核酸分子杂交08

nullnull刘 向 华（nucleic acid molecular hybridization）DEPARTMENT OF BIOCHEMISTRY & MOLECULAR BIOLOGYnull核酸是以核苷酸(nucleotide)为基本组成单位的生物大分子核酸脱氧核糖核酸（DNA, deoxyribonucleic acid）：位于胞核、线粒体，贮存遗传信息。核糖核酸（RNA, ribonucleic acid）：位于胞质、少量在胞核内，传递并参与遗传信息的达；病毒RNA也可贮存遗传信息。nullH核酸的分子结构基本组成单位 ——核苷酸A G C T/UPentosenull单核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接成大分子——多核苷酸。5’-末端：P3 ’-末端：OH二 核酸的一级结构 (primary structure) DNA和RNA中核苷酸的排列顺序，即碱基的排列顺序。null书写方法5 pApCpTpGpCpT-OH 3 5 A C T G C T 3 1. 线条简化式2. 文字简化式 方向：5’ 3’null4 Cardsand the beautiful life!nullDNA double helix model, 1953DNA的二级结构 DNA secondary structure1962 Francis Crick, James Watson, and Maurice Wilkins receive the Nobel Prize for determining the molecular structure of DNAnullPhosphate Sugar BaseSugar-Phosphate Backbone Stabilizing forces: hydrogen bond, base-stacking interactions 核酸分子杂交的基本原理 核酸探针 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交的基本原理 核酸探针 核酸分子杂交技术null定义：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下 （适宜的温度及离子强度等）可通过碱基配对原则， 以氢键相连而形成稳定的双链。 杂交的双方是待测核酸及探针。 核 酸 分 子 杂 交 的 基 本 原 理主要方式是待杂交的核酸分子（DNA或RNA）固定在适当的支持物上，用带有可检测标记的探针（已知序列的DNA或RNA片段）去杂交，两者通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来，以检测目的DNA或RNA分子存在与否及其位置等。null 实验对象： 实验目的： 检测待测样品中靶核酸的量和位置。null 基本原理：DNA变性、复性与分子杂交nullHybridizationnullTm ：50%DNA解链的温度，又称融解温度。 （G、C含量）Tm = 69.3 + 0.41*(G +C) % 融解温度：50％杂化核酸分子解链温度称为寡核苷酸探针的Tm值，在此温度下解链核酸和未解链核酸达到平衡。 寡核苷酸探针的长度、碱基的含量和核酸的序列决定了探针的Tm值。 实际操作中，常选择低于Tm值5-10℃进行杂交，在此条件下只有完全互补的核酸才能杂交。null影响核酸分子杂交的因素 探针的浓度、长度、复杂性 离子强度 温度与变性剂（甲酰胺）null核酸分子杂交应用： 克隆基因的筛选 DNA酶切图谱的制作 基因突变及疾病的诊断 微生物病原体的检测……核酸分子杂交特点： 高度的灵敏性 (pg)、高度的特异性null 核酸分子杂交的基本过程包括： （1）待测核酸样品的制备, 制备探针； （2）待测DNA样品的电泳分离； （3）凝胶中核酸的变性（碱变性）； （4）Southern印迹 (转膜)； （5）Southern杂交，包括预杂交和杂交； （6）杂交结果的检测。 Southern 杂交null基本实验步骤：Migrationhybridizationnull一、待测核酸样品制备： 从待检测组织样品提取DNA或RNA。（基因克隆、PCR） 用限制性内切酶消化以产生特定长度的片段，然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。 基因组DNA酶切nullprobe：带有可检测标记的已知DNA或RNA片段，用于检测待测样品中的靶核酸序列。 核酸探针的类型 核酸探针的标记方法 核酸探针的检测 二、核酸探针：null按分子大小分：寡核苷酸探针（常为18-30bp） 长链探针（双链探针、单链探针）核酸探针的类型双链探针： 基因组DNA探针：由基因组文库筛选…标记 cDNA探针：由cDNA文库筛选…标记 经RT- PCR法生成，mRNA → cDNA链→PCR扩增 单链探针：包括单链RNA探针和单链DNA探针。 探针所携带的标记物应具备的条件：探针所携带的标记物应具备的条件：标记物与探针结合后应不影响探针分子的主要理化特性，特别是对杂交反应的特异性和杂交体的稳定性。 标记探针的检测方法简便、省时、准确可靠、重复性好、灵敏度高。 稳定性好、环境污染少、价廉。 常用的探针标记物：常用的探针标记物：放射性同位素： 3H、32P、35S、125I等 优点：高特异性，高灵敏度 缺点：存在放射性污染，半衰期短 非放射性同位素： 生物素，地高辛、荧光素等。 常用的探针标记法：常用的探针标记法： （1）化学标记法：光敏生物素标记法强光10-20分钟，光敏基团与核酸探针的磷酸基团 以共价键结合。null（2）酶促标记法： 将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的 方法将标记物掺入到探针分子上。 