequencies the diel~tTic pe~ ittivity of cell suspensions are monotonic ftmcfi~ ofthe me~uring frequency and cell dem ity Based on this undemt~ ding n method for toe&safng biom~s concentration is pcoposod．Using this method tbe biomas．s concentratior~s are me~urod — line and in一8Jlu without t~kieg samples from the Kore c． 叽d o y i出k ce a健 deteetod Th e e|ecti'od~~hiehⅥe d el。pd e u【d be dⅡ 曲 n m。the fermem~ Ⅱ d could be sterilized in place．The method b㈣ vfide se in the itldustrial field of pharmacy r brewery．sewage p0 Key words：on—line andin—situ detecting．beer yeast cor|ce『Itralj0n．)'east viabil]ty． dielectric dispe mion ：⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ 。⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ 一。。‘⋯ ⋯ ⋯ ⋯ 。⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ·⋯ ，⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ c! ； 摘要：酵母的存在会改变发酵液的电特性．发酵液在无线电频率范围内的电特性可用电容率和电导率充分地 ! ：描述。实验证 实发酵液在无线电频率范画内的电容率增量是龇量频率争生特量浓度的函数。基于对发酵液电蓉 率分布的研究，本文提 出了剃量酵母浓度的新方法。用本方法不用取样就 能对发 酵液中的酵母浓度进行 嘉时在 j ：⋯ 一 ⋯ c⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ·⋯ ⋯ ⋯ ⋯ 。⋯ ⋯ ⋯ ．“．∽．⋯ 。⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ 。c．。⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ 。⋯ ． ； 发酵，1992，19(1)：20～25 [3】李笃信 ．新型甜味剂的发展 与应用 199l，(3)：27—29 [4]凌关庭等 食品添加剂手册() 社 ．1989 56～69 【l0】Cascone O，B A Adrews，J A Asenjo Partitioning and 食品与机械、 put—ifieation of thaumatm itt aqueous two—phase 化 学工业 出版 [5]刘树楷，郑建仙 最甜的蛋白质一Thaumatin．中国 甜 幕糖业，1992，(4)：47～59 [6】划志奉，宋艾青 ．国内外批准使 用的甜味剂近 1兄 食品与发酵I业，1992，(2)：72～77 【7】孙天松 甜性蛋 白耱 ．中国调味品 ，1992，(7)：6— 9，l1 【8】Fred F Shih，周明霞，黄 占先 天然蕊舍成甜昧卉。的 最新进展 ．食品与发酵工业 ，1991．(5)：57～63 【9】Anon．Thaumatin—the sweetest substance known to ttlan has a wide range of food applications Food Technology，1996，50(1)：74～75 systems Enzyme Mic—rob Technol， l991． 13(8)： 29～635 [11]Edens L，et a1．Gene．1982，18：l～3 [12]lyengar R B，et a1．The complete amino acid 9LN~[1lCtlce of the sweet protein， thsumatirt I Eur J Biochem． 1979．96：193～206 【13】Shmnil Syed，Maggie Cusack，Robert J Beynon．Effects of proteolysis 0n the sensory properfics of the sweets protein，thaumatin J Sci Food A c．1990，53(1)： 73～84 [14]V der weJ H，Loeve K．Isolation and eharacterisa— fion of thaumatin l and II． the sweettasting proteJtrs from 1kIumatococcus danielJi(Benth)．Eur J Biochem． 1972．