切刻平移法、随机引物法、末端标记法等生物素化核苷酸null（1）切刻平移法 （nicktranslation） 由DNA酶Ⅰ和大肠 杆菌DNA聚合酶Ⅰ 共同完成。DNA酶Ⅰ：在双链 DNA上随机打开若 干个单链切口，产 生3’-OH端大肠杆菌DNA聚合 酶Ⅰ：5’→3’DNA聚 合酶活性； 5’→3’ 外切核酸酶活性null随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶ⅠKlenow片段： 5’→3’DNA聚合酶活性 弱3’→5’外切核酸酶活性 无5’→3’外切核酸酶活性（2）随机引物法（random priming）nullDNA聚合酶ⅠKlenow片段标记法 T4 DNA聚合酶标记法 末端脱氧核苷酸转移酶标记法 T4多核苷酸激酶标记法 （3）探针的末端标记：在5’或3’端通过酶促反应加上标记物 酶切T4DNA聚合酶标记法T4DNA聚合酶标记法3’→5’外切核酸酶活性5’→3’DNA聚合酶活性 null末端脱氧核苷酸转移酶标记法T4多核苷酸激酶标记法T4多核苷酸激酶标记法null核酸探针检测方法同位素标记探针：放射自显影检测杂交信号 放射自显影是指利用放射线在x线片的成影作用来检测杂交信号。 暗室、暗盒内，-70℃曝光； 暗室中取出X线片，显影、定影，即可在X线片上读出杂交带。null非放射性标记探针：偶联反应+显色反应Dig：半抗原，可通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联Dig-DNA探针 + 抗Dig抗体-碱性磷酸酶（AP） 或辣根过氧化物酶（HRP） + 底物 ：BCIP+NBT 蓝紫色 或 DAB 红棕色； TMB 蓝色 null 核酸分子杂交 ↓ 固相杂交 液相杂交 膜上印迹杂交 核酸原位杂交 核酸分子杂交的分类核酸分子杂交技术一、印迹杂交一、印迹杂交 印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定的 固相支持物上的方法。 指将待测核酸序列结合到一定的支持物上， 然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。null DNA或RNA ↓ 电泳分离核酸片段 ↓ 转移至固相支持物（印迹技术）** ↓ 杂交 ↓ 洗去未杂交探针 ↓ 杂交信号检测固相支持物的选择固相支持物的选择良好的固相支持物应具备的条件： 具有较强的结合核酸分子的能力（>10μg/cm2） 与核酸分子结合后不影响其与探针分子的杂交反应 与核酸分子结合牢固 非特异性吸附少 具有良好的机械性，柔软性好、韧性强，便于操作 常用的固相支持物 硝酸纤维膜、尼龙膜、PVDF膜等null 1、硝酸纤维膜： ①是目前使用最多的固相支持物，对单链DNA具有较强的吸附作用， RNA经过一些特殊的变性剂处理后，也易于结合到此膜上 ②在高盐浓度下，其结合能力80-100μg/cm2 ③吸附的单链DNA或RNA在真空干烤后依靠疏水作用而吸附在膜上 优点 杂交信号本底较低 缺点 ①由于是靠疏水作用结合DNA，这种结合并不十分牢固，随杂交 及洗膜过程DNA会慢慢脱离硝纤膜而使杂交信号下降 ②对小分子量的DNA片段（<200bp）结合能力不强 ③靠高盐与DNA结合，故不适用于电转移 ④易破碎 null2、尼龙膜： ①对单链和双链DNA及RNA的结合能力达到350-500μg/cm2。 ②对小分子量的核酸片段也有较强的结合能力。 ③ 真空干烤或紫外交联，核酸与膜以共价结合。 优点 吸附力强（共价结合）、机械性能好（不易破碎、可重复使用） 缺点 对蛋白具有高度亲和力，不宜使用于非同位素探针； 杂交信号的本底也高。null3、PVDF膜（聚二氟乙烯）： 与尼龙膜相似，其疏水性碳氟化合物可加强与核酸中磷酸成分的离子反应，而比尼龙膜结合力更强，且在预杂交中很容易被封闭。杂交本底低，结实耐用，可多次杂交。null印迹方法（Mechanics of transfer）毛细管印迹法（Capillary） 真空转移法（Vacuum） 电转移法（Electrophoretic） Capillary Blotting (upward) no special equipment required! Capillary Blotting (upward) no special equipment required! 1975年 E. Southern Southern DNA 印迹转移技术DNA片段<1kb，1小时 DNA片段>15kb，18小时nullElectrophoretic blotting不宜用硝酸纤维素膜一般2~3小时， 最多6 ~8小时Vacuum blottingVacuum blotting30~60分钟null印迹类型 Southern印迹杂交 Northern印迹杂交 斑点及狭缝印迹杂交 反向斑点杂交 菌落或噬菌斑杂交nullPaper TowelsSouthern Blotting hybridizationtissueSDSProt KPhenol ChloroSpin提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性、转移到NC膜与DNA或RNA探针杂交放射自显影Prehyb/Hybridization/RinsesPrehyb/Hybridization/Rinsesnull 检测靶分子为DNA, 检测靶分子是否 含有目的基因。 DNA指纹图谱 Southern印迹杂交的应用： nullNorthern blotting hybridization 检测靶分子为RNARNA极易被RNase 降解null与Southern blotting hybridization不同之处： 不需要限制性核酸内切酶酶切。 变性方法不是碱变性，而是采用聚乙二醛和二甲基亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞等方法。 应用： 检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。 比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。Northern blotting hybridizationnull pancreas kidney skeletal liver lung placenta brain heartmuscleGEF mRNANorthern blotting hybridizationnull优点：简单、迅速（直接点样）； 可在同一张膜上进行多个样品的检测； 应用：同一种样品经不同倍数的稀释, 可以得到半定量的结果； 核酸粗提样品的检测效果也较好。Dot and slot blotting hybridizatio 将变性后的DNA或RNA直接点样与膜上Reverse dot hybridizationReverse dot hybridization 直接将不同的探针点印并固定在膜上，再将待测的DNA样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判断DNA是否含有这些探针的同源序列。GeneChip Probe ArrayGeneChip Probe Array1995年 斯坦福大学Schena M、Brown PO DNA chip DNA microarray 将各种“探针”固定在基质上，用于检测各种标记的待测样品中与探针互补的核酸的变化。DNA chipDNA chip “探针”：原位合成寡核苷酸序列 DNA或cDNA序列 “样品”：标记了荧光或同位素待测靶核酸 （DNA、cDNA、RNA）常用基质：载玻片、尼龙膜nullnullPlatform for GeneChip Probe Arrays 自动芯片洗涤工作站 高分辨率的芯片扫描仪 智能化的分析软件 预制的基因芯片 芯片滚动杂交仪null杂交实验null标记的cRNA片断 杂交 （16hour）数据分析 扫 描 洗脱 染色GeneChip的操作流程Colony or phage hybridization 从重组DNA文库中筛选阳性克隆 Colony or phage hybridization 从重组DNA文库中筛选阳性克隆 二、核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）二、核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ） 用标记的已知核酸序列为探针，与细胞涂片或组织切片 中核酸进行杂交检测的方法。 每张标本所用杂交液较少，20~100μl，为了避免杂 交 液蒸发后造成杂交液浓缩，需使用密闭的湿盒。 在组织或细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量。null 探针与分裂中期染色体DNA杂交，研究特定核酸序列 在染色体中的精确定位； 探针与细胞内RNA进行杂交，观察该组织细胞中特定 基因的表达水平； 用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织细胞进行 杂交，确定有无该病原体的感染。 应用：null The result of FISH The digoxigenin-labeled probe was visualized with anti-DIG-rhodamine（red） The biotin-labeled probe, with avidin-FITC（green）核 酸 杂 交 分 类 表核 酸 杂 交 分 类 表斑点及狭缝印迹杂交 null医学分子生物学实验技术 2002年 药立波主编 人民卫生出版社 2. 分子生物学基础与临床 2000年 陈丙莺主编 东南大学出版社 课件主要参考书null分子克隆实验指南（上、下） 第三版 2002年 [美] J. 萨母布鲁克等 科学出版社 2. 精编分子生物学实验指南 1998年 [美] F.奥斯伯等 科学出版社 现代分子生物学实验技术 第二版 1999年 卢圣栋主编 中国协和医科大学出版社主要参考书nullnullNH2 Adenine GuanineThymine CytosinePyrimidinePurineBasesUracilP288nullnull基因组DNA文库null 　　1. 紫外吸收法 测定核酸溶液OD260nm 、OD280nm DNA 溶液：OD260 /OD280 = 1.8 RNA 溶液：OD260 /OD280 = 2.0 OD260nm = 1, 50μg/ml dsDNA 33μg/ml ssDNA 40μg/ml ssRNA null2. 电泳法 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp303bpDNA markersampleSnake bile sampleprehybridizationprehybridization概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前用 封闭物将这些非特异性位点封闭。这一杂交前的处理过程称为预杂交。 常用的封闭物： （1）变性的非特异性DNA，如鲑鱼精DNA、小牛胸腺DNA， 又称为覆盖DNA。 （2）高分子化合物：Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、 小牛血清白蛋白、聚蔗糖400 脱脂奶粉 变性（denaturation） 复性（renaturation） 预杂交（prehybridization）杂交（hybridization）