31：221～225 维普资讯 http://www.cqvip.com 旦盟箜堕互靼 量l塞盥 “⋯ ” “ 一 ： ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ “ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ～ ‘ “⋯ ⋯ ⋯ ” ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ”⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ： ；线阑{量，而且刮得的是活的酵母1泉度 本文制作的电极直接插入发酵嚣申并满足高温蒸汽灭菌备件c本方鲁在生 ： ；化制药、食品发酵、啤酒酿造、污术栓刹等工业领域里有很好的推广应用前蒂。 ； ● ， ● 关麓词：窭时在线刹量；啤酒酵母采度；酵母活一陛：电客率分布 ； ；⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ 一 一 ．一 ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ． ． ． ⋯ ·。⋯ 。⋯ ⋯ ⋯ 一 ⋯ 一 · ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ ⋯ c o 前言 制药 f如青霉素、链霉素等)、酿酒 (如葡萄酒、啤酒 等)都要经过发酵过程。影响发酵过程的因素很多 ，如 发酵液的成分和浓度 、溶解氧含量、温度、口H值 、搅拌速 度 、酵母的种类、活性和浓度等等 在上述因素中，酵母 浓度是最重要的参数 ，因为在一定条件下．发酵的 得率与酵母浓度密切相关⋯。因此酵母浓度的实时在线 检测，对了解和控制发酵进程、提高产品的质量具有重 要的意义。但是直到现在人们还没有研制出符合要求 的仪器 ，这种仪器应能对生物量进行准确的在线实时检 测，而不改变或破坏原微生物系统的工作状态。我们这 里所说的实进检测，意思是仪器的读数应该是此时此刻 的生物量浓度，而不是几十 rain或几个 h之前的数值。 我们所说 的在线检 测意 思是不经过采样且不离 开现 场 。 通过微生物的繁殖生长过程，在生物反应器中生产 有用物质的过程，与在化学反应釜中通过催化作用生产 化学物质的过程有很大的不同，因为在生物反应器中酵 母 的数 目每时每刻都在发生变化。生物量浓度的检测 对任何发酵过程都是非常重要的 ，也是科学家和 师们非常感兴趣的研究课题。但是直到今天，人们还没 有研制 出满足工业现场要术的测量仪器 。 生物量的传统测量方法是离线的，主要有干重法、 光密度法和亚甲基蓝染色法等。 目前^们把干重法看戚是一种参照方法 ，因为用其 他方法测得的生物量一 般都要与用干重法测得的数值 相对照。但是 lens N．教授认为，把干重法作为参照方 法(或基准方法)是不适宜的⋯。因为干重法是基于地球 引力 (重力)的方法，它有很多缺点。首先，工业发酵物 中一般含有多种颗粒状的有机物和无机物，他们跟微生 物混在一起．很难把它与微生物分开 其次，活的酵母 和死的酵母对测量结果都有影响，而我们希望得到的是 活酵母的数 目。虽然干重法有这些缺点，但由于找不到 其他更好 的参照方法，所以 目前人们仍把干重法作为参 照方法。用本文提出的方法测得的结果也与用干重法 测得的结果作 了对比。但是必须指 出：用本文的方法测 得的结果有时更准确地示了酵母浓度 ．尽管这些结果 与干重法的数值有较大的差异。 光密度法 (Optical Density，即OD)是另一种参照方 法，当用 定波长的光线照射发酵液时．酵母和颗粒状 悬浮物对光有反射和散射作用 。反射光或散色光与生 物量之间有一定的对应关系，根据这个原理可 制戚生 物量检测仪：但此类仪器的读数易受发酵液的颜色、浊 度及颗粒状悬浮物的影响，也不能排除死酵母的影响 ， 这类仪器难以用来测量淤泥状发酵物 此外还有基于 荧光原理的仪器 ，此类 仪器不能再来测量盘尼西林等发 酵物 ．因为盘尼西林是荧光携带者 为了检测活酵母的数目和酵母的活性 ，人们通常用 细胞计数器或用亚 甲基蓝染色，然后用显微镜观察计数 ㈧ 但这种方法要做多次稀释，尝产生很大的误差 用这 种方法得到的不是此时此刻的生物量 ，而是几十 rain或 几个 h之前的数值 。对于杆状细菌或丝状细菌，有时他 们会缠在 一起。在这种情况下，光密度法和亚甲基蓝染 色法 就显 得无能 为力 。 当超声波通过发酵液时，其幅度被衰减，其传播速 度尝有所改变 ，据此原理可制戚生物量测量仪。但此类 仪器易受发酵液戚分变化 、汽泡、温度变化和粘稠度的 影 响 ： 酵母的存在会影响发酵液的电特征，有些学者试图 通过阻抗 (或导纳)测量法测量生物量浓度和研究酵母 生理状态的变化 【。虽然人们作了很多工作 ，但此法的 研究还远远没有达到宴际应用的程度。因为即便在实 验室条件 F，发酵液的阻抗也会出现复杂的变化。我们 发现 ：当发酵液的戚分发生较大变化 时，特别是发酵液 中离子的浓度发生较大变化时，阻抗测量法的准确度是 很差 的 1 上述方法都是离线测量法，都要从发酵罐中抽取样 品，在取样过程中极易带进杂菌而感染发酵罐 ；采用离 线方法的另一个缺点是，人们不能用这种方法来对发酵 过程进行 自动控制。 综上所述 ，Je N 和Junker B H 等世界知名学者认 为，直 到现在人们还投有制造出满足要求的在线检测仪 器 ，该仪器能对发酵过程中的生物量浓度进行准确的实 时在 线测 量”【。 许多世界知名学者认为 生物量”一词很难确切定 义 ，他们认为用生物体积 (Bi0v01ume)，即被细胞膜所包 围的郭部分生物质的体积来描述生物量更为恰当 本文的主要 工作是研究微生物 的存在对发酵掖电 维普资讯 http://www.cqvip.com 容率分布的影响，在此基础 上提出了用电容率测量法对 生物量浓度进行在线实时测量的方法和攸器。 1 本方法的理论基础 本方法的理论依据是 Mmxwell—Wagner效应 l或称 为 Maxwell—Wagner分布l 即发酵母 的电容率对于酵 母浓度和测量频率的依赖性。 微生物的存在 会影响发酵泣的电特性 ，这 个现象上 个世纪束^们就认识到了 。本世纪初 Fficke通过测量 红血细胞在声频和无线电频率下的介电特性 ．算出了细 胞膜的厚度 ，而 C Larke及其同事戚功制造了～种装置， 该装置通过测量含微生物溶液的导磁性来确定发酵液 中的生物量浓度 。 5L电学的角度来说 ，一切物质(包括发酵液)的电特 性都可以用电导率和 电容率来表赶。发酵渣的电导率 可定义为其传导电荷的能力，而发酵禳的电容率可定义 为其储存电荷的能力。 设酵母的形状是球形的 ，用 r表示酵母的平均半径 【单位为 m】；c 为细胞膜单位面积的电容 (单位为 F／ m )；粕是真空中的电容率 (单位为 F／m J．其值大约等 于8 85×10‘。 F／m)；P是体积系数，它是所有酵母菌 的体积与发酵液体积的北．P是一个远远小于 l的数， 无量纲 ；8 是发酵液在很高频率下 (相对于测量频率而 盲)的相对电容率 (无量纲)； 是发酵液在襁I量频率下 的相对电容率(无量纲 1=则在一定襁I量频率范围内(o< f< )，发酵液的相对电容率可表示为： sE=9PrC ／4自+s。⋯⋯⋯⋯ ⋯⋯⋯ ·⋯(i J 由 (1)式可知，当培养基中没有酵母时 ．即 P=0 研=e 。因此由于酵母 的存在 所引起的电容率的变化 为 ： ’ △s r；9PrC ／4eo ⋯ ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ (2) △＆称为电容率增量，它与体积系数 P戚正比。 水的相对电容率在 60至 85之问 ，其典型值是 78， 随着温度和电导率的不同 ．日会有所变 化。如果测量电 压比较低 ，水的电容率几乎与襁I量信号频率无关。如果 把水放人发酵器中．其电容率受其中溶解的气体和非细 胞物质的影响较小 ．当测量含有酵母的发酵渡的电容率 以确定生物量时 ，水的电容率可作为参照信号 当培养基中加入酵母后，其电容率会显著增加。当 测量频率 由高到低变化时 ，发酵液的电容率会在培养基 电容率的基础上逐渐增加 (培养基的电容率 可作为参照 信号或基准信号)。我们把电容率随测量频率变化而变 化的现象叫作 电容率分布、电容率的频率特性或电容率 额谱 ．发酵 液的电容率分布可划分为三个 主要 区域： 一 分布 ，B～分布和 一分布 Ⅱ一分布发生在音频范 围内．主要是 由于带电离子在细胞膜表面作切向运动引 起 的 ； B一分 布 又 称 为 Maxwell—wagner效 应 或 Ma．x-,,eLL—wagner分布 ，B一分布发生在无线电频率范 围内．主要是 由于活的酵母细胞具有粒子不能透过的细 胞膜引起的； 一分布发生在 比B一分布更高的频率范 围内 (甚高频或射频J 它主要是由于偶极子 (例如水偶 扳子)的旋转引起的。 一分布不是活的微生物细胞特 征的表现形式。 Maxwell—wagner分布，即 B一分布是本文的理论基 础 ，因为 13一分布是具有完整细胞膜的的微生物细胞特 征的表现形式 关于 Maxwe1]一WfltgTler分布产生的机 理 ，一般解释为 ：活的微生物细胞都具有完整的细胞膜， 完整的细胞膜是 良好的绝缘体 在一般情况下，细胞内 的带 电离子很难穿过细胞膜到达细胞的外部 ；细胞外的 带 电离子也很难渗透到细胞的内部 如果将发酵液置 于电场内，在细胞膜的内、外表面上会有大小相等、符号 相反的电荷堆积，每个细胞很像一个小电容器 ，在一定 条件下 ，单位体积 内的酵母细胞所束缚的正电荷 l或负 电荷 )的数量与酵母数 目戚正比。酵母浓度越大，它们 所束缚的 电荷越多，发酵液的 电容率越大 ，这就意眯营 我们可 以通过 测量 发酵液的电容率来测量生物量浓 度。由于细胞膜很薄 ，它所呈现出的细胞膜 电容是很大 的 ，单位面积上的细胞膜电容 C 一般在 0．6 ／c ～ 1 5IzF／c 之间 。 发酵液的电容率和电导率是两个独立的参数，但要 把它们准确地测量出来并非易事，特别是当发酵液的电 容率 比较高的时候更是如此。即便在高频情况下，电极 上也会存在极化电压，电极和引线会引入分布电容 。发 酵禳戚份的变化、温度的变化等都可能引起电容率 的改 变 。 一 般说来 ，物质(特别是发酵液)的电容率和电导率 不能直接测得 ，但是我们可以用测量电容的方法来确定 两电投间发酵物的电容率。如果在发酵液中放置一对 电极 【实际上构成了一个 电容器)，设电投的表面积为 A．距离为 d，则发酵液的电容率 电极电容 C之间有 如下关系 ： B =dC／Ae。⋯⋯⋯ ⋯-⋯-·-·····⋯⋯⋯⋯(3) 或 =KC (K=d／AB0)⋯⋯⋯⋯⋯ l4) 上面的式 子中 ，d／A定义为电极常数 ，其单位为 cm～，电极常数与电极的形状和电极R寸有关。在车文 中．AB r经过标定之后 ，用来指示酵母浓度。 (未完待续) 维普资讯 http://www.cqvip